PLoS ONE: MicroRNA-206: Effectieve Remming van maagkanker Progression door de c-Met Pathway

Abstract

MicroRNAs zijn endogene korte keten nucleotide RNAs dat gen functie te reguleren door directe binding van doelwit mRNA. In dit onderzoek onderzochten we de effecten van microRNA-206 (miR-206) op de ontwikkeling van maagkanker. miR-206 werd eerst bevestigd worden downgereguleerd in maagkanker monsters. Omgekeerd opregulatie van c-Met werd bevestigd in weefselmonsters van menselijke maagkanker, zijn niveau omgekeerd gecorreleerd met miR-206 expressie. Introductie van miR-206 remde cellulaire proliferatie door het induceren G1 celcyclus, alsmede migratie en invasie. Bovendien belangrijke proliferatie en /of migratie gerelateerde moleculen zoals c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt en p-ERK werden bevestigd wordt neerwaarts gereguleerd door Western blotanalyse. Targeting van c-Met ook rechtstreeks getroffen AGS cel proliferatie, migratie en invasie. In vivo
, miR-206 tot expressie tumorcellen ook weergegeven groeivertraging in vergelijking met onaangetast tumorcellen. Onze resultaten toonden aan dat miR-206 onderdrukt c-Met expressie bij maagkanker en kan functioneren als een krachtige tumor suppressor in c-Met overexpressie tumoren. Remming van miR-206 functie kunnen bijdragen tot afwijkende proliferatie en cel migratie, waardoor maag tumorigenese

Citation:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) MicroRNA-206: Effectieve Remming van maagkanker Progression door de c-Met Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10.1371 /journal.pone.0128751

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medische Universiteit, JAPAN

Ontvangen: 4 februari 2015; Aanvaard: 1 mei 2015; Gepubliceerd: 17 juli 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Dit werk werd ondersteund, gedeeltelijk, door de National Natural Science Foundation of China Grant 81100671 (DY), provincie Zhejiang Natural Science Foundation of China Grant Y2110609 ( DY), en Wenzhou Science & Technology Bureau Grant Y20080096 (DY). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de wereld [1]. De morbiditeit en mortaliteit is bijzonder uitgesproken in Aziatische landen door verschillende invloeden [1]. Sinds de presentatie wordt vaak geassocieerd met gevorderde ziekte, is er een dringende behoefte aan vooruitgang in de opsporing en uiteindelijk het beheer ervan. Op dit moment is het begrip van microRNAs (miRNAs) op het beïnvloeden van de maag de vorming van kanker die zich in een snel tempo.

Sinds de eerste beschrijving van miRNA in de nematode C
. elegans
terug in 1993, de impact van deze kleine niet-coderende RNA's heeft overstegen meerdere vestigingen van de moleculaire biologie [2]. MiRNAs zeer weefselspecifiek biomarkers met de potentie om te passen en om resident weefsel. Omdat overexpressie en onderexpressie zijn beide geassocieerd met het ontstaan ​​van tumoren [3], hun rol als oncogenen en tumorsuppressorgenen zijn zowel gevestigde [4, 5]. In de afgelopen jaren, is hun invloed op de ontwikkeling en detectie van solide orgaan tumoren waaronder maagkanker langzaam wordt opgehelderd. Er zijn al verschillende miRNAs die in de maagkanker anti-apoptotische mechanisme zoals miR-21 en miR-148a [6, 7]. Andere paden invloed van miRNAs omvatten celcyclus bestaat uit miR-222/221, miR-106b /93/25 en miR-24 [6, 7].

Een andere veelbelovende nieuwe miRNAs voor orgaantransplantatie tumoren omvat miR-206 [8]. Deze bijzondere miRNA behoort tot een groep van "myomiRs" die betrokken is in de skeletspier ontwikkeling [9]. Die geassocieerd met talrijke andere ziekten zoals hartziekten, chronische obstructieve longziekte en Alzheimer, zijn rol bij oncogenese ontvangen toetsing recenter zoals rhabdomyosarcoom, longkanker, colorectale kanker, schwannoma, en maagkanker [8, 9]. Hoewel verhoogd in een aantal vormen van kanker waaronder ovarium en Ziekte van Waldenström wordt miR-206 meestal onderdrukt bij orgaantransplantaties tumoren [9]. miR-206 is eerder aangetoond maag kankercelproliferatie remmen gedeeltelijk door het onderdrukken van cycline D2 [10]. In dit onderzoek hebben we gericht op de rol van miR-206 in maagkanker oncogenese door c-Met route, die traditioneel een invloedrijke signaalroute voor oncogenese is in een verscheidenheid aan tumoren [11]. c-Met is voorspeld en getoond aan het doelwit-gen van meerdere miRNAs waaronder miR-206 [9, 12] zijn.

Resultaten

Onderdrukking van miR-206 heeft geleid tot verhoogde c-Met expressie in maagkanker

Real-time RT-PCR analyse werd uitgevoerd om de expressie van miR-206 te detecteren in 40 maagkanker monsters en normale weefsels. miR-206 levels in de meeste weefselmonsters van maag tumor (34/40) bleken significant lager dan normale weefsels (figuur 1A) te zijn. miR-206 expressie is omgekeerd evenredig met het niveau van c-Met waargenomen in tumormonsters (figuur 1B). Meest tumormonsters, met verminderde miR-206 expressie, bleek hoog percentage (> 50%) van c-Met kleuring. Omgekeerd, tumoren met een normale expressie van miR-206 bleek zeer zwak of negatief c-Met-expressie.

miR-206 geïnduceerde G1 arrestatie en remden celproliferatie, migratie en invasie van AGS maagkanker cellen

Als miR-206 expressie werd verminderd bij maagkanker monsters wilden we bepalen of de introductie van miR-206 elk biologisch effect op cellen AGS gehad. AGS cellen getransfecteerd met de miR-206 molecuul een inhibitie van de celgroei vergeleken met de negatieve controle gebaseerd op de MTS assay (figuur 2A). FACS analyse van de cellen toonde G1 celcyclus (Fig S1). Het aantal kolonies werd gereduceerd met transfectie van miR-206 (Fig S2).

miR-206 kan migratie en invasie van AGS cellen (Figuur 2B en figuur S3) remmen. Een drastische vermindering van migratie naar de onderste kamers werd waargenomen in miR-206 getransfecteerde AGS-cellen (86 ± 15 versus 165 ± 16 in AGS cellen, P Restaurant < 0,01, n = 3). Bovendien, cellen die met miR-206 bleek dat HGF-geïnduceerde invasieve ook aanzienlijk werd gehinderd volgende miR-206 transfectie (57 ± 12 versus 116 ± 14 in AGS cellen, P Restaurant < 0,01, n = 3).

miR-206 gedownreguleerd c-Met expressie en andere celcyclus verwante proteïnen

We hebben eerder geïdentificeerd c-Met als direct doelwit van miR-206 [9]. Western blot analyse bevestigde dat c-Met expressie werd verminderd door miR-206 transfectie in cellen AGS (figuur 3). Tegelijkertijd ectopische miR-206 ook neerwaarts gereguleerd de expressie van CDK4, p-Rb, p-Akt en p-ERK.

negatieve regulatie van c-Met remde maag proliferatie van kankercellen, migratie en invasie

Hierna c-met specifieke siRNA werd eerst gebruikt om de expressie van c-met in AGS cellen (figuur S4) te verlagen. MTS assays werden uitgevoerd om de proliferatie van cellen te detecteren. AGS cellen getransfecteerd met c-Met siRNA vertoonden verminderde celgroei vergeleken met de negatieve controle cellen (figuur 4A; 25,10 ± 3,81% afname). Zowel HGF-geïnduceerde migratie en invasie werden afgenomen bij het vergelijken van c-Met siRNA getransfecteerde cellen om negatieve controle getransfecteerde cellen. Zoals aangegeven in figuur 4B en S5 figuur, afname van migratie (88 ± 10 versus 155 ± 15, P < 0,01, n = 3) en invasie (72 ± 7 vs. 126 ± 12, P < 0,01, n = 3) waren beiden statistisch significant.

Invoering van miR-206 onderdrukt tumorgroei in vivo

vervolgens onderzochten we of overexpressie van miR-206 tumorgroei kan onderdrukken in vivo
. Na 8 weken, de gemiddelde tumor volumes aanzienlijk lager uit cellen geïnfecteerd met lentivirus expressie miR-206 in vergelijking met controle (Figuur 5).

Discussie

Maagkanker is gebleven een belangrijk gezondheidsprobleem zorg lasten over de hele wereld, ondanks jaren van onderzoek [1]. Volgens de WHO, blijft maagkanker een van de top kanker etiologies met een hoge sterfte [1]. Zoals met andere vaste tumoren orgaan is steeds duidelijker dat beter begrip van oncogenese tumor moet de prognose van deze patiënten. Omdat voor in Azië, zijn nieuwe data over de rol van miRNAs voor de ontwikkeling of onderdrukking van maagkanker [6].

miRNAs zijn dubbele functie qua maag kankerontwikkeling [6, 13]. Sommige miRNAs zijn tumor suppressors en anderen zijn oncomiRs [6]. Ueda et al. vonden 22 miRNAs opgereguleerd en 13 neerwaarts gereguleerd in het plasma van patiënten met maagkanker [13]. Doelen die worden onderzocht bij maagkanker omvatten regulatoren van p16, via miR-24 en p21 met miR-222/221 en miR-106b /93/25 [6]. Anderen, zoals miR-21, kan worden opgereguleerd in maximaal 92% van maagkanker weefselmonsters [14]. Kandidaten die in maagkanker dienen als tumor suppressors omvatten miR-181b, miR-101 en miR-486 [6]. Zo wordt miR-101 dacht te richten EZH2, Cox-2, Mcl-1 en Fos [15]. miR-486 wordt gedacht dat OLFM4 waardoor mogelijkerwijs apoptose beïnvloeden downstream [16].

is vastgesteld dat de meeste miRNAs dienen als tumor suppressors, onderzochten we de c-Met route bij maagkanker. Bij het bestuderen van de c-Met route voor rhadbomyosarcoma, vonden we het belang van deze route in sarcoom [9]. c-Met is bekend dat verstoord bij maagkanker [11, 17-19]. De MET proto-oncogen codeert voor een eiwit dat bekend staat als hepatocyte groeifactor (HGF) receptor die tyrosinekinase-activiteit [18] bezit. We vinden normaal gesproken alleen tot uiting in stamcellen maar ook gezien de disregulatie bij oncogenese [18]. In deze studie, waren we in staat om te bevestigen dat c-Met aanzienlijk betrokken bij maagkanker en haar rol als miR-206 doelwit is cruciaal in oncogenese.

voortgang van de celcyclus wordt ontregeld bij maagkanker. Op basis van eerdere rapporten, cycline D2 verhoogd bij maagkanker wanneer miR-206 wordt beïnvloed [10]. miR-206 is aangetoond dat het een krachtige prognostische marker [10] zijn. De downregulatie wordt geassocieerd met een kortere totale overleving. Restauratie van miR-206 leidt tot G0 /G1 celcyclus, bevestiging van haar rol als een tumor suppressor. Ons werk toonde ook celcyclus ontregeling met CDK4 en gefosforyleerd-Rb wordt aangetast. CDK4 is een lid van de cycline afhankelijke kinase familie ser /thr proteïnekinaseactiviteit. Het leidt tot G1 fase progressie. Bovendien, het kinase leidt tot de fosforylering van Rb, een tumor suppressor betrokken bij celcyclus progressie.

Hoewel soortgelijke bevindingen zijn in maag-, eierstok- en borstkanker bevestigd, de rol van miR-206 lijkt een tegengesteld effect op dikke darmkanker [6, 20] hebben. Een inverse correlatie gezien tussen miR-206 en KLF4 in een panel van humane colon kanker [20]. KLF4, die oncogene's van andere kankers zoals borst-, huid en longen, functioneert als een tumor suppressor colonkanker [20] heeft. De promotor hyper-gemethyleerd met verhoogde niveaus van miR-206 leidt tot downregulatie van KLF4 [20]. Deze bevindingen geven aan dat miR-206 kon niet gelijktijdig functioneert in alle epitheelcellen, die ontkent de one size fits all benadering chemotherapeutica.

In de onderhavige studie hebben we een mechanisme voor de regulering van c-Met genexpressie geïdentificeerd door middel van miR-206 bij maagkanker. c-Met overexpressie na miR-206 downregulatie lijkt de gemeenschappelijke etiologie voor de pathogenese van maagkanker in de meeste monsters in deze studie onderzocht worden. Samengevat, hebben we aangetoond dat miR-206 negatief moduleert de c-Met signaling pathway betrokken bij celproliferatie en celmigratie. Onze studies hopelijk hebben belangrijke klinische gevolgen bij de behandeling van maagkanker. miR-206 is een kandidaat voor zowel immunohistochemische detectie van kleine tumoren en mogelijk doelwit voor biologische therapieën.

Materialen en methoden

Cell cultuur

De menselijke maagkanker cellijn, AGS, gekocht bij ATCC (Manassas, VA), werd gekweekt in Ham's F-12 Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) aangevuld met 10% foetaal bovine serum. (FBS; Hyclone, Logan, UT)

Ethics statement

Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen en de goedkeuring van de Wenzhou Medische Universiteit Animal Care en gebruik Comite uitgevoerd (Permit Nummer: WZMCOPT-043011). Veertig maagtumor monsters en normale donor maag weefsels werden verkregen uit de tweede Affiliated Hospital van Wenzhou Medical University (Wenzhou, China). Monstername werd goedgekeurd door de Wenzhou Medical University Ethische Commissie voor onderzoek met mensen, en schriftelijke toestemming is verkregen van elk geval. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de nationale wetgeving.

Kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de maag tumor samples van de mens en normale controles met Trizol reagens (Invitrogen). 10 ng totaal RNA werd gebruikt voor cDNA synthese door de Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) en miR-206 expressieniveau werd gekwantificeerd door de Taqman Assay MicroRNA (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR werd uitgevoerd met het Applied Biosystems VIIA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Immunohistochemische kleuring van c-Met

Delen van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde menselijke maag tumor specimens (5 pm) werden gemaakt en vervolgens de-paraffinized met xyleen en ethanol. Plaatjes werden behandeld met 0,3% waterstofperoxide en daarna gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met c-Met antilichaam bij 1: 300 verdunning (CST, Beverly, MA). Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met de EnVision HRP /DAB detectiesysteem (Dako, Glostrup, Denemarken).

celproliferatie assay

AGS cellen werden uitgeplaat met 2000 cellen per putje in 96-putjesplaten ( Costar, High Wycombe, UK) voor elke transfectie. Transfecties uitgevoerd met het reagens (Lipofectamine RNAiMAX, Invitrogen), in triplo. Voor elk putje, 50 nm miR-206 bootst molecuul (Ambion, Austin, TX), of een negatieve controle (Ambion) transfectie werd gebruikt. Na 72 uur kweken werd celproliferatie vastgesteld door MTS assay (CellTiter 96 Aqueous, Promega, Madison, WI).

Transwell migratie assays

24 uur na transfectie AGS cellen werden geoogst door trypsine en eenmaal gewassen met D-Hanks oplossing (Invitrogen). Celmigratie of invasie, 8 urn poriegrootte cultuur of Matrigel inserts (Transwell; Costar) te meten werden in de putjes van 24-putjes. In de onderste kamer, 400 pl F-12 bevattende 10% FBS en 20 ng /ml HGF werd toegevoegd. Daarna werden 5x10 ^{4 cellen toegevoegd aan de bovenste kamer. Na 20 uur incubatie werden de cellen die door de poriën waren gemigreerd gekleurd met kristalviolet en bekeken onder de microscoop (Zeiss, Oberkochen, Duitsland) met een 20X objectief.}

Western blotanalyse

AGS cellen (1x10 ^{5) werden uitgezaaid in 6-putjesplaten en gekweekt in F-12 gedurende 24 uur voorafgaande aan transfectie. 72 uur na transfectie werden de cellen gewassen met koude PBS en onderworpen aan een lysisbuffer (35 mM Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /l natriumdodecylsulfaat [SDS], 100 mM dithiothreitol). Eiwitlysaten (20 ug elk) werden gescheiden onder toepassing van 8% SDS-polyacrylamide gelelektroforese, vervolgens elektrisch overgebracht op nitrocellulose filtermembranen. De membranen werden geblokkeerd met een buffer die 5% magere melk in PBS met 0,05% Tween-20 gedurende 2 uur en overnacht geïncubeerd met antilichaam bij 4 ° C. Na een tweede wasbeurt met PBS dat 0,05% Tween-20 werden de membranen geïncubeerd met peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (Millipore, Darmstadt, Duitsland) en ontwikkeld met versterkte chemiluminescentie detectie kit (Pierce, Rockford, IL). GAPDH werd gebruikt als beladingscontrole. Antilichamen voor CDK4, p-Rb, ERK, Akt, ERK-p, p-Akt, c-Met en GAPDH waren van Cell Signaling Technology (Beverly, MA).}

SiRNA assays

c-met-specifiek siRNA (Ambion) en negatieve controle siRNA (Ambion) werden gebruikt om c-met expressie downregulate in AGS cellen. 50 nM c-Met-specifiek siRNA of negatieve controle siRNA werd getransfecteerd in cellen met Lipofectamine AGS RNAiMAX. MTS assay werd 72 uur na transfectie uitgevoerd, terwijl Transwell en Matrigel werden uitgevoerd 24 uur na transfectie zoals hierboven beschreven.

In vivo test op tumorgroei

De pre-microRNA expressie constructen Lenti-miR-206 en pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP controle vector werden gekocht van System Biosciences (Mountain View, CA). AGS-cellen werden geïnfecteerd met lentivirus expressie miR-206 of negatieve controle. Vrouwelijk naakt muizen, 6 weken oud, werden geïnoculeerd met cellen AGS (8x10 ^{6) expressie miR-206 of negatieve controles in hun flanken en vervolgens gedood na 8 weken. Tumorgrootte werd gemeten en het volume werd berekend met de formule: ( L
x W
2) x 0,5, ( L
, lengte; w
, breedte), volgens de werkwijze eerder beschreven [21]. Alle studies en procedures werden goedgekeurd door de Wenzhou Medische Universiteit Animal Care en gebruik Comite.}

Statistische analyse

Alle gegevens werden getoond als de gemiddelde ± SEM. Resultaten zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM van de resultaten van drie exemplaren in één experiment resultaten. Resultaten vormen die verkregen in drie afzonderlijke experimenten. Verschillen tussen experimentele groepen en controlegroepen werden geanalyseerd met behulp van de Student's t
-test. Statistische significantie werd aanvaard bij P
< 0.05.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. FACS analyse van cellen getransfecteerd met AGS miR-206.
AGS cellen werden verzameld 48 uur na transfectie met miR-206 of NC, gekleurd met propidiumjodide en geanalyseerd door flowcytometrie. Tienduizend cellen werden bij elk monster. De meest representatieve resultaten in drie onafhankelijke experimenten worden afgeschilderd
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s001
(TIF)
S2 Afb. Kolonievorming assay.
AGS cellen die met miR-206 of NC werden uitgezaaid met lage dichtheid. Na 7 dagen werd kolonievorming bepaald door kleuring met kristalviolet. Typische resultaten in drie onafhankelijke experimenten worden getoond
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s002
(TIF)
S3 Fig. De effecten van miR-206 op AGS cellen werden onderzocht met Transwell en Matrigel assays.
Het aantal cellen dat (boven) via kweekinsertie poriën of gemigreerd waren binnengedrongen door de Matrigel inzetstuk poriën (beneden) werd gefotografeerd met behulp van een 20X microscoop objectief
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s003
(TIF)
S4 Fig. . Downregulatie van c-Met door siRNA
Western blot analyse werd uitgevoerd om onderdrukking van c-Met expressie te bevestigen na lipofectamine transfectie van AGS cellen met hetzij c-Met siRNA of een negatieve controle (NC)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004
(TIF)
S5 Fig. Het effect van c-Met siRNA op AGS cellen werden onderzocht met Transwell en Matrigel assays.
Het aantal cellen dat (boven) via kweekinsertie poriën of gemigreerd waren binnengedrongen door de Matrigel inzetstuk poriën (beneden) werd gefotografeerd met behulp een 20X microscoop objectief
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s005
(TIF)

• PLoS ONE: exosomaal miRNAs van Peritoneum spoelvloeistof als potentiële prognostische Biomarkers van peritoneale metastasen bij maagkanker
• PLoS ONE: Verhoging van de gevolgen van straling door Ursolzuur in BGC-823 Human Darmkanker Gastric Cancer Cell Line