PLO ON: mikrornk-206: djelotvornom inhibicijom želučanog raka progresiju kroz c-Met Put

Sažetak pregled

mikroRNA su endogeni kratkog lanca nukleotida RNA koji reguliraju funkciju gena koje izravno vezanje ciljnih mRNA. U ovoj studiji ispitivali smo učinak mikrornk-206 (Mir-206) na razvoj karcinoma želuca. miR-206 najprije je potvrđeno da se regulirani u želučanim uzoraka raka. Obratno, regulaciju c-Met potvrđeno u uzorcima tkiva humanog karcinoma želuca, s razinom obrnutoj su korelaciji s miR-206 ekspresiju. Uvođenje Mir-206 inhibiran staničnoj proliferaciji zbog izazivanja G1 staničnog ciklusa, kao i migraciju i invaziju. Osim toga, važna proliferacije i /ili migracije u vezi molekule kao što su c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt i p-ERK su potvrđeni za regulirani pomoću Western blot analize. Ciljanje c-Met i izravno utječe na AGS proliferaciju stanica, migraciju i invaziju. In vivo pregled, Mir-206 koje eksprimiraju tumorske stanice također se prikazuju kašnjenje rast u odnosu na nepromijenjenih tumorskih stanica. Naši rezultati su pokazali da je Mir-206 potisnuta c-Met izraz u rak želuca i može funkcionirati kao moćan tumor supresor u c-Met ekspresijom tumora. Inhibicija Mir-206 funkcija može doprinijeti širenju abcrantnog i migraciju stanica, što dovodi do razvoja raka želuca pregled

Izvor:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) mikrornk-206: djelotvornom inhibicijom želučanog raka progresiju kroz c-Met puta. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751 pregled

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medicinski fakultet, JAPAN pregled

Primljeno: 4. veljače 2015. godine; Prihvaćeno: 1. svibanj 2015; Objavljeno: 17. srpnja 2015 pregled

Copyright: © 2015 Zheng i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan, dijelom, Nacionalna zaklada prirodoslovni Kine Grant 81100671 (DY), Zhejiang Provincial zaklada Natural Science of China Grant Y2110609 ( DY) i Wenzhou Science & Tehnologija zavod Grant Y20080096 (DY). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok raka se odnose na smrt u svijetu [1]. Njegova pobola i smrtnosti, posebno je naglašena u azijskim zemljama zbog raznih utjecaja. [1] Budući da njen izgled je često povezana s uznapredovalom bolesti, postoji hitna potreba za napretkom u svom otkrivanju i na kraju svoje postupke. Trenutačno, razumijevanje mikroRNA (miRNAs) na utječe na stvaranje raka želuca se događa u brzom tempu. Pregled

Od prvog opisa Mirne na nematode C pregled. elegans pregled davne 1993. godine, utjecaj tih malih RNA non-coding je nadišao više grane molekularne biologije [2]. MiRNAs su vrlo tkiva specifična biomarkeri sa potencijalom mijenjaju i transformiraju stanovnik tkiva. Budući da prekomjerna ekspresija i pod-izražavanja, povezani su s tumorigenezi [3], njihove uloge kao onkogena i tumor supresorski geni su oba dobro utemeljena [4, 5]. Tijekom posljednjih nekoliko godina, njihov utjecaj na razvoj i otkrivanje solidnih tumora organa, uključujući rak želuca polako razjašnjen. Postoji već nekoliko miRNAs identificirani u raka želuca protiv apoptoze mehanizam kao što je Mir-21 i Mir-148a [6, 7]. Ostali putevi su utjecali miRNAs su progresiju staničnog ciklusa sastoji od Mir-222/221, Mir-106b /93/25 i Mir-24 [6, 7]. Pregled

Jedan od ostalih obećavajući novi miRNAs za solidnih organa tumori uključuje Mir-206 [8]. Ovaj Mirna pripada skupini "myomiRs" koji je uključen u skeletnim mišićima razvoj [9]. Što je povezano s brojnim drugim bolestima, uključujući bolesti srca, kronične opstruktivne plućne bolesti i Alzheimerove bolesti, njegova uloga u onkogenezom dobio ispitivanju novije uključujući rabdomiosarkom, raka pluća, raka debelog crijeva, švanom, i želučani rak [8, 9]. Iako povišeni u nekoliko vrsta raka uključujući rak jajnika i Waldenstromova makroglobulinemije, miR-206 uglavnom se potiskuje u solidnih tumora organa [9]. miR-206 Prethodno je pokazano da inhibira želučanu proliferacije raka djelomično potiskivanjem ciklin D2 [10]. U ovom istraživanju, koncentrirani smo na ulogu Mir-206 u želučanom onkogcnczom raka kroz c-Met put, koji je tradicionalno bio utjecajan signalni put za onkogcnczom u različitim tumorima [11]. c-Met je predvidio i pokazalo se da je ciljni gen od više miRNAs uključujući Mir-206 [9, 12]. pregled

Rezultati

Suzbijanje Mir-206 je dovelo do povećane c-Met izraz u rak želuca pregled

real-time RT-PCR analiza provedena je za otkrivanje ekspresiju Mir-206 u 40 želučanih uzoraka raka i normalnog tkiva. Razine miR-206 u većini uzoraka tkiva želuca tumora (34/40), nađeno je da su znatno niže od normalnim tkivima (Slika 1A). miR-206 ekspresija obrnuto je povezan s razinom c-Met promatrana u uzorcima tumora (Slika 1B). Većina uzorci tumora, sa smanjenim miR-206 ekspresije, pokazuje visok postotak (> 50%) c-Met bojanja. S druge strane, tumori s normalnom ekspresijom Mir-206 pokazao vrlo slabo ili negativan c-Met izraz. Pregled

Mir-206 inducirana G1 uhićenje i proliferacija inhibiran stanice, migracija i invazija AGS stanica raka želuca pregled

Kao Mir-206 ekspresija je smanjena u želučanim uzoraka raka, tražili smo utvrditi je li uvođenje Mir-206 je bilo koji biološki učinak na AGS stanica. AGS transfektiranih s miR-206 molekula pokazalo je sprečavanje rasta stanica u odnosu na negativne kontrole na temelju MTS analizom (Slika 2A). FACS analiza stanica pokazala G1 staničnog ciklusa (S1 sl). Broj kolonija također je smanjena sa transfekcijom Mir-206 (S2 sl). Pregled

Mir-206 može spriječiti migraciju i invaziju AGS stanica (slika 2b i S3 slici). Dramatična smanjenje migracije prema niže komore je zabilježena u miR-206 transficiranim AGS stanica (86 ± 15 naspram 165 ± 16 u AGS stanicama P pregled < 0,01, n = 3). Pored toga, stanice su transfektirane s Mir-206 je pokazao da HGF-inducirane invazivnost također znatno otežano sljedeće Mir-206 transfekcije (57 ± 12 naspram 116 ± 14 u AGS stanicama P pregled < 0,01, n = 3). pregled

Mir-206 regulirani c-Met izraz i proteini drugi stanični ciklus vezane

Mi smo ranije identificirali c-Met kao izravna meta Mir-206 [9]. Western blot analiza je potvrdila da c-Met izraz je smanjen za Mir-206 transfekcijom u AGS stanica (slika 3). Istovremeno, ektopično miR-206 također podregulirani ekspresiju CDK4, p-Rb, p-Akt i p-ERK. Pregled

podreguliranje c-Met inhibirala proliferacija raka želuca stanica, migraciju i invaziju pregled

Zatim, c-Met specifične siRNA je prvi put korišten za smanjenje ekspresije c-met u AGS stanica (S4 sl). MTS testovi su izvedeni detektirati proliferaciju stanica. AGS stanice transficirane s c-Met siRNA pokazali smanjenu rast stanica u usporedbi s negativnim kontrolnim stanicama (Slika 4A, 25,10 ± 3,81% smanjenje). I HGF-inducirane migracije i invazije su smanjeni kada se uspoređuju c-Met siRNA transfecirane stanice do negativnih kontrolnih transficirana stanica. Kao što je prikazano na slici 4B i S5 slici, smanjenje migracije (88 ± 10 naspram 155 ± 15, P < 0.01, n = 3) i invazije (72 ± 7 vs. 126 ± 12, P < 0.01, n = 3) bili su statistički značajne. pregled

Uvođenje Mir-206 potisnuti rast tumora In vivo

Nakon toga smo istraživali ako pojačanom ekspresijom Mir-206 može potisnuti rast tumora in vivo pregled. Nakon 8 tjedana, prosječne količine tumora su bile značajno niže od stanica zaraženih lentivirus eksprimiraju miR-206, u usporedbi s kontrolom (Slika 5). Pregled

Rasprava pregled

rak želuca ostao značajan zdravstveni briga teret u svijetu, unatoč godinama istraživanja [1]. Prema WHO-u, rak želuca i dalje jedan od najboljih etiologija karcinoma s visokom stopom smrtnosti [1]. Kao i kod ostalih solidnih tumora organa, to je sve jasnije da je bolje razumijevanje tumora onkogcnczom potrebno poboljšati prognozu tih bolesnika. Budući da prevladava u azijskim zemljama, podaci su u nastajanju na ulogu miRNAs na razvoj i suzbijanje želučane raka [6]. Pregled

miRNAs imaju dvojno funkcije u smislu želučane razvoja raka [6, 13]. Neki miRNAs su tumorske prigušivači i ostali su oncomiRs [6]. Ueda et al. pronađeno 22 miRNAs regulira prema gore i 13 regulirani u plazmi bolesnika s rakom želuca [13]. Ciljevi koji su pod istragom u slučaju raka želuca uključuje regulatora p16, putem Mir-24 i p21 kroz Mir-222/221 i Mir-106b /93/25 [6]. Drugi, kao što Mir-21, može biti reguliran u do 92% uzoraka želučane raka tkiva [14]. Kandidati su identificirani u rak želuca koji služi kao tumor smetnji uključuju Mir-181b, Mir-101 i Mir-486 [6]. Na primjer, Mir-101 je mislio da ciljaju EZH2, COX-2, MCL-1 i Fos [15]. Mir-486 je mislio da utječe OLFM4, vjerojatno utjecalo na apoptozu nizvodno [16]. pregled

Nakon što je utvrdila da je većina miRNAs služiti kao tumor smetnji, istražili smo c-Met put kod raka želuca. Proučavajući c-Met put za rhadbomyosarcoma, pronašli smo važnost ovog puta u sarkoma [9]. c-Met je poznato da se dereguliran u želučanom raka [11, 17-19]. MET protoonkogen kodira protein poznat kao faktor rasta hepatocita (HGF), receptor koji posjeduje aktivnost tirozin kinaze [18]. Mi obično nalaze da je izražen samo u matičnim stanicama, ali su također vidjeli svoju deregulacija u onkogcnczom [18]. U ovom istraživanju, bili smo u mogućnosti potvrditi da c-Met značajno je uključen u rak želuca i njegova uloga kao metu Mir-206 je ključno u onkogcnczom. Pregled

napredovanja staničnog ciklusa dereguliran kod raka želuca. Na temelju prethodnih izvješća, ciklin D2 je povišen kod raka želuca, kada je pod utjecajem Mir-206 [10]. miR-206 pokazano je da je potentni prognostički marker [10]. Njegova regulacija povezana s kraćim ukupno preživljenje. Obnova Mir-206 vodi u G0 /G1 staničnog ciklusa, potvrđuje svoju ulogu kao supresor tumora. Naš rad je također pokazala staničnog ciklusa deregulacija s CDK4 i fosforilirani-Rb pogođeni. CDK4 je član ovisne kinaze obitelji ciklin s aktivnošću ser /thr protein kinaze. To dovodi do G1 faze progresije. Osim toga, kinaza dovodi do fosforilacije Rb, što je tumor supresor uključene u napredovanje staničnog ciklusa. Pregled

Iako su slični pronalasci su potvrđeni na želuca, jajnika i dojke, uloga Mir-206 izgleda imati suprotan učinak na rak debelog crijeva [6, 20]. Inverzna korelacija je zabilježeno između Mir-206 i KLF4 u panelu ljudskih karcinoma debelog crijeva [20]. KLF4, koji ima svojstva u onkogene drugih karcinoma, kao što su rak dojke, kože i pluća, djeluje kao supresor tumora kod raka debelog crijeva [20]. Njegova promotor je hiper-metilira s povišenim razinama Mir-206 koji dovode do silazni KLF4 [20]. Ovi rezultati pokazuju da je Mir-206 ne može funkcionirati na sličan način u svim stanicama epitela, što negira jedna veličina odgovara svima pristup u kemoterapeuticima. Pregled

U ovom istraživanju smo utvrdili mehanizam za regulaciju ekspresije c-Met gena kroz Mir-206 kod raka želuca. c-Met prekomjerna ekspresija nakon miR-206 smanjenom čini da je zajednički etiologija za patogenezi raka želuca u većini ispitanih uzoraka u ovoj studiji. Ukratko, pokazali smo da miR-206 negativno modulira c-Met mehanizam prijenosa signala u staničnoj proliferaciji i migraciji. Naša istraživanja nadamo se da će imati značajne kliničke posljedice u liječenju raka želuca. Mir-206 je kandidat i za imunohistokemijsku detekciju malih tumora i mogući cilj za bioloških lijekova. pregled

Materijali i metode

stanična kultura pregled

Ljudska stanična linija karcinoma želuca, AGS, kupljene od ATCC (Manassas, VA) je kultivirana u Ham-ovoj F-12 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma. (FBS; Hyclone, Logan, UT) pregled

etika izjava pregled

Ova studija je provedena u strogo u skladu s preporukama i odobrenje Wenzhou Medicinski fakultet Sveučilišta njega životinja i uporaba odbora (broj dozvole: WZMCOPT-043.011). Četrdeset želučani uzorci tumora i normalna donora želučani tkiva dobiveni su iz druge pridružene bolnici Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kina). Prikupljanje uzoraka je odobren od strane medicinskog sveučilišta etičkog povjerenstva Wenzhou na istraživanjima koja uključuju ljudske subjekte i pismeni informirani pristanak dobiven je od svakog slučaja. Svi pokusi su provedeni u skladu s Helsinškom deklaracijom i nacionalnim zakonima. Pregled

Kvantitativna RT-PCR pregled

Ukupna RNA se ekstrahira iz humanih uzoraka želučane tumorskih i normalnih kontrola s Trizol reagensa (Invitrogen). 10 ng ukupne RNA su korišteni za sintezu cDNA TaqMan mikrornk reverzne transkripcije Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), te miR-206 razine ekspresije kvantificirano je TaqMan mikrornk Assay (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR korištenjem Applied Biosystems VIIa 7 Real-time PCR System (Applied Biosystems). Pregled

Imunohistokemisjko bojenje c-met pregled

Dijelovi formalinom fiksiranih parafin uklopljenih ljudski uzorci tumora želučanih (5 um) su bili te potom vraćen u parafin ksilenom i etanola. Stakalca su tretirani sa 0,3% -tnim vodikovim peroksidom, a zatim inkubirane preko noći na 4 ° C sa c-met antitijela, u omjeru 1: 300 razrjeđenje (CST, Beverly, MA). Imunokemijsko bojenje je izvedena korištenjem isplanirati HRP sustav /detekciju DAB (Dako, Glostrup, Denmark). Pregled

Stanična proliferacija Test pregled

AGS stanice su stavljene na 2000 stanica po jažici na ploči s 96 jažica ( Costar, High Wycombe, Velika Britanija) za svaku ubacivanja. Transfekcije su provedene s reagensom (lipofektamina RNAiMAX; Invitrogen), u triplikatu. Za svaku jažicu, 50 nm Mir-206 oponaša molekula (Ambion, Austin, TX), ili negativna kontrola (Ambion) Transfekcija je zaposlen. Nakon 72 sata kulture, stanična proliferacija je procijenjena MTS testa (Celltiter 96 vodeno; Promega, Madison, WI). Pregled

Transwell migracije Testovi pregled

24 sata nakon transfekcije, stanice su sakupljene AGS po tripsinizacijom i ispere jednom s otopinom D-Hanks (Invitrogen). Mjeriti migraciju stanica ili invaziju 8 um veličina pora kulture ili Matrigel umetaka (transjažična, Costar) se stave u jažice za kulturu s 24 jažica. U donjoj komori, 400 jal F-12 koji sadrži 10% FBS, te se doda 20 ng /ml HGF. Zatim 5x10 ^{4 stanica je dodano u gornju komoru. Nakon 20 sata inkubacije, stanice koje su migrirale kroz pore su obojene kristalno ljubičastog i uočiti pod mikroskopom (Zeiss, Oberkochen, njemačka) uporabom cilj 20x. Pregled}

Western blot analiza pregled

AGS stanice (1x10 ^{5) se zasije na ploče sa 6 jažica i rasle su u F-12 za 24 sata prije transfekcije. 72 sata nakon transfekcije, stanice su isprane s hladnim PBS i podvrgnute puferom za lizu (35 mM Tris-Cl [pH 6.8], 20 g /l natrijevog dodecil sulfata [SDS], 100 mM ditiotreitola). Protein lizati (20 ug svaki) su razdvojeni pomoću 8% SDS-poliakrilamid gel elektroforeze, a zatim elektro-preneseni na nitroceluloznu filter membrane. Membrane su blokirane sa puferom koji sadrži 5% nemasnog mlijeka u PBS s 0,05% Tween-20 ° C 2 sata i inkubira preko noći s antitijelima na 4 ° C. Nakon drugog ispiranja s PBS koji sadrži 0,05% Tween-20, membrane se inkubiraju sa peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela (Millipore, Darmstadt, Njemačka) i razvije s poboljšanom kit za detekciju kemiluminescencija (Pierce, Rockford, IL). GAPDH je korišten kao kontrola za punjenje. Protutijela za CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, p-Akt, c-Met i GAPDH su dobivena od tvrtke Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Pregled}

siRNA testovi pregled

c-Met-specifične siRNA (Ambion) i negativna kontrola siRNA (Ambion) su korišteni da se dodatno regulira c-Met izraz u AGS stanicama. 50 nM c-Met-specifičnim siRNA ili negativna kontrola siRNA transficirana u stanicama s AGS lipofektamina RNAiMAX. MTS analiza je provedena 72 sata nakon transfekcije, a su Transwell i Matrigel ispitivanja provedena 24 sata nakon transfekcije, kao što je gore opisano. Pregled

In vivo pregled tumorski rast test pregled

prije mikrornk izraz konstruira Lenti-mir-206 i pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP kontrolu prijenosnika kupljeni su od sustava bioznanosti (Mountain View, CA). AGS stanice su zaražene s lentivirus eksprimiraju miR-206 ili negativna kontrola. Ženski golim miševima, 6 tjedana starosti, cijepljeno je sa AGS stanica (8x10 ^{6) izražava Mir-206 ili negativne kontrole u svojim bokovima, a zatim žrtvovane nakon 8 tjedana. Veličina tumora je mjerena i volumen je izračunata prema formuli: ( L pregled x W
2) x 0,5, ( L
, duljine; W pregled, širina), u skladu s postupkom koji je ranije objavljen [21]. Sve studije i postupci su odobreni od strane Njega životinja i korištenja odbora Wenzhou Medical University. Pregled}

Statistička analiza pregled

Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Prikazani rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM od rezultata dobivenih iz triplikata u jednom eksperimentu. Rezultati predstavljaju oni dobiveni iz tri odvojena pokusa. Razlike između eksperimentalne skupine i kontrolne skupine su analizirani primjenom Student t pregled -test. Statistička značajnost je prihvaćena na P izvoznici < 0.05. Pregled

popratne podatke
S1 Sl. FACS analiza AGS stanica s transfektiranim miR-206.
AGS stanice su sakupljene 48 sati nakon transfekcije Mir-206 ili NC, bojaju s propidij jodidom, i analizirane protočnom citometrijom. Deset tisuća stanice su procijenjena u svakom uzorku. Najreprezentativnijih rezultati u tri neovisna pokusa prikazani su
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s001
(TIF)
S2 Sl. formiranje kolonija test.
AGS stanice transficirane s Mir-206 ili NC su posađene na niske gustoće. Nakon 7 dana, koloniziranje je određen bojanjem s kristal violetom. prikazani su tipični rezultati u tri neovisna pokusa
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s002
(TIF)
S3 Sl. Učinci Mir-206 na AGS stanica procjenjuje transjažičnim i Matrigel testovima.
Broj stanica koje su migrirale kroz pore kultura umetak (gore) ili su izvršile invaziju kroz pore umetanje Matrigel (dolje) je snimljen pomoću 20X mikroskop cilj pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s003 pregled (TIF) pregled S4 Sl. . Podreguliranje c-Met po siRNA
Western blot analiza je provedena da potvrdi supresiju c-Met ekspresije nakon LipofectAMINE transfekcijske od AGS stanica bilo s c-Met siRNA ili negativnoj kontroli (NK) pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004 pregled (TIF)
S5 Sl. Učinci c-Met siRNA na AGS stanica procjenjuje transjažičnim i Matrigel testovima.
Broj stanica koje su migrirale kroz pore kultura umetak (gore) ili su izvršile invaziju kroz pore umetanje Matrigel (dolje) je snimljen pomoću 20X mikroskop cilj pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s005 pregled (TIF) pregled

• PLoS ONE: Exosomal miRNAs od peritoneuma iscjetku kao potencijalnu prognostičku biomarkera peritonejsku metastaza u želučanom Cancer
• PLoS ONE: Povećanje zračenja učinke ursolic kiseline u BGC-823 humanog adenokarcinoma želuca Cancer Cell Line