PLoS One: a mikro-RNS-206: Hatékony gátlása Gyomorrák Progression keresztül c-Met útvonal

absztrakt katalógusa

A mikroRNS-ek endogén rövid szénláncú nukleotid RNS szabályozó gén funkciója közvetlen kötődése target mRNS. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk az mikroRNS-206 (miR-206) a gyomorrák kialakulásával. miR-206 először megerősítette, hogy downregulált gyomorrákban példányok. Ezzel szemben, fokozza a c-Met megerősítést nyert szövetmintákban a humán gyomorrák, annak szintje fordítottan arányos miR-206 expressziót. Bevezetés a miR-206 gátolja a sejtek proliferációját indukáló G1 sejtciklusmegállás, valamint migrációs és behatolás. Ezenkívül fontos proliferációt és /vagy migrációt rokon molekulák, mint például a c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt és p-ERK esetében igazolták a downregulált Western blot analízissel. Célzás a c-Met is közvetlenül érintette AGS sejtburjánzást, migrációs és behatolás. In vivo katalógusa, miR-206 kifejező tumorsejtek is megjelenik növekedés késleltetést képest érintetlen tumorsejtek. Eredményeink igazolták, hogy a miR-206 elnyomott c-Met expressziója a gyomorrák és működhet, mint hatásos tumor szupresszor a c-Met túlexpresszáló tumorok. Gátlása miR-206 funkciója hozzájárulhatnak aberráns sejtek proliferációját és migrációját, ami a gyomor rák kialakulásához.

bevezető hivatkozás: Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) a mikro-RNS-206: Hatékony gátlása Gyomorrák Progression keresztül c-Met útvonal. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751 katalógusa

Szerkesztő: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japán katalógusa

Beérkezett: február 4, 2015; Elfogadva: 1. május 2015; Megjelent: július 17, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Zheng és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatja, részben a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína Grant 81100671 (DY), Zhejiang tartományi Természettudományi Alapítvány Kína Grant Y2110609 ( DY), és Wenzhou Science & Technológiai Hivatal Grant Y20080096 (DY). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb daganat a második vezető oka a rák okozta halál a világon. [1] A morbiditás és mortalitás különösen hangsúlyos az ázsiai országokban miatt a különböző hatások [1]. Mivel az előadás gyakran társul előrehaladott stádiumban van sürgősen szükség előleg annak felderítése, és végső soron a menedzsment. Jelenleg a megértése mikroRNS (miRNS) befolyásolására gyomorrák kialakulásának megy végbe gyors ütemben. Katalógusa

Mivel az első leírás a miRNS a fonalféreg C katalógusa. elegans katalógusa 1993-ban, ezek hatása a kis, nem kódoló RNS-ek túllépett több ága a molekuláris biológia. [2] MiRNS olyan erősen szövet-specifikus biomarkerek a potenciálisan megváltoztathatják és átalakítani rezidens szövetet. Mivel a túlzott mértékű expressziója és alul-expresszió egyaránt összefüggésbe hozták tumorigenezis, [3] a szerepük, mint onkogének és tumorszuppresszor gének egyaránt jól megalapozott [4, 5]. Az elmúlt néhány év során hatással van a fejlődésre és felderítése szilárd szerv daganatok, így például a gyomorrák lassan inkább fény derül. Már számos miRNS azonosítottak a gyomorrák anti-apoptotikus mechanizmus, mint például a miR-21 és miR-148a [6, 7]. Egyéb utak befolyásolja miRNS tartalmaznak a sejtciklus előrehaladását, amely a miR-222/221, miR-106b /93/25 és miR-24 [6, 7]. Katalógusa

Egy másik ígéretes új miRNS szilárd szerv tumorok tartalmazza a miR-206 [8]. Ez különösen a miRNS csoportjába tartozik az "myomiRs", hogy részt vesz a vázizomzat fejlesztés [9]. Miután társított számos egyéb betegségek, köztük a szívbetegség, krónikus obstruktív tüdőbetegség és az Alzheimer-kór, szerepe az onkogenezisben kapott ellenőrzéssel újabban beleértve rhabdomyosarcoma, tüdőrák, végbélrák, schwannoma, és a gyomorrák [8, 9]. Bár emelt néhány típusú rák, beleértve a petefészek-és Waldenström makroglobulinémia, miR-206 többnyire elnyomják szilárd szerv tumorokban [9]. miR-206 már korábban kimutatták, hogy gátolja a gyomor rák proliferációját részben azáltal, hogy elnyomja a ciklin D2 [10]. Ebben a vizsgálatban, koncentráltunk a szerepe a miR-206 gyomorrákban onkogenezis a c-Met útvonal, amely hagyományosan befolyásos jelátviteli számára onkogenezissel a különböző daganatok [11]. c-Met már előre, és kimutatták, hogy a megcélzott gén több miRNS beleértve a miR-206 [9, 12]. katalógusa

Eredmények katalógusa

visszaszorításáról miR-206 növelte a c-Met expresszió gyomorrák

Valós idejű RT-PCR elemzést végeztünk, hogy észleli a expressziójának miR-206 40 gyomorrák példányok és a normális szöveteket. miR-206 szinteket a legtöbb szöveti mintákat a gyomor tumor (34/40) úgy találták, hogy szignifikánsan alacsonyabb, mint a normál szövetekben (1A ábra). miR-206 expressziója fordítottan arányos az a szint, a c-Met megfigyelt tumorminták (1B ábra). A legtöbb tumor minták, csökkent miR-206 expressziós mutatott nagy százalékban (> 50%) a c-Met-festéssel. Ezzel szemben, a daganatok normál kifejezése miR-206 mutatott nagyon gyenge vagy negatív c-Met kifejezést. Katalógusa

miR-206 által kiváltott G1 és az gátolja a sejtburjánzást, a migráció és invázió AGS gyomorrák sejtek katalógusa

Mivel a miR-206 expressziója csökkent a gyomorrák példányok törekedtünk arra, hogy meghatározza, hogy a bevezetése a miR-206 volt semmilyen biológiai hatása az AGS sejteket. AGS transzfektált sejtek a miR-206 molekula mutatta, a sejtnövekedés gátlása, összehasonlítva negatív kontroll alapján MTS-vizsgálat (2A ábra). FACS analízis a sejtek mutatták, G1 sejtciklus (S1 ábra). A telepek száma is csökkent transzfekciós miR-206 (S2 ábra).

miR-206 képes gátolni a migráció és invázió AGS sejtek (2B és S3 ábra). A drámai csökkenése irányába történő migráció az alsó kamra volt megfigyelhető a miR-206 transzfektált sejtek AGS (86 ± 15 vs. 165 ± 16 AGS sejtekben, P katalógusa < 0,01, n = 3). Emellett transzfektált sejtekben a miR-206 azt mutatta, hogy a HGF-indukált behatolásra is jelentősen akadályozott következő miR-206 transzfekciója (57 ± 12 vs. 116 ± 14 AGS sejtekben, P katalógusa < 0,01, n = 3). katalógusa

miR-206 downregulált c-Met expressziója és más sejtciklus kapcsolódó fehérjék

már korábban azonosított c-Met közvetlen célpontja a miR-206 [9]. Western-blot analízis megerősítette, hogy a c-Met expressziója csökkent miR-206 transzfekció AGS sejtekben (3. ábra). Ezzel egyidejűleg, ectopiás miR-206 is alulszabályozott expressziójának CDK4, p-Rb, p-Akt és a p-ERK.

downregulation a c-Met gátolta gyomorrák sejtproliferációt, a migrációt és invázió katalógusa

a következő, a c-Met specifikus siRNS használta először, hogy csökkentse a kifejezés a c-Met in AGS sejtekben (S4 ábra). MTS vizsgálatot végeztünk, hogy észleli a sejtek szaporodását. AGS transzfektált sejtek c-Met siRNS mutatott csökkentett sejtnövekedést képest negatív kontroll sejtek (ábra 4A; 25.10 ± 3.81% -os csökkenés). Mindkét HGF-indukált migrációs és behatolás csökkentek, ha összehasonlítjuk a c-Met siRNS transzfektált sejtek negatív kontrollként transzfektált sejtekben. Amint azt a ábrán a 4B és S5 ábra, csökken a migráció (88 ± 10 vs. 155 ± 15, a P < 0,01, n = 3) és az invázió (72 ± 7 vs. 126 ± 12, a P < 0,01, n = 3) egyaránt statisztikailag szignifikáns. katalógusa

Bevezetés a miR-206 elnyomta a tumor növekedését in vivo Matton

a következőkben vizsgálni, ha túltermelése miR-206 is elnyomják a daganat növekedését in vivo katalógusa. 8 hét után, az átlagolt tumor térfogatok szignifikánsan alacsonyabb volt fertőzött sejtek lentivírus expresszáló miR-206, szemben a kontroll (5. ábra).

Discussion

Gyomorrák maradt jelentős egészségügyi ápolási teher világszerte ellenére több éves kutatás [1]. A WHO szerint, gyomorrák továbbra is az egyik legjobb rák kórokozóját magas halálozási arány [1]. Mint más szervi daganatok, egyre világosabbá válik, hogy jobban megértsék a tumor onkogenezissel szükséges javítani a prognózist az ilyen betegek. Mivel elterjedt az ázsiai országban, az adatok jelennek meg a szerepét miRNS kialakulására vagy elnyomása gyomorrák. [6] katalógusa

miRNS már kettős funkciót tekintve gyomorrák fejlesztés [6, 13]. Néhány miRNS vannak tumorszuppresszorok és mások oncomiRs [6]. Ueda et al. talált 22 miRNS túlszabályozott és 13 downregulált a plazmában betegek gyomorrák [13]. Célok, amelyek a vizsgálat alatt abban az esetben gyomorrák közé szabályozó p16 keresztül miR-24 és p21 keresztül miR-222/221 és miR-106b /93/25 [6]. Mások, mint például a miR-21, lehet fokozódik akár 92% gyomorrák szövetminták [14]. A jelentkezőknek azonosított gyomorrák szolgáló tumorszupresszorokkal közé miR-181B, miR-101 és miR-486 [6]. Például a miR-101 gondolják, hogy célzott EZH2, COX-2, Mcl-1 és Fos [15]. miR-486 gondolják, hogy befolyásolja OLFM4, esetleg befolyásoló apoptózis downstream [16]. katalógusa

Miután megállapítottuk, hogy a többség a miRNS-ek szolgálnak tumor szupresszor, megvizsgáltuk a c-Met útvonal gyomorrákban. A tanuló a c-Met útvonal az rhadbomyosarcoma, azt találtuk, hogy mennyire fontos ez útvonal szarkóma [9]. A c-Met ismert, hogy diszreguláit gyomorrákban [11, 17-19]. A MET proto-onkogén fehérjét kódol ismert hepatocita növekedési faktor (HGF) receptor, amely rendelkezik a tirozin-kináz-aktivitás [18]. Mi általában találnak kifejezve csak az őssejt, de azt is látta a szabályozatlanság a onkogenezis [18]. Ebben a vizsgálatban tudtuk megerősíteni, hogy a c-Met lényeges szerepet gyomorrák és szerepét, mint a miR-206 cél sarkalatos onkogenezis. Katalógusa

A sejtciklus progresszióját megbomlik gyomorrák. A korábbi jelentések ciklin D2 megemelkedik gyomorrákjának miR-206 befolyásolja [10]. miR-206 kimutatták, hogy hatásos prognosztikai [10]. A downregulációját társul rövidebb teljes túlélést. Restaurálása miR-206 vezet G0 /G1 sejtciklusmegállás, megerősítve szerepét a tumor szupresszor. A kutatás azt is kimutatta sejtciklus szabályozási zavar a CDK4 és foszforilált-Rb érintett. CDK4 tagja a ciklin dependens kináz család Ser /Thr fehérje-kináz-aktivitást. Ez vezet a G1 fázis progresszió. Ezen túlmenően, a kináz vezet foszforilációját Rb, amely egy tumorszuppresszor részt vesz a sejtciklus progressziójában.

bár hasonló eredményeket is megerősítette gyomor, petefészek és az emlő rák, a szerepe a miR-206 tűnik hogy van egy ellentétes hatást vastagbélrákban [6, 20]. Fordított összefüggés volt megfigyelhető között miR-206 és KLF4 egy panel emberi vastagbélrák [20]. KLF4, amely onkogén tulajdonságai, más rákok, például a mell-, a bőr és a tüdő, működik, mint egy tumorszuppresszor vastagbélrákban [20]. A promoter hiper-metilezett szintetizált miR-206 vezető alulszabályozása KLF4 [20]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a miR-206 nem működik hasonlóan minden hámsejtek, amely tagadja az egy kaptafára megközelítés kemoterápiás. Katalógusa

A jelen tanulmányban azonosított szabályozó mechanizmus a c-Met gén expressziójának keresztül miR-206 gyomorrákban. c-Met overexpresszió következő miR-206 downregulation úgy tűnik, hogy a közös etiológiája a patogenezisében gyomorrák a legtöbb vizsgált minták ebben a vizsgálatban. Összefoglalva, kimutattuk, hogy a miR-206 negatívan modulálja a c-met jelátviteli útvonal részt vesz a sejtproliferáció és migráció. Vizsgálataink remélhetőleg fontos klinikai következményei kezelésére gyomorrák. miR-206 egy jelölt mindkét immunhisztokémiai kimutatása a kis daganatok és lehetséges célpontja a biológiai terápiák során. katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejtkultúra katalógusa

Az emberi gyomorrák sejtvonal AGS, vásárolt ATCC-től (Manassas, VA), növesztettünk Ham-féle F-12 táptalajban (Invitrogen, Carlsbad, CA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS; Hyclone, Logan, UT).

Etikai nyilatkozat katalógusa

Ezt a vizsgálatot hajtottak végre szigorú összhangban ajánlásokat és jóváhagyása Wenzhou Orvostudományi Egyetem Animal Care and Use Committee (engedély száma: WZMCOPT-043011). Negyven gyomor tumor minták és normál donor gyomor szövetek kaptuk a második kapcsolt kórházi Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kína). A mintavételt hagyta jóvá a Wenzhou Orvostudományi Egyetem Etikai Bizottságának járó kutatás embereken, és írásos beleegyezésüket adták minden esetben. Minden kísérletet megfelel a Helsinki Nyilatkozat, valamint a nemzeti jogszabályok. Katalógusa

kvantitatív RT-PCR katalógusa

A teljes RNS-t vontunk ki az emberi gyomor tumor minták és egészséges kontrollok Trizol reagens (Invitrogen). 10 ng teljes RNS használtuk cDNS-szintézishez a Taqman mikro-RNS reverz transzkripciós Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), és a miR-206 expressziós szintet mennyiségileg a Taqman microRNS Assay (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR segítségével végeztük Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

immunhisztokémiai festése c-Met

alosztályai formalin-fixált, paraffinba ágyazott emberi gyomor tumor minták (5 um) készítettünk, és ezután de-paraffinized xilollal és etanol. A lemezeket kezelünk 0,3% hidrogén-peroxidot, majd egy éjszakán át inkubáljuk 4 ° C-c-met antitest 1: 300 hígítású (CST, Beverly, MA). Immunhisztokémiai festéssel végeztük a EnVision HRP /DAB érzékelő rendszer (Dako, Glostrup, Dánia).

Cell proliferációs vizsgálati

AGS sejteket 2000 sejt per lyuk 96 lyukú lemezeken ( Costar, High Wycombe, UK) minden transzfekció. A transzfekciókat végeztünk reagenssel (Lipofectamine RNAiMAX; Invitrogen), háromszoros ismétlésben. Minden egyes rezervoárban, 50 nM miR-206 utánozza molekula (Ambion, Austin, TX), vagy egy negatív kontroll (Ambion) transzfekciós alkalmaztunk. 72 óra elteltével a kultúra, sejt proliferációt pedig az MTS vizsgálattal (CellTiter 96 Aqueous; Promega, Madison, WI).

Transwell migrációs assay

24 órával a transzfektálás után AGS sejteket tripszinezéssel, és egyszer mostuk D-Hanks-oldattal (Invitrogen). Méréséhez sejtmigrációt vagy invázió, 8-um pórusméretű kultúra vagy Matrigel-betétek (Transwell; Costar) helyeztünk a lyukakhoz 24 lyukas szövettenyésztő lemezeken. Az alsó kamrában, 400 ul F-12, amely 10% FBS-t és 20 ng /ml HGF adunk hozzá. Ezután 5x10 ^{4 sejteket teszünk a felső kamrába. A reakcióelegyet 20 órás inkubálás után a sejteket vándorolt ​​a pórusokon keresztül megfestettük kristályibolya és megfigyeltük mikroszkóp alatt (Zeiss, Oberkochen, Németország) segítségével 20x objektív.}

Western-blot-analízis

AGS sejteket (1x10 ^{5) oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre, és növesztjük az F-12, 24 órával a transzfekció előtt. 72 órával a transzfektálás után a sejteket mostuk hideg PBS-ben, és vetjük alá lízis-pufferben (35 mM Tris-CI [pH 6,8], 20 g /l nátrium-dodecil-szulfát [SDS], 100 mM ditiotreitol). Protein lizátumokat (20 ug egyenként) alkalmazásával elkülönítettük 8% -os SDS-poliakrilamid-gél-elektroforézissel, majd elektro-át nitrocellulóz szűrő-membránokra. A membránokat blokkoltuk egy puffer, amely 5% zsírmentesített tejet tartalmazó PBS-ben 0,05% Tween-20-on 2 órán át, és egy éjszakán át inkubáljuk az antitesttel 4 ° C hőmérsékleten. Miután egy második mosás PBS-sel, amely 0,05% Tween-20, a membránokat inkubáltuk peroxidáz-konjugált másodlagos antitestekkel (Millipore, Darmstadt, Németország), és kifejlesztett egy továbbfejlesztett kemilumineszcens detektáló reagenskészlet (Pierce, Rockford, IL). GAPDH használtunk terhelési kontrollként. Antitestek a CDK4, p-Rb, ERK, Akt, a p-ERK, a p-Akt, c-Met és a GAPDH voltak a Cell Signaling Technology (Beverly, MA).}

siRNS assay

c-Met-specifikus siRNS (Ambion) és negatív kontroll siRNS (Ambion) használtunk downregulate c-Met-expresszió AGS sejtekben. 50 nM c-Met-specifikus siRNS vagy negatív kontroll siRNS-t transzfektáltunk AGS sejtek Lipofectamine RNAiMAX. MTS vizsgálatot végeztünk 72 órával a transzfekció után, míg a Transwell és Matrigel-vizsgálatot végeztünk 24 órával a transzfekció után, a fent leírtak szerint.

In vivo
tumornövekedési vizsgálatban

pre-miRNS expressziós konstrukciók Lenti-miR-206 és pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vezérlő vektor vásároltunk a rendszer Biosciences (Mountain View, CA). AGS sejteket fertőztünk lentivírus expresszáló miR-206 vagy negatív kontroll. Nőstény szőrtelen egerek, 6 hetes korban, beoltjuk AGS sejteket (8x10 ^{6) expresszáló miR-206 vagy negatív kontrollok azok lágyék, majd feláldoztuk 8 hét után. A tumor nagyságát és térfogatot az alábbi képlet segítségével: ( L katalógusa x W katalógusa 2) x 0,5 ( L katalógusa, hossz; W
, szélesség), módszer szerint korábban jelentett [21]. Valamennyi tanulmány és eljárásokat jóváhagyta a Wenzhou Medical University Animal Care and Use Committee. Katalógusa}

A statisztikai elemzés katalógusa

Az összes adatot mutatja átlag ± SEM. Bemutatott eredmények fejezzük középértéke ± SEM nyert eredmények, három sorozatban az egyik kísérletben. Eredmények reprezentálják kaptunk három külön kísérletben. Különbségek a kísérleti csoport és a kontroll csoport elemezte a Student-féle t katalógusa próba. A szignifikancia elfogadásra P katalógusa < 0.05.

alátámasztó információk
S1 ábra. FACS analízis AGS transzfektált sejtek miR-206.
AGS sejteket összegyűjtjük 48 órával a transzfekció után a miR-206 vagy NC, propidium-jodiddal festettük, és áramlási citometriával elemezzük. Tízezer sejteket értékeltük az egyes mintákban. A legreprezentatívabb eredményeket három független kísérlet ábrázolja. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s001 katalógusa (TIF) hotelben S2 ábra. Telepképző assay.
AGS transzfektált sejtek miR-206 vagy NC oltottunk alacsony sűrűség. 7 nap után, kolónia képződését úgy határoztuk meg, festéssel kristályibolya. Tipikus eredményeket három független kísérlet mutatja. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s002 katalógusa (TIF) hotelben S3 ábra. A hatások a miR-206 az AGS sejteket értékelni Transwell és Matrigél vizsgálatokban.
Száma vándorolt ​​sejtek a kultúra betét pórusok (fel) vagy megszállták a Matrigel betét pórusok (le) fényképezett segítségével 20X mikroszkóp objektív. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s003 katalógusa (TIF) hotelben S4 ábra. Downregulációját a c-Met által siRNS.
Western-blot analízist végeztünk, hogy igazoljuk elnyomása c-Met expressziója után Lipofectamine transzfekcióját AGS sejtek vagy a c-Met siRNS vagy egy negatív kontroll (NC).
Doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s004 katalógusa (TIF) hotelben S5 ábra. A hatások a c-Met siRNS on AGS sejteket értékelni Transwell és Matrigél vizsgálatokban.
Száma vándorolt ​​sejtek a kultúra betét pórusok (fel) vagy megszállták a Matrigel betét pórusok (le) fényképezett segítségével egy 20x mikroszkóp objektív. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0128751.s005 katalógusa (TIF) hotelben

• PLoS One: Exosomal miRNS-re hashártya mosófolyadék mint potenciális prognosztikai biomarkerek peritoneális metasztázis Gyomor Cancer
• PLoS One: Enhancement sugárzás hatásai által urzolsavat a BGC-823 humán adenokarcinóma Gyomor Cancer Cell Line