PLOS ONE: MicroRNA-206: effektiv hämning av Gastric Cancer Progression genom c-Met Pathway

Sammanfattning

MicroRNAs är endogena kortkedjiga nukleotid RNA som reglerar genfunktion genom direkt bindning av mål mRNA. I denna studie undersökte vi effekterna av microRNA-206 (MIR-206) på utvecklingen av magcancer. MIR-206 var första bekräftade att nedregleras i magcancer prover. Omvänt var uppreglering av c-Met bekräftades i vävnadsprover av human magcancer, med dess nivå omvänt korrelerade med MIR-206-expression. Införande av MIR-206 inhiberade cellulär proliferation genom att inducera G1 cellcykelstopp, samt migration och invasion. Dessutom har viktiga spridning och /eller migrationsrelaterade molekyler såsom c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt och p-ERK bekräftade att nedregleras genom Western blot-analys. Inriktning av c-Met också direkt påverkat AGS celltillväxt, migration och invasion. In vivo
, MIR-206 uttryckande tumörceller visas också tillväxtfördröjning i jämförelse med opåverkade tumörceller. Våra resultat visade att miR-206 undertryckte c-Met-uttryck i gastrisk cancer och kunde fungera som en potent tumörsuppressor i c-Met överuttrycker tumörer. Hämning av MIR-206 funktion skulle kunna bidra till avvikande celltillväxt och migration, vilket leder till magcancer utveckling

Citation. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) MicroRNA-206: effektiv hämning av Gastric Cancer Progression genom c-Met Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10.1371 /journal.pone.0128751

Redaktör: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

emottagen: 4 februari 2015; Accepteras: 1 maj 2015, Publicerad: 17 juli 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete stöddes delvis av National Natural Science Foundation i Kina Grant 81100671 (DY), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation i Kina Grant Y2110609 ( DY), och Wenzhou Science & Teknik Bureau Grant Y20080096 (DY). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen [1]. Dess sjuklighet och dödlighet är särskilt uttalad i asiatiska länder på grund av en mängd olika influenser [1]. Sedan dess presentation förknippas ofta med avancerad sjukdom, det finns ett akut behov av framsteg i sin upptäckt och i slutändan dess ledning. För närvarande är förståelsen av mikroRNA (miRNA) på att påverka magcancer bildning uppträder i snabb takt.

Sedan den första beskrivningen av miRNA i nematoden C
. elegans
redan 1993, effekterna av dessa små icke-kodande RNA har övervunnit flera grenar inom molekylärbiologin [2]. MiRNA är mycket vävnadsspecifika biomarkörer med potential att förändra och omvandla bosatt vävnad. Eftersom överuttryck och under uttryck har båda satts i samband med tumörbildning [3], deras roller som onkogener och tumörsuppressorgener är båda väletablerade [4, 5]. Under de senaste åren, är deras inverkan på utvecklingen och detektering av solida tumörer organ inklusive magcancer långsamt belysas. Det finns redan flera miRNA identifierats i magsäckscancer anti-apoptotiska mekanismen såsom MIR-21 och MIR-148a [6, 7]. Andra vägar påverkas av miRNAs inkluderar cellcykelprogression bestående av miR-222/221, MIR-106b /93/25 och MIR-24 [6, 7].

En av de andra lovande nya miRNA för hårda organ tumörer omfattar miR-206 [8]. Denna speciella miRNA tillhör en grupp av "myomiRs" som är involverade i skelettmuskulaturen utveckling [9]. Efter att ha varit i samband med ett stort antal andra sjukdomar som hjärtsjukdomar, kronisk obstruktiv lungsjukdom och Alzheimers, dess roll i onkogenes fick kontroll på senare tid bland annat rabdomyosarkom, lungcancer, kolorektal cancer, schwannom, och magcancer [8, 9]. Även om förhöjda i några typer av cancer, inklusive äggstocks- och makroglobulinemi är MIR-206 mestadels undertryckt i tumörer fasta organ [9]. MIR-206 har tidigare visats hämma magcancer proliferation delvis genom att undertrycka cyklin D2 [10]. I denna undersökning har vi koncentrerat oss på den roll miR-206 i magcancer onkogenes genom c-Met vägen, som traditionellt har varit en inflytelserik signalväg för onkogenes i en mängd olika tumörer [11]. c-Met har förutspått och visat sig vara målgenen av flera miRNA inklusive miR-206 [9, 12].

Resultat

bekämpande av MIR-206 ledde till ökad c-Met expression i magcancer

i realtid RT-PCR-analys utfördes för att detektera uttrycket av mIR-206 i 40 gastriska cancerprover och normala vävnader. MIR-206 nivåer i de flesta vävnadsprover av magsäcks tumör (34/40) befanns vara betydligt lägre än normala vävnader (Fig 1A). MIR-206 expression var omvänt relaterad till nivån av c-Met observerades i tumörprover (figur 1B). De flesta tumörprover, med minskad miR-206 uttryck, uppvisade hög andel (mer än 50%) av c-Met-färgning. Omvänt, tumörer med normal uttryck av MIR-206 visade mycket svag eller negativ c-Met uttryck.

MIR-206 inducerade G1 gripande och hämmade celltillväxt, migration och invasion av AGS gastric cancerceller

som miR-206 uttryck minskades i magcancer prover, försökte vi bestämma om införandet av mIR-206 hade någon biologisk effekt på AGS celler. AGS-celler transfekterade med Mir-206-molekylen visade hämning av celltillväxt jämfört med negativ kontroll baserad på MTS-analys (Fig 2A). FACS-analys av cellerna uppvisade G1-cellcykeluppehåll (S1 fig). Antalet kolonier reducerades även med transfektion av MIR-206 (S2 fig).

miR-206 kan inhibera migration och invasion av AGS-celler (fig 2B och S3 fig). En dramatisk minskning av övergången till de lägre kamrarna observerades i MIR-206 transfekterade AGS-celler (86 ± 15 vs. 165 ± 16 i AGS celler, P Hotel < 0,01, n = 3). Dessutom celler transfekterade med MIR-206 visade att HGF-inducerad invasiv också signifikant hämmades efter MIR-206 transfektion (57 ± 12 vs. 116 ± 14 i AGS celler, P Hotel < 0,01, n = 3).

mIR-206 nedregleras c-Met uttryck och andra cellcykelrelaterade proteiner

Vi har tidigare identifierat c-Met som ett direkt mål för mIR-206 [9]. Western blot-analys bekräftade att c-Met expression reducerades med MIR-206 transfektion i AGS-celler (fig 3). Samtidigt ektopisk miR-206 också nedregleras expression av CDK4, p-Rb, p-Akt och p-ERK.

nedreglering av c-Met hämmade magcancer celltillväxt, migration och invasion

Därefter c-Met specifik siRNA användes först för att minska uttrycket av c-Met i AGS-celler (S4 Fig). MTS-analyser utfördes för att detektera proliferering av celler. AGS-celler transfekterade med c-Met siRNA visade minskad celltillväxt jämfört med negativa kontrollceller (fig 4A, 25,10 ± 3,81% minskning). Både HGF-inducerad migration och invasion minskade när man jämför c-Met siRNA transfekterade celler till negativa kontroll transfekterade celler. Såsom anges i fig 4B och S5 Fig, minskning av migration (88 ± 10 vs. 155 ± 15, P < 0,01, n = 3) och invasion (72 ± 7 jämfört med 126 ± 12, P < 0,01, n = 3) var båda statistiskt signifikant.

Införande av mIR-206 undertryckte tumörtillväxt in vivo

Vi undersökte nästa om överuttryck av mIR-206 kan undertrycka tumörtillväxt in vivo
. Efter 8 veckor, de genomsnittliga tumörvolymerna var betydligt lägre från celler infekterade med lentivirus uttrycker miR-206, jämfört med kontroll (fig 5).

Diskussion

Gastric cancer har förblivit en betydande hälsa vård börda över hela världen trots åratal av forskning [1]. Enligt WHO, förblir magcancer en av de bästa cancer etiologier med hög dödlighet [1]. Som med andra tumörer fasta organ är det allt tydligare att bättre förståelse av tumör onkogenes är nödvändigt för att förbättra prognosen för dessa patienter. Att vara förhärskande i asiatiska länder, är uppgifter fram på sig rollen av miRNA på utvecklingen eller undertryckande av magcancer [6].

miRNAs har dubbla funktioner i form av magcancer utveckling [6, 13]. Vissa miRNA är tumörsuppressorer och andra är oncomiRs [6]. Ueda et al. hittade 22 miRNA uppreglerade och 13 nedregleras i plasma hos patienter med magcancer [13]. Mål som är under utredning i fallet med magcancer inkluderar regulatorer av p16, via MIR-24, och p21 genom miR-222/221 och MIR-106b /93/25 [6]. Andra, såsom MIR-21, kan uppregleras i upp till 92% av magcancer vävnadsprover [14]. Kandidater som identifierats i magcancer tjänar som tumörsuppressorer inkluderar MIR-181b, MIR-101 och MIR-486 [6]. Till exempel, är miR-101 tros rikta EZH2, Cox-2, Mcl-1 och Fos [15]. MIR-486 är tänkt att påverka OLFM4, möjligen påverka apoptos nedströms [16].

Efter att ha konstaterat att majoriteten av miRNA fungera som tumörsuppressorer undersökte vi c-Met vägen i magcancer. När man studerar c-Met vägen för rhadbomyosarcoma, fann vi betydelsen av denna väg i sarkom [9]. c-Met är känd att dysreglerad i magcancer [11, 17-19]. MET-protoonkogenen kodar för ett protein som kallas hepatocyt tillväxtfaktor (HGF) receptor, som besitter tyrosinkinasaktivitet [18]. Vi finner det normalt endast uttrycks i stamceller men har också sett dess dysreglering i onkogenes [18]. I denna studie kunde vi bekräfta att c-Met är signifikant involverat i magcancer och dess roll som en MIR-206 mål är avgörande för onkogenes.

cellcykelprogressionen är oreglerad i magcancer. Baserat på tidigare rapporter, är cyklin D2 förhöjd i magsäckscancer när miR-206 påverkas [10]. MIR-206 har visat sig vara en potent prognostisk markör [10]. Dess nedreglering förknippas med kortare total överlevnad. Restaurering av MIR-206 leder till G0 /G1 cellcykelstopp, vilket bekräftar dess roll som en tumörsuppressor. Vårt arbete visade också cellcykel dysreglering med CDK4 och fosforylerade-Rb påverkas. CDK4 är en medlem av cyklin beroende kinas familj med ser /thr proteinkinasaktivitet. Det leder till G1-fasen progression. Dessutom leder kinas till fosforylering av Rb, som är en tumörsuppressor involverad i cellcykelprogression.

Även om liknande slutsatser har bekräftats i magsäcken, äggstocks- och bröstcancer, den roll MIR-206 verkar att ha en motsatt effekt i tjocktarmscancer [6, 20]. En omvänd korrelation noterades mellan miR-206 och Klf4 i en panel av humana koloncancer [20]. Klf4, som har onkogena egenskaper i andra cancerformer såsom bröst-, hud- och lunga, fungerar som en tumörsuppressor i tjocktarmscancer [20]. Dess promotor är hyper-metyleras med förhöjda nivåer av MIR-206 leder till nedreglering av Klf4 [20]. Dessa fynd tyder på att MIR-206 inte kan fungera på samma sätt i alla epitelceller, vilket eliminerar one size fits all strategi kemoterapeutika.

I den aktuella studien har vi identifierat en mekanism för reglering av c-Met genuttryck genom mIR-206 i magcancer. c-Met uttryck efter MIR-206 nedreglering verkar vara gemensam etiologi för patogenesen av magcancer i de flesta prover undersöktes i denna studie. Sammanfattningsvis visade vi att miR-206 modulerar c-Met signalväg involverade i cellproliferation och migration negativt. Våra studier kommer förhoppningsvis har viktiga kliniska konsekvenser vid behandling av magsäckscancer. MIR-206 är en kandidat för både immunhistokemisk detektion av små tumörer och tänkbart mål för biologiska läkemedel.

Material och metoder

Cellodling

Den humana magcancer-cellinje, AGS, köpta från ATCC (Manassas, VA), odlades i Hams F-12 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum. (FBS; Hyclone, Logan, UT) katalog

Ethics uttalande

Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med de rekommendationer och godkännande av Wenzhou Medical University Djurvård och användning kommittén (Tillståndsnummer: WZMCOPT-043.011). Fyrtio gastric tumörprover och normala givargastriska vävnader erhölls från andra anslutna sjukhuset i Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kina). Provsamling godkändes av Wenzhou Medical University etikkommittén för forskning på människor, och skriftligt informerat samtycke erhölls från varje enskilt fall. Alla experiment utfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och nationella lagar.

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA extraherades från humana gastric tumörprover och normala kontroller med Trizol-reagens (Invitrogen). 10 ng av totalt RNA användes för cDNA-syntes av Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), och MIR-206-expressionsnivån kvantifierades genom Taqman MicroRNA Assay (Applied Biosystems). Realtids-RT-PCR utfördes med användning av Applied Biosystems VIIA 7 realtids-PCR System (Applied Biosystems).

Immunohistokemisk färgning av c-Met

Sektioner av formalinfixerade paraffininbäddade humana mag tumörprover (5 pm) gjordes och sedan de-paraffinized med xylen och etanol. Objektglas behandlades med 0,3% väteperoxid och inkuberades sedan över natten vid 4 ° C med c-Met antikropp vid 1: 300 utspädning (CST, Beverly, MA). Immunhistokemisk färgning utfördes med användning av EnVision HRP /DAB detektionssystem (Dako, Glostrup, Danmark).

cellprolifereringsanalys

AGS celler ströks ut med 2000 celler per brunn i 96-brunnsplattor ( Costar, High Wycombe, UK) för varje transfektion. Transfektioner utfördes med reagens (Lipofectamine RNAiMAX, Invitrogen), i tre exemplar. För varje brunn tillsattes 50 nM miR-206 härmar molekyl (Ambion, Austin, TX), eller en negativ kontroll (Ambion) transfektion användes. Efter 72 timmars odling, var celltillväxt bedöms av MTS-analys (CellTiter 96 Aqueous, Promega, Madison, WI).

Transwell migrationsanalyser

24 timmar efter transfektion, AGS celler skördades genom trypsinering och tvättades en gång med D-Hanks-lösning (Invitrogen). För att mäta cellmigrering eller invasion, 8

• PLOS ONE: Exosomal miRNA från bukhinna sköljvätska som potentiella Prognostiska Biomarkers av Peritoneal metastaser i Gastric Cancer
• PLOS ONE: Förbättring av strålningseffekter av ursolsyra i BGC-823 Human Adenocarcinom Gastric Cancer Cell Line