PLOS ONE: microARN-206: Inhibition efficace du cancer gastrique Progression par la voie c-Met

Résumé

Les microARN sont à chaîne courte ARNs nucléotidiques endogènes qui régulent la fonction des gènes par liaison directe d'ARNm cibles. Dans cette étude, nous avons étudié les effets des microARN-206 (miR-206) sur le développement du cancer gastrique. miR-206 a été confirmé être régulée à la baisse dans les échantillons de cancer gastrique. A l'inverse, la régulation positive de c-Met a été confirmée dans des échantillons de tissus de cancer gastrique humain, avec son niveau inversement corrélée avec l'expression de miR-206. L'introduction de miR-206 a inhibé la prolifération cellulaire en induisant G1 arrêt du cycle cellulaire, ainsi que la migration et l'invasion. En outre, les molécules de prolifération et /ou la migration liée importants tels que c-Met, CDK4, le p-Rb, p-Akt et le p-ERK ont été confirmés pour être régulée à la baisse par une analyse par transfert de Western. Ciblage de c-Met également directement touchés AGS la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion. In vivo
, miR-206 cellules tumorales exprimant également affiché un retard de croissance par rapport aux cellules tumorales non affectées. Nos résultats ont démontré que miR-206 a supprimé l'expression de c-Met dans le cancer gastrique et pourrait fonctionner comme un suppresseur de tumeur puissante dans les tumeurs surexprimant c-Met. L'inhibition de miR-206 fonction pourrait contribuer à la prolifération cellulaire aberrante et la migration, conduisant au développement du cancer gastrique

Citation:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) microARN-206: Inhibition efficace du cancer gastrique Progression par la voie c-Met. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10.1371 /journal.pone.0128751

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, JAPON

Reçu: 4 Février 2015; Accepté: 1 mai 2015; Publié le 17 Juillet, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Zheng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été soutenu en partie par la national science Foundation de Chine Natural Grant 81100671 (DY), Zhejiang provincial Natural science Foundation de Chine Grant Y2110609 ( DY) et Wenzhou science & Technologie Bureau Grant Y20080096 (DY). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de cancer liés à la mort dans le monde [1]. Sa morbidité et la mortalité est particulièrement prononcée dans les pays asiatiques en raison d'une variété d'influences [1]. Depuis sa présentation est souvent associée à une maladie avancée, il y a un besoin urgent de progrès dans sa détection et, finalement, sa gestion. À l'heure actuelle, la compréhension de microARN (miARN) à influencer la formation de cancer gastrique se produit à un rythme rapide.

Depuis la première description de miARN dans le nématode C
. plusieurs branches elegans
en 1993, l'impact de ces petits ARN non-codants a transcendé la biologie moléculaire [2]. MiRNAs sont des biomarqueurs de tissus hautement spécifique avec le potentiel pour modifier et transformer le tissu résident. Étant donné que la surexpression et la sous-expression ont tous deux été associés à la tumorigenèse [3], leurs rôles oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur sont tous deux bien établies [4, 5]. Au cours des dernières années, leur impact sur le développement et la détection des tumeurs d'organes solides, y compris le cancer gastrique est lentement élucidé. Il existe déjà plusieurs miARN identifiés dans le cancer gastrique mécanisme anti-apoptotiques tels que miR-21 et miR-148a [6, 7]. D'autres voies influencés par miARN comprennent la progression du cycle cellulaire comprenant des miR-222/221, miR-106b /93/25 et miR-24 [6, 7].

L'un des autres prometteurs nouveaux miARN pour organe solide tumeurs comprend miR-206 [8]. Ce miRNA particulier appartient à un groupe de «myomiRs» qui est impliqué dans le muscle squelettique de développement [9]. Après avoir été associée à de nombreuses autres maladies comprenant les maladies cardiaques, la maladie pulmonaire obstructive chronique et la maladie d'Alzheimer, son rôle dans l'oncogenèse reçu, y compris un examen plus récemment, le rhabdomyosarcome, le cancer du poumon, le cancer colorectal, schwannomes, et le cancer gastrique [8, 9]. Bien élevé dans quelques types de cancer, y compris de l'ovaire et de Waldenström, miR-206 est principalement supprimée dans les tumeurs d'organes solides [9]. miR-206 a été montré précédemment pour inhiber la prolifération du cancer gastrique en partie par la suppression de la cycline D2 [10]. Dans cette enquête, nous nous sommes concentrés sur le rôle de miR-206 dans l'oncogenèse du cancer gastrique par la voie c-Met, qui a toujours été une voie de signalisation influent pour l'oncogenèse dans une variété de tumeurs [11]. c-Met a été prédit et démontré que le gène cible de plusieurs miARN miR-206, y compris [9, 12].
de

Résultats Suppression de miR-206 conduit à une augmentation de c-Met l'expression dans le cancer gastrique

en temps réel une analyse par RT-PCR a été réalisée pour détecter l'expression de miR-206 dans 40 spécimens de cancer de l'estomac et des tissus normaux. niveaux miR-206 dans la plupart des échantillons de tissus de tumeur gastrique (34/40) se sont révélés être significativement plus faible que les tissus normaux (figure 1A). l'expression de miR-206 était inversement proportionnelle au niveau de c-Met observé dans les échantillons de tumeur (figure 1B). La plupart des échantillons de tumeurs, avec une diminution de l'expression de miR-206, ont montré un pourcentage élevé (> 50%) de c-Met coloration. A l'inverse, les tumeurs avec expression normale de miR-206 montré une expression très faible ou négative c-Met.

miR-206 induite par arrêt G1 et la prolifération cellulaire inhibée, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques AGS

Comme expression de miR-206 a diminué dans les échantillons de cancer de l'estomac, nous avons cherché à déterminer si l'introduction de miR-206 a eu un effet biologique sur les cellules AGS. les cellules AGS transfectées avec la molécule miR-206 a montré une inhibition de la croissance cellulaire par rapport au témoin négatif en fonction du test au MTS (figure 2A). Analyse FACS des cellules ont présenté un arrêt G1 du cycle cellulaire (S1 figure). Le nombre de colonies a également été réduite par transfection de miR-206 (figure S2).

miR-206 peut inhiber la migration et l'invasion des cellules AGS (figure 2B et la figure S3). Une réduction spectaculaire de la migration vers les cavités inférieures a été observée dans miR-206 cellules AGS transfectées (86 ± 15 vs 165 ± 16 dans les cellules AGS, P
< 0,01, n = 3). En outre, les cellules transfectées avec miR-206 ont montré que l'invasivité HGF induite a également été entravée de façon significative après miR-206 transfection (57 ± 12 vs 116 ± 14 dans les cellules AGS, P
< 0,01, n = 3).

miR-206-régulée expression de c-Met et les protéines liées au cycle d'autres cellules

Nous avons déjà identifié c-Met comme une cible directe de miR-206 [9]. L'analyse Western blot a confirmé que l'expression de c-Met a été réduite de miR-206 dans la transfection de cellules AGS (figure 3). En même temps, miR-206 ectopique également régulée à la baisse l'expression de la CDK4, le p-Rb, p-Akt et le p-ERK.

La régulation négative de c-Met a inhibé la prolifération des cellules gastriques du cancer, l'invasion et la migration

ensuite, c-Met siRNA spécifique a été d'abord utilisé pour diminuer l'expression de c-Met dans les cellules AGS (S4 Fig). MTS essais ont été effectués afin de détecter la prolifération des cellules. les cellules AGS transfectées avec le c-Met ARNsi ont montré une réduction de la croissance cellulaire par rapport aux cellules témoins négatives (figure 4A; 25,10 ± 3,81% de réduction). La migration HGF induite et l'invasion ont diminué lors de la comparaison de c-Met siRNA cellules transfectées à des cellules de contrôle transfectées négatives. Comme cela est indiqué sur la figure 4B et S5 figure, la diminution de la migration (88 ± 10 vs 155 ± 15 P < 0,01; n = 3) et de l'invasion (72 ± 7 vs 126 ± 12 P < 0,01; n = 3) ont tous deux été statistiquement significative.

croissance tumorale introduction de miR-206 supprimé in vivo

Nous avons ensuite étudié si la surexpression de miR-206 pourrait réprimer la croissance tumorale in vivo
. Après 8 semaines, les volumes de tumeur moyennes étaient significativement plus faibles à partir de cellules infectées par le lentivirus exprimant miR-206, par comparaison avec le contrôle (figure 5).

Discussion

Le cancer gastrique est resté un important pour la santé soins fardeau mondial, malgré des années de recherche [1]. Selon l'OMS, le cancer gastrique reste l'un des étiologies de cancer top avec un taux élevé de mortalité [1]. Comme avec d'autres tumeurs d'organes solides, il est de plus en plus évident qu'une meilleure compréhension de l'oncogenèse de la tumeur est nécessaire d'améliorer le pronostic de ces patients. Être répandue dans les pays asiatiques, les données apparaissent sur le rôle des miARN sur le développement ou la suppression des cancers gastriques [6].

miARN ont une double fonction en termes de développement de cancer gastrique [6, 13]. Certains miARN sont des suppresseurs de tumeurs et d'autres sont oncomiRs [6]. Ueda et al. trouvé 22 miARN surexprimés et 13 downregulated dans le plasma des patients atteints de cancer gastrique [13]. Les cibles qui sont à l'étude dans le cas du cancer gastrique incluent les régulateurs de p16, par l'intermédiaire de miR-24, et p21 par miR-222/221 et miR-106b /93/25 [6]. D'autres, comme miR-21, peuvent être régulés à la hausse dans jusqu'à 92% des échantillons de tissu du cancer gastrique [14]. Les candidats identifiés dans le cancer gastrique servant suppresseurs de tumeur comprennent miR-181b, miR-101 et miR-486 [6]. Par exemple, miR-101 est considéré comme cible EZH2, Cox-2, Mcl-1 et Fos [15]. miR-486 est pensé pour affecter OLFM4, affectant éventuellement l'apoptose en aval [16].

Après avoir établi que la majorité des miARN servent de suppresseurs de tumeurs, nous avons étudié la voie c-Met dans le cancer gastrique. Dans l'étude de la voie c-Met pour rhadbomyosarcoma, nous avons trouvé l'importance de cette voie dans le sarcome [9]. c-Met est connue pour être dérégulée dans le cancer gastrique [11, 17-19]. MET proto-oncogène codant pour une protéine appelée facteur de croissance des hépatocytes (HGF) du récepteur qui possède une activité de tyrosine-kinase [18]. Nous trouvons normalement exprimé uniquement dans les cellules souches, mais ont aussi vu sa dysrégulation dans l'oncogenèse [18]. Dans cette étude, nous avons pu confirmer que c-Met est significativement impliquées dans le cancer gastrique et son rôle en tant que cible de miR-206 est essentiel dans l'oncogenèse.

la progression du cycle cellulaire est dérégulé dans le cancer gastrique. Sur la base des rapports précédents, la cycline D2 est élevée dans le cancer gastrique quand miR-206 est affectée [10]. miR-206 a été représenté comme un marqueur pronostique puissant [10]. Sa régulation négative est associée à la survie globale plus courte. Restauration de miR-206 conduit à G0 /G1 arrêt du cycle cellulaire, ce qui confirme son rôle de suppresseur de tumeur. Notre travail a également montré dysrégulation du cycle cellulaire avec CDK4 et phosphorylée-Rb étant affectée. CDK4 est un membre de la famille des kinases cycline-dépendante avec des ser /thr activité protéine kinase. Elle conduit à la progression de la phase G1. En outre, la kinase conduit à la phosphorylation de Rb, qui est un gène suppresseur de tumeur impliqué dans la progression du cycle cellulaire.

Bien que des résultats similaires ont été confirmés dans l'estomac, cancer de l'ovaire et du sein, le rôle de miR-206 semble pour avoir un effet opposé dans le cancer du colon [6, 20]. Une corrélation inverse a été notée entre miR-206 et KLF4 dans un panel de cancers du côlon humain [20]. KLF4, qui possède des propriétés oncogéniques dans d'autres cancers comme les cancers du sein, de la peau et des poumons, fonctionne comme un suppresseur de tumeur dans le cancer du côlon [20]. Son promoteur est hyper-méthylé avec des niveaux élevés de miR-206 menant à la régulation négative de KLF4 [20]. Ces résultats indiquent que miR-206 ne peut pas fonctionner de manière similaire dans toutes les cellules épithéliales, ce qui annule une approche unique dans chimiothérapeutiques.

Dans la présente étude, nous avons identifié un mécanisme de régulation de l'expression du gène c-Met par miR-206 dans le cancer gastrique. c-Met surexpression suivante miR-206 downregulation semble être l'étiologie commune pour la pathogenèse du cancer gastrique dans la majorité des échantillons examinés dans cette étude. En résumé, nous avons démontré que miR-206 modulant négativement la voie de signalisation c-Met impliqués dans la prolifération cellulaire et la migration. Nos études nous espérons avoir des conséquences cliniques importantes dans le traitement du cancer gastrique. miR-206 est un candidat à la fois la détection immunohistochimique de petites tumeurs et cible possible pour les thérapies biologiques.

Matériaux et

Culture cellulaire

Le cancer gastrique humain lignée cellulaire de méthodes, AGS, achetés auprès de l'ATCC (Manassas, VA), a été cultivé dans de Ham F-12 Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) additionné de 10% de sérum de veau fœtal. (FBS; Hyclone, Logan, UT)

éthique déclaration

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations et l'approbation du Comité de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université médicale de Wenzhou (Numéro de permis: WZMCOPT-043011). Quarante échantillons de tumeurs gastriques et les tissus gastriques de donneurs normaux ont été obtenus à partir du deuxième hôpital affilié de l'Université médicale de Wenzhou (Wenzhou, Chine). la collecte de l'échantillon a été approuvé par le Comité d'éthique de l'Université médicale de Wenzhou sur la recherche impliquant des sujets humains, et le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de chaque cas. Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la Déclaration d'Helsinki et les lois nationales.

Quantitative
RT-PCR

L'ARN total a été extrait à partir d'échantillons de tumeur gastrique et de contrôles humains normaux avec le réactif Trizol (Invitrogen). 10 ng d'ARN total ont été utilisés pour la synthèse d'ADNc par le kit TaqMan microARN Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster City, CA), et le niveau d'expression de miR-206 a été quantifiée par le Taqman microARN Assay (Applied Biosystems). En temps réel RT-PCR a été réalisée en utilisant le système de PCR en temps réel Applied Biosystems VIIa 7 (Applied Biosystems).

coloration immunohistochimique de

Sections c-Met de fixés au formol et inclus en paraffine échantillons de tumeurs gastriques humaines (5 um) ont été faites, puis de-paraffinées avec du xylène et l'éthanol. Les lames ont été traitées avec 0,3% de peroxyde d'hydrogène, puis incubées pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps c-Met à la dilution 1: 300 (CST, Beverly, MA). La coloration immunohistochimique a été réalisée en utilisant le EnVision HRP /système de détection de DAB (Dako, Glostrup, Danemark).

La prolifération cellulaire test

cellules AGS ont été étalées à 2000 cellules par puits dans des plaques à 96 puits ( Costar, High Wycombe, Royaume-Uni) pour chaque transfection. Les transfections ont été réalisées avec le réactif (Lipofectamine RNAiMAX; Invitrogen), en triple exemplaire. Pour chaque puits, 50 nM miR-206 imite molécule (Ambion, Austin, TX), ou un contrôle négatif (Ambion) transfection a été employé. Après 72 heures de culture, la prolifération cellulaire a été évaluée par MTS essai (CellTiter 96 AQueous; Promega, Madison, WI).

Transwell tests de migration

24 heures après la transfection, les cellules ont été récoltées par AGS trypsinisation et lavées une fois avec une solution de D-Hanks (Invitrogen). Pour mesurer la migration cellulaire ou d'invasion, 8 um culture de la taille des pores ou des inserts de Matrigel (Transwell; Costar) ont été placés dans les puits de plaques de culture 24 puits. Dans la chambre inférieure, 400 ul F-12 contenant 10% de FBS et on a ajouté 20 ng /ml de HGF. Ensuite, 5x10 ^{4 cellules ont été ajoutées à la chambre supérieure. Après 20 heures d'incubation, les cellules qui avaient migré à travers les pores ont été colorées avec du cristal violet et observées au microscope (Zeiss, Oberkochen, Allemagne) en utilisant un objectif 20X.}

Analyse par transfert de Western

les cellules AGS (1x10 ^{5) ont été ensemencées dans des plaques 6 puits et cultivées dans F-12 pendant 24 heures avant la transfection. 72 heures après la transfection, les cellules ont été lavées avec du PBS froid et on les soumet à un tampon de lyse (35 mM de Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /L de dodécyl sulfate de sodium [SDS], dithiothréitol 100 mM). Des lysats de protéines (20 pg chacun) ont été séparés en utilisant 8% de SDS-polyacrylamide électrophorèse sur gel, puis transférés par électro sur des membranes de filtration de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées avec un tampon contenant 5% de lait écrémé dans du PBS avec 0,05% de Tween-20 pendant 2 heures et on fait incuber pendant une nuit avec un anticorps à 4 ° C. Après un second lavage avec du PBS contenant 0,05% de Tween-20, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase (Millipore, Darmstadt, Allemagne) et développés avec un kit de détection de chimioluminescence améliorée (Pierce, Rockford, IL). GAPDH a été utilisé comme témoin de chargement. Anticorps pour CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, p-Akt, c-Met et GAPDH provenaient de Cell Signaling Technology (Beverly, MA).}

tests de siRNA

c-Met spécifique siRNA (Ambion) et siRNA contrôle négatif (Ambion) ont été utilisés pour réguler négativement l'expression de c-Met dans les cellules AGS. 50 nM de c-Met-spécifique siARN ou siRNA contrôle négatif a été transfecté dans les cellules AGS avec Lipofectamine RNAiMAX. test au MTS a été effectué 72 heures après la transfection, tandis que Transwell et Matrigel essais ont été effectués 24 heures après la transfection, comme décrit ci-dessus.

In vivo
croissance tumorale test

expression pré-microARN construit lenti-miR-206 et le vecteur de commande pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP ont été achetés chez système Biosciences (Mountain View, CA). les cellules AGS ont été infectées par le lentivirus exprimant miR-206 ou du contrôle négatif. des souris nude femelles âgées de 6 semaines ont été inoculés avec des cellules AGS (8x10 ^{6) l'expression de miR-206 ou des témoins négatifs dans leurs flancs, puis sacrifiés au bout de 8 semaines. La taille des tumeurs a été mesurée et le volume a été calculé en utilisant la formule: ( L
x W
2) x 0,5 ( L
, longueur; W
, largeur), selon la méthode précédemment décrite [21]. Toutes les études et les procédures ont été approuvées par le Comité des soins et l'utilisation des animaux de l'Université médicale de Wenzhou.}

L'analyse statistique

Toutes les données ont été présentés comme la moyenne ± SEM. Les résultats indiqués sont exprimés en valeur moyenne ± écart-type des résultats obtenus à partir d'essais en triple dans une expérience. Les résultats représentent ceux obtenus dans trois expériences distinctes. Les différences entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins ont été analysés en utilisant t
-test de l'étudiant. La signification statistique a été acceptée à P
< 0,05.

Informations complémentaires
S1 Fig. Analyse FACS des cellules AGS transfectées avec miR-206.
cellules AGS ont été recueillies 48 heures après transfection avec miR-206 ou NF, colorées avec de l'iodure de propidium et analysées par cytométrie en flux. Dix mille cellules ont été évaluées dans chaque échantillon. Les résultats les plus représentatifs de trois expériences indépendantes sont représentées
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s001
(TIF)
S2 Fig. La formation de colonies dosage.
cellules AGS transfectées avec miR-206 ou NC ont été ensemencées à faible densité. Au bout de 7 jours, la formation de colonies a été déterminé par coloration au cristal violet. Les résultats typiques dans trois expériences indépendantes sont présentés
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s002
(TIF)
S3 Fig. Les effets de miR-206 sur les cellules AGS ont été évalués avec Transwell et Matrigel essais.
Le nombre de cellules ayant migré à travers les pores d'insertion de la culture (haut) ou avaient envahi à travers les pores d'insertion Matrigel (vers le bas) a été photographié en utilisant un 20X objectif de microscope
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s003
(TIF)
S4 Fig. . La régulation négative de c-Met par siRNA
analyse Western blot a été réalisée pour confirmer la suppression de l'expression de c-Met après lipofectamine transfection de cellules AGS soit avec c-Met siRNA ou un contrôle négatif (NC): doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s004
(TIF)
S5 Fig. Les effets de c-Met siRNA sur les cellules AGS ont été évalués avec Transwell et Matrigel essais.
Le nombre de cellules ayant migré à travers les pores d'insertion de la culture (haut) ou avaient envahi à travers les pores d'insertion Matrigel (vers le bas) a été photographié à l'aide un objectif de microscope 20X
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s005
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