Plos ONE: Deregulirana Izražanje SRC, Lyn in CKB kinaz, ki jih DNA metilacije in njeno morebitno vlogo v Rak želodca invazivnosti in metastaz

Povzetek

kinaz so nižji stopnji modulatorji in efektorji številnih celičnih signalnih kaskad in igrajo ključno vlogo pri razvoju neoplastične bolezni. V tej študiji smo želeli oceniti SRC, Lyn in CKB beljakovin in mRNA izražanja, kot tudi njihovo promotor metilacije, raka želodca. Ugotovili smo, povišano izražanje SRC in Lyn kinaze mRNA in beljakovin, vendar znižane ravni CKB kinaze, spremembe, ki imajo lahko pomembno vlogo pri invazivnosti in metastaz želodčnih tumorjev. Izražanje treh preučevanih kinaz je bila povezana tudi z myc onkogena izražanja, morebitne biomarker za rakom želodca. Razumevanje mehanizmov, ki uravnavajo izražanje teh genov, smo ocenili promotor DNA metilacije v treh kinaz. Ugotovili smo, da zmanjša SRC
in Lyn
metilacija in povečala CKB
metilacija je bila povezana z rakom želodca. Znižana SRC
in Lyn
metilacija je bila povezana s povečano raven mRNA in izražanja proteinov, kar kaže, da DNA metilacija sodeluje pri urejanju izražanje teh kinaz. Nasprotno, zmanjšana CKB
metilacije so opazili pri vzorcih z zmanjšano mRNA in izražanja proteinov, je bilo ugotovljeno, kaže CKB izraz, ki se le delno ureja metilacije DNA. Poleg tega smo ugotovili, da so spremembe v DNA metilacijskega vzorca v treh proučevanih kinaz povezano tudi z želodčno pojavom raka, napredovalega raka želodca, globlje tumorske invazije in prisotnosti metastaz. Zato, SRC, LYN in CKB izraz ali DNA metilacija so lahko koristne označevalcev za napovedovanje napredovanje tumorja in usmerjenost v strategije za boj proti raku

Navedba. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Črna gora RC, et al. (2015) Deregulirana Izražanje SRC, Lyn in CKB kinaz, ki jih DNA metilacije in njeno morebitno vlogo v Rak želodca invazivnosti in metastaz. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492

Urednik: Jose G. Trevino, University of Florida, UNITED STATES

Prejeto: 27. maj 2015; Sprejeto: 25. september 2015; Objavljeno: 13. oktober 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. Ta študija je bila podprta z Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; štipendijeǗ072 /2012-5 in 402283 /2013-9, štipendija za MCS in RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa storiti Pará (FAPESPA; podelitev #ICAAF 123/2014 za RRB) in Fundação de Amparo à Pesquisa storiti Estado de Sao Paulo (FAPESP; dotacijaÈ9 /07145-9, štipendija za MFL) kot štipendije in štipendije nagrade. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrta najpogostejša vrsta raka in drugi najpogostejši vzrok smrtnosti zaradi raka na svetu [1]. Zdravljenje GC v poznejših fazah še vedno težko in prognoza je še vedno slaba, delno kot posledica lokalne ponovitve, tumorske invazije in /ali metastaz. Splošno relativno 5-letno preživetje trenutno manj kot 20% [2]. Boljše razumevanje biologije napredovanje tega neoplazije je ključnega pomena za zmanjšanje umrljivosti z razvojem novega upravljanja pacientov in terapevtskih strategij.

Phosphotransferases, znan tudi kot kinaze, so nižji stopnji modulatorji in efektorji več celične signalne kaskade in igrajo ključno vlogo pri razvoju neoplastične bolezni [3]. Do danes je bilo več beljakovin droge-kinaze v stiku registrirana za klinične poskuse [4]. Smo že opravili pregled za ugotavljanje kinaz proteine, izražene v GC uporabo Capture Sestavljeni masne spektrometrije [5, 6] (S1 datotek) ter 22 kinaze proteinov, vključno SRC, Lyn in CKB, so bile odkrite (S1 tabelo). Te tri kinaz so bili izbrani za nadaljnje preiskave (S1 sl).

SRC je bil prvi proto-onkogena odkrili, in ima osrednjo vlogo pri celičnih signalov v poti. Aberrant dejavnost SRC je opaziti v številnih oblikah raka, vključno z GC [7-9], in je lahko pomembno pri razvoju tumorjev in napredovanja [10, 11]. Mitogenskim funkcija SRC je vsaj delno posredovana z indukcijo myc, regulatorja celičnega cikla in transkripcijskega faktorja [12, 13]. Naša skupina predhodno opisano myc uravnavanjem v človeškem GC in primatih N-metil-nitrozouree obdelani nehumanih [14-19]. Ker aktivacija SRC, kot tudi drugih kinaz, ima pleiotropični učinke, ki so odvisni od vrste celic in kontekst [20], je še vedno pomembno razumeti možno povezavo med kinaz in MYC izražanja v želodcu karcinogenezi in molekularni mehanizem vključeni v njihovo ureditev.

LYN je še en član družine SRC za kinaz in Lyn
gen se nahaja na kromosomu 8q13. Naša skupina že poročali prisotnost dobičkov v kromosomu 8 (na katerega je se nahaja tudi MYC
gen) v primerih, GC iz Severne Brazilije [16, 21-23], in v vseh celičnih linijah GC sedežem od neoplazij v ta populacija [24, 25]. Zato se lahko ta kromosom vsebuje pomembne genov, ki sodelujejo pri želodčnem rakotvornost. Kolikor nam je znano, nobena predhodna študija je raziskovala vlogo Lyn in njeno ureditev v GC. Vendar je bila LYN prekomerno poročali v več rakavih obolenj [26-32]. Poleg tega, da je bila uredba o Lyn
s metilacije DNA dokazano v debelem črevesu in Ewingov sarkom [33, 34], in Lyn
metilacija je bilo opaziti v nekaterih krvotvornih in ne-krvotvorne celične linije [35]. DNA metilacija je molekularna modifikacija DNK, ki je tesno povezana s funkcijo genov in celic tipa specifično funkcijo genov [36]. Poleg tega lahko DNA metilacija biti robusten biomarker, saj je veliko bolj stabilen kot RNA in beljakovin in je zato obetavna tarča za razvoj novih pristopov za diagnosticiranje in prognozo raka [36].

CKB je ena od dveh citosolskih izo oblik kreatinin kinaze in lahko sodeluje v presnovnih procesih, ki vključujejo glikolize v non-mišičnih celic [37]. V nasprotju z običajnimi celic, ki primarno proizvajajo energijo s pomočjo oksidativne fosforilacije, večina rakave celice raje aerobne glikolize, ki je znan kot učinek Warburg [38]. Zanimivo je, da se zdi, da MYC onkogena aktivirati več glukoze prevoznike in glikoliticna encime, s čimer prispeva k učinku Warburg [39]. Naš prejšnji proteomskimi Študija je pokazala, da je bilo več proteinov, ki sodelujejo v procesih proizvodnje energije liberaliziran v vzorcih GC in okrepiti učinek Warburg v tem novotvorb [40]. Vloga CKB v GC še vedno slabo razumljen: nekateri transcriptomic študijah poročali z uravnavanjem CKB
v vzorcih GC [41, 42], medtem ko drugi so pokazali, CKB
downregulation [43]. Poleg tega, kot za Lyn
gena, CKB
metilacija je bila prej opisana v hematoloških in trdnih raka celičnih linij, vključno z GC celičnih linij [44]. Metiliranje zdi CKB
da so povezani z njeno zmanjšano raven izražanja; Vendar, nadaljnja preiskava je še vedno treba razumeti ureditev CKB
z epigenetske spremembe.

Zato smo najprej namenjen za oceno mRNA in proteinov izražanje SRC, Lyn in CKB v veliki nabor vzorcev GC. Nato smo ocenili, ali se ti geni lahko uredi z metilacije DNA iz želodca rakotvornost. Poleg tega smo raziskali morebitno povezavo med kinaze izražanja ali metilacije in kliničnih spremenljivk, kot tudi myc izražanja in metilacije.

Material in metode

Vzorce tkiva

kinaze izražanja in vzorci metilacije je bila ocenjena v 138 parov vzorcev GC in njihovimi ustreznimi želodcu vzorcev non-neoplastične tkiv, pridobljenih iz bolnikih, ki so želodca v severni Braziliji. Vsi bolniki so imeli negativne zgodovine izpostavljenosti bodisi kemoterapije ali radioterapije pred operacijo, in ni bilo Sopojavnost drugih diagnozo raka. Ta študija je odobril Odbor za etiko de University Hospital João Barros Barreto (protokolļ737). Pisna privolitev z odobritvijo odbora za etiko je bilo pridobljeno iz vseh bolnikih pred osebek zbirko.

Del vsakega raztelesiti tumorja vzorca je formalinu fiksnih in vstavljen v parafin (FFPE). Področja FFPE tkiva smo obarvali s hematoksilin-eozinom za histološko ocenjevanje ali se uporablja za imunohistokemični analizo (IHC). Dodatne porcije vsakega tumorja in paru osebki ne-neoplastične tkiv sta zaskočno zamrznjene v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C, dokler protein in čiščenje nukleinskih kislin.

Vsi vzorci so bili razdeljeni po Lauren [45 ], in tumorji so potekali v skladu z merili TNM počivališčih [46]. Prisotnost Helicobacter pylori
, razred I rakotvorna snov, želodčnih vzorcih je bila odkrita s testom hitro ureaze, in njegovo virulentnost dejavnik citotoksičnost povezan gen A (CagA gen) je bilo zaznati s PCR z uporabo DNA očistili hkrati z beljakovinami in mRNA, ki je pred tem opravljal naša skupina [47]. Epstein-Barr virus (EBV), je bila odkrita s RNA v situ hibridizacija [47].

Za 49 od teh parov neoplastične in non-neoplasticnih vzorcev, smo ocenili myc radioinkorporacijo mRNA izraz in statusni metilacija podatkov predhodno naša skupina objavila [18].

protein, mRNA in DNA čiščenje

Skupaj beljakovin, so mRNA in DNA hkrati izolirali iz vzorcev želodca tkiva z uporabo /RNA /beljakovin Kit AllPrep DNA ( Qiagen, Nemčija), v skladu z navodili proizvajalca. Pelet protein smo raztopili v pufru, ki vsebuje 7 M ureo, 2 M tiosečnino, 4% čeljusti, 50 mM DTT, 1% proteaze Inhibitor koktajl (Sigma-Aldrich, ZDA) in 0,5% vsak Fosfataza Inhibitor Cocktail 1 in 2 (Sigma -Aldrich, ZDA), ki ga je naša skupina [48] je pred tem opravljal. Koncentracije proteinske smo določili po metodi Bradfordu (Sigma-Aldrich, ZDA). Koncentracija in kakovost RNA smo določili s pomočjo NanoDrop spektrofotometer (Kisker, Nemčija) in 1% agarozni geli oz. Vzorce smo shranili pri -80 ° C do uporabe.

Beljakovine radioinkorporacijo analiza

odseki tumorsko tkivo (3 ali 4-mm debeline) smo deparaffinized v ksilenu in rehidrirane v stopenjski seriji etanola. Po toplotno inducirano pridobivanje epitop, so bili odseki tkiva inkubirali z monoklonskimi protitelesi primarna miši proti SRC (redčenje 1: 400; klon 28, Life Technologies, ZDA), Lyn (redčenje 1: 400; klon C13F9, Life Technologies, ZDA) ali CKB (redčenje 1: 250; HPA001254, santa Cruz Biotechnology, ZDA). Univerzalna peroksidazo konjugirano komplet sekundarna protitelesa (LSAB sistem, DakoCytomation, ZDA) smo uporabili za detekcijo. Uporabili smo 3,30-diamino-benzidin /H _{2O 2 (DakoCytomation, Danska) kot kromogena in hematoksilinom kot za nasprotno. Protein radioinkorporacijo pozitivni vzorec je bil definiran kot eden ima 10% ali več neoplastičnih celic, ki so bili pozitivni na protein.}

Beljakovine izraz analiza

Western analizo blot smo izvedli kot je naša skupina prej opisali [49]. Zmanjšana proteina (25 mikrogramov) iz vsakega vzorca, smo ločili z 12,5% homogeno SDS-PAGE in-elektro osušili na PVDF membrano (Haybond-P, GE Healthcare, ZDA). Membrane PVDF barvamo bil blokiran s fosfatnim pufrom, ki vsebuje 0,1% Tween 20 in 5% mleka z nizko vsebnostjo maščobe in inkubiran preko noči pri 4 ° C z ustreznimi primarnimi protitelesi: anti-SRC (razredčenju 1: 1000; klon 28, Life Technologies, ZDA), anti-LYN (redčenje 1: 1000; klon C13F9, Life Technologies, ZDA), anti-CKB (razredčitev 1: 400; HPA001254, santa Cruz Biotechnology, ZDA), in anti-ACTB (redčenje 1: 250; Ac -15, Life Technologies, ZDA). Po obsežnem izpiranju smo dodali peroksidazo konjugirano sekundarna protitelesa za 1 uro pri sobni temperaturi. Imunološko trakovi smo prikazali z metodo Western blot Luminol reagenta, in slike so bili pridobljeni z uporabo ImageQuant 350 digitalni sistem slike (GE Healthcare, Švedska). ACTB je bil uporabljen kot referenčni nakladanje nadzor.

mRNA izraz analiza

Najprej RNA je bila reverzno prepisana z visoko zmogljivostjo cDNA Archive komplet po protokolu proizvajalca (Life Technologies, ZDA) . Komplementarna DNA smo nato pomnožili s realnem času povratne prepisovanje kvantitativne PCR (RT-qPCR) z TaqMan sonde, kupljenih kot Izdelki Testi-na-zahtevo za izražanja genov (Life Technologies, ZDA) in 7500 Fast PCR v realnem času instrumenta (Life Technologies , ZDA). GAPDH
gen je bil izbran kot notranje kontrole za vnos RNA in obratno prepisu učinkovitost. Vse RT-qPCRs smo izvedli v treh izvodih tako ciljnih genov ( SRC
: Hs01082246_m1; LYN
: Hs00176719_m1; CKB
: Hs00176484_m1) in notranje kontrole ( GAPDH
. NM_002046.3)

relativna kvantifikacija genske ekspresije je bila izračunana v skladu z Livak in Schmittgen [50]. Ustrezni kontrolni vzorec, ki je bila imenovana kot kalibratorja iz vsake tumorja.

DNA metilacija analiza

Vzorec metilacija in pogostost kinaze genov je ocenjevala metilacije specifične PCR (PPN) [51]. Komplet EZ DNK Metiliranje-strelo ™ (Zymo Research, ZDA) je bila uporabljena za spreminjanje gDNA s bisulfita obdelavo, pretvorbo nemetilirane cytosines v uracili in izstopom metiliranih cytosines nespremenjena. Posebni primerji za nosilci gena, so opisani v tabeli bile 1.

PCR reakcije izvedemo z uporabo 0,1 mol /L dNTP, 2 mol /L MgCl _{2, 0,5 mol primerjev, 1,25 U Taq DNA polimeraze, in 100 ng bisulfit modificiran DNA. Po začetnem denaturacijo za 5 min pri 94 ° C, smo 40 ciklov pri 94 ° C za 45 sekund, temperaturo kaljenja (tabela 1) za 45 sekund in 72 ° C za 30 sekund izvedemo, čemur sledi končno razširitvijo za 5. min pri 72 ° C. PCR produkt so neposredno naložen na 3% agaroznem gelu in elektroforezo. Gel smo obarvali z SYBR ^{® Safe DNA Gel Stain (Life Technologies, ZDA) in neposredno vizuali pod UV osvetlitvi. Kot pozitivno kontrolo za vse reakcije PPN, je gDNA vzorec popolnoma methylated uporabo CpG Methylase (SssI, New England BioLabs, ZDA) po navodilih proizvajalca. Poleg tega so primerji za zaznavanje zaporedja divjega tipa se uporabljajo za spremljanje popolno pretvorbo DNA, dobljene v bisulfita reakciji}}

Vzorci so bili stratificirani, kot sledi: 1). Vzorec je bil definiran kot hypomethylated ko pozitivna ojačitev izdelek je bila odkrita šele v PCR s specifičnimi primerji za nemetiliran sekvenc; 2) vzorec je bil definiran kot hypermethylated ko je bil pozitiven pomnoževanje odkrita samo v PCR s specifičnimi primerji za metiliranih sekvenc; 3) vzorec je bil opredeljen kot delno methylated, ko je bil pozitiven pomnoževanje odkrili v PCR z dvema ali osnovne sklope.

specifičnost primerji "in rezultati izrabe PPN so bile potrjene z uporabo bisulfit zaporedja PCR (BSP pristop) [52] . BSP je bila uporabljena tudi za oceno odstotka metilacije. Primerji in anneling temperature BSP so opisani v tabeli 1. Po pomnoževanja so bili fragmenti očistili z NucleoSpin gel in PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Nemčija), ligiramo v pGEM T-enostaven vektor (Promega, Nemčija) in klonirali v pristojni E
. coli
JM109 celice. Po inkubaciji smo izbrali bele kolonije za PCR z M13 sprednjim (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') in M13 vzvratni (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') primerji [53]. Po začetnem denaturacijo za 3 min pri 94 ° C, PCR pomnoževanje sestavljalo 35 ciklov pri 94 ° C 30 s, 55 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 90 sekund bile izvedene, čemur sledi končno razširitvijo za 5 min pri 72 ° C. PCR produkt smo vizualizirali na agaroznem gelu. Šest kloni so bili izbrani za čiščenje in zaporedje v ABI310 avtomatsko sekvencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Vse sekvence so bile usklajene z BioEdit v7.0.5 [54], in analize metilacije smo izvedli s programsko opremo BIQ Analyzer [55]. Odstotek metilacije za vsak vzorec, je bila izračunana tako, da se število metilni CpGs s skupnim številom CpGs zaporedje (CpGs v vseh šestih klona).

Statistične analize

Podatki so prikazani kot frekvence, srednjo in interkvartilni razponu (IQR). Test Shapiro-Wilk smo uporabili za oceno porazdelitve starosti, mRNA, proteinov izražanja in odstotek podatkov metilacije in določiti ustrezno naknadno test za statistične primerjave. Test Mann-Whitney je bila uporabljena za razišče možne povezave med kinaze mRNA ali izražanja proteinov in kategorične spremenljivke, kot so radioinkorporacijo metilacije vzorec in clinicopathological funkcije. Test Mann-Whitney smo uporabili za preiskavo možne povezave med odstotkom metilacije in radioinkorporacijo in clinicopathological funkcije. Wilcoxonov preizkus smo uporabili za primerjavo odstotek metilacije med pari neoplastičnih in ne-neoplastičnih vzorcev. Povezava med kategorične spremenljivke smo analizirali s pomočjo Chi-kvadrat (χ ^{2) test. Test korelacije Spearman je bila uporabljena za oceno možne korelacije med mRNA in izražanja proteinov, kot tudi promotor metilacije. A p-vrednost manjša od 0.05 smo imeli za signifikanten. je bila uporabljena Bonferroni prilagoditev p-vrednosti, ko je bilo opravljenih več primerjave, pri čemer je vsebnost alfa se deli s številom primerjav.}

Rezultati

kinaze izraz v želodčnih tumorjev

Non-atipične želodčne celice se ni prisotna SRC ali LYN radioinkorporacijo (Slika 1A in 1C). Vendar je SRC radioinkorporacijo opazili pri displasticnih celicah. Celične membrane in citoplazme radioinkorporacijo za SRC in Lyn je bila odkrita v neoplastične celice (slika 1B in 1D), in LYN predstavil tudi nukleinske radioinkorporacijo. CKB radioinkorporacijo bila odkrita v citoplazmi ali v celične membrane v ne-neoplastičnih želodčnih celic (slika 1E). V nasprotju s tem, GC celice ni sedanjo CKB radioinkorporacijo (slika 1F).

SRC, LYN in CKB radioinkorporacijo so odkrili pri 72 (52,2%), 66 (47,8%) in 0 (0%) tumorja vzorci. SRC in LYN radioinkorporacijo so bile povezane z višjimi stopnjami mRNA in beljakovin v vzorcih GC (p < 0,001, za vse primerjave; Mann-Whitney testu; slika 2A, 2C, 2E in 2G). Ravni beljakovin in mRNA iz SRC zvišali vsaj 1,5-krat (najmanj 50% povečanje izražanja) v 67 (48,6%) in 80 (58%), oziroma, GC vzorce glede na njihovo izravnane non-neoplastičnim želodca vzorci (slika 2B, 2D in 2K). Poleg tega so protein in ravni mRNA za Lyn v 36 (26,1%) in 72 (52,2%) GC vzorcev, oziroma (slika 2F, 2H in 2K) poveča na najmanj 1,5-krat. Nasprotno pa je bila downregulation iz CKB beljakovin in mRNA (vsaj 50% zmanjšanje izražanja) odkrili v 104 (75,4%) in 49 (35,5%) GC vzorcev, oziroma (slika 2I, 2J in 2K). Močna in neposredna povezava opazili med mRNA in izražanja proteinov za SRC (p < 0,001, ρ = 0,856, Spearman preizkus korelacija), LYN (p < 0,001, ρ = 0,762) in CKB (p < 0,001, ρ = . 0,819)

radioinkorporacijo iz SRC je bila povezana z radioinkorporacijo z Lyn (p < 0,001, χ ^{2 test), 52 (37,7%) vzorcev GC predstavljajo radioinkorporacijo obeh proteinov. Poleg tega so opazili neposredna povezava med SRC in Lyn beljakovin (p < 0,001, ρ = 0,556) in mRNA (p < 0,001, ρ = 0,779) izraz. Ravni CKB beljakovin in ekspresijo mRNA bilo obratno povezana z SRC (p < 0,001, ρ = -0,734; p < 0,001, ρ = -0,806, v tem zaporedju) in Lyn (p < 0,001, ρ = -0,643; p . < 0,001, ρ = -0,703, v tem zaporedju)}

Tabela 2 prikazuje rezultate za SRC, Lyn in CKB izražanja in clinicopathological značilnosti. Tumorji bolnikov s poznim nastopom GC predstavil bistveno višjo SRC in Lyn beljakovin (za IHC in zahodni blot) in mRNA (za RT-qPCR) izražanja, kot tudi zmanjšano CKB beljakovin izražanja, ki ga zahodni s sušenjem, v primerjavi s predčasno nastopom CG vzorce (p 0.05, za vse primerjave; tabela 2). Povečana beljakovine in mRNA izraz SRC in Lyn in zmanjša CKB izraz so bili povezani s fazi, globlje tumorske invazije, in prisotnost bezgavkah in oddaljenih zasevkov (p < 0,05 za vse primerjave; tabela 2)
<. p> postopno znatno povečanje SRC proteina (z Western blotting-om) in mRNA ekspresijo opazili ustreza stopnji tumorja (p < 0,008, za večino primerjav; Mann-Whitneyev preizkus sledilo popravkom Bonferroni, slika 3A in 3B) . V nasprotju s tem postopno pomembno zmanjšanje CKB beljakovin in ekspresijo mRNA smo opazili ustreza stopnji tumorja (p < 0,008, za večino primerjav, sl 3G in 3H). V zvezi z Lyn izražanja, nismo upoštevali pomembno razliko med stopnjami I in II ali med stopnjah III in IV. Vendar faze I in II so se bistveno razlikuje od stopenj III in IV (p < 0,008, za te primerjave, slika 3D in 3E).

kinaze genske vzorci metilacije v želodcu vzorcev

tabeli 3 prikazuje metilacijskega vzorca proučevanih proteinskih kinaz v neoplastičnih in ne-neoplastičnih želodčnih vzorcev s PPN. Približno 60% in 30% vzorcev GC predstavil pozitivno ojačanje samo z nemetiliran temeljni premaz niz (hypomethylated vzorcev) za SRC
in Lyn
geni, v tem zaporedju (slika 4A in 4B). Hipometilacija teh genov niso opazili v vsakem non-neoplastičnim vzorca. Zato je frekvenca SRC
in Lyn
Hipometilacija bil v GC bistveno višja kot v ne-neoplastične želodca vzorcev (p < 0,001, za vse primerjave, sledi χ ^{2 Test s Bonferroni popravki).}

analiza BSP potrdili analizo PPN. Z BSP, 82 (59,4%) neoplastične vzorcev in 0 (0%) ne-neoplastične vzorcev predstavila kloniranega zaporedje brez CpG metilacije v SRC
promotorja. Poleg tega 4 (2,89%) in 1 (0,72%) neoplastičnih in ne-neoplastičnih vzorcev predstavila kloniranega sekvenco brez CpG metiliranje v Lyn
promotor oz. Z BSP, odstotek SRC
[0,135 (0,31) v primerjavi
0,563 (0,23); p lt; 0,001] in LYN
[0,238 (0,40) v primerjavi
0,7063 (0,26); p lt; 0,001] metilacije je v neoplastične vzorcih nižja kot v ne-neoplastične vzorcev (slika 5A in 5B).

SRC
in Lyn
metilacije vzorce neoplastična in ne -neoplastic vzorci ker je ugotovljeno, da so povezani (p < 0,001, tako za analize; χ ^{2 test). Opazili smo, da 70/81 (86,4%) tumorjev z hypomethylated SRC
predstavljenih delno metilacije tega gena v izravnane ne-neoplastične vzorca. Poleg tega smo ugotovili, da 37/41 (90,24%) tumorjev z hypomethylated Lyn PODJETJA
predstavil delne metilacije tega gena v izravnane ne-neoplastične vzorca. SRC
in Lyn
delno metilacije v ne-neoplastične vzorcev je pogosteje opazili pri posameznikih, ki predložijo vzorcev tumorjev s hipometilacije tega gena v primerjavi s tumorji z delnim metilacije (p < 0,001, za oba analize) ali hypermethylation (p < 0,001, za oba analize). Poleg tega delno metiliran LYN
in ne-neoplastične vzorcev so pogosteje odkrili pri posameznikih, ki predložijo vzorcev tumorjev z delno metilacije tega gena v primerjavi s tumorji z hypermethylation (p = 0,004). Z BSP, smo tudi ugotovili, da je odstotek ZRC
(p < 0,001, P = 0.6902; Slika 5D) in Lyn
(p < 0,001, ρ = 0.739; Sl 5E ) metilacija neoplastične in ne-neoplastične vzorcev so povezana.}

CKB
delna in Hipometilacija so opazili pri obeh neoplastične in ne-neoplastične vzorcev. Vendar pa je 48 (39%) vzorcev GC predstavila CKB
hypermethylation (slika 4C), ki ni bil odkriti v ne-neoplastične vzorcev. Poleg tega je frekvenca CKB
-hypermethylated vzorcev je bila bistveno višja neoplastični v primerjavi z ne-neoplastične želodca vzorcev (p < 0,001) in je bila bistveno bolj pogosta tudi v CKB
delno metilacija GC kot v ne-neoplastične vzorcev (p < 0,001). Z BSP, odstotek CKB
metilacije je v neoplastične vzorcih višja kot v ne-neoplastične vzorcev [0,511 (0,42) v primerjavi
0,133 (0,12); p lt; 0,001; Slika 5C]. Klonirane sequences brez CpG metilacije je bila odkrita v 4 (2,89%) in 0 (0%) neoplastićnih in ne-neoplastične vzorcev oz.

CKB
metilacija vzorec neoplastična in ne -neoplastic vzorci zdelo, da je povezana (p = 0,014, s χ 2 preizkusa ^{). Analiza 2x2 z 2 testa χ je pokazala, da pari, v katerih predstavila hypermethylated vzorci tumorske CKB
in izravnana non-neoplastične vzorci predstavil Hipometilacija tega gena so bili pogostejši kot parov tumorjev z hypermethylation in ujema non-neoplastične vzorce z delnim metilacije (p = 0,0381), vendar ta ugotovitev ni statistično pomembna, če je bila uporabljena prilagoditev Bonferroni (prilagojena α = 0,05 /3 = 0,0167). Vendar s BSP, smo ugotovili, da je odstotek CKB
metilacija neoplastične in ne-neoplastične vzorcev so obratno korelacija (p < 0,001, ρ = -0,375; slika 5F).}

neposredna povezava opazili med SRC
in Lyn
vzorci metilacije v ne-neoplastične vzorcev (p < 0,001, ρ = 0.627). Poleg tega je bila odkrita Obratno sorazmerje med SRC
in CKB
(p < 0,001, P = -0.467) in Lyn
in CKB
(p < 0,001, ρ = -0,359) metilacija. Vendar pa v vzorcih GC, je med odstotkom metilacije treh proučevanih kinaz opazili neposredna povezava: SRC
in Lyn
(p < 0,001, ρ = 0,840); SRC
in CKB
(p < 0,001, ρ = 0,684); LYN
in CKB
(p < 0,001, ρ = 0,663).

ureditev Metiliranie kinaz

Za pojasnitev epigenetsko ureditev obravnavanega geni, smo ocenili morebitno povezavo med promotorja metilacije in beljakovin radioinkorporacijo in mRNA in izražanja proteinov (po zahodni blot)

smo ugotovili, da sta tako mRNA in proteina izraz SRC (p. < 0,001, ρ = -0,834; p < 0,001, ρ = -0,718; zaporedju; slika 6A in 6B) in LYN (p < 0,001, ρ = -0,792; p < 0,001, ρ = -0,654; zaporedju; slika 6D in 6E) je bilo obratno povezana z odstotkom promotorja metilacije. Poleg tega, tumorji z ZRS [0,062 (0,08) v primerjavi
0,375 (0,33); p lt; 0,001; Test Mann-Whitney; Slika 6C] in LYN [0,127 (0,11) v primerjavi
0,500 (0,39); p lt; 0,001; Slika 6F] radioinkorporacijo predstavil nižji odstotek metilacije kot tumorja primanjkuje tega beljakovin radioinkorporacijo

V zvezi z urejanjem CKB opazili neposredna povezava med odstotkom metilacije in CKB mRNA in proteinov izražanja (p. ≪ 0,001, ρ = 0,684; p < 0,001, ρ = 0,686; zaporedju, sl 6G in 6H). Zanimivo je, da povečana CKB beljakovine in mRNA izraz opazili tumorjev z hypomethylated CKB
promotor v primerjavi s tumorji z delno metiliranega promotorja (p = 0,015, p = 0,008, oziroma, Mann-Whitneyev preizkus sledi Bonferroni popravkov S1 sl). Vendar, tumorji, katerih hypermethylated CKB
predlagatelj predstavil tudi povečano beljakovin in mRNA izražanja v primerjavi s tumorji z delno metiliranega promotorja (P < 0,001, za obeh primerjavah).

metilacije predlagateljev kinaze in clinicopathological spremenljivke

V ne-neoplastične želodčne sluznice, odstotek SRC
(p = 0,010, ρ = -0,218) in Lyn
(p = 0,003, ρ = -0,248) metilacija je (slabo) obratno povezana s starostjo bolnikov na operacijo, čeprav je bilo opaziti nobene druge povezave med odstotkom metilacije in spola, H
. pylori
in okužbe z EBV v ne-neoplastične vzorcev (p > 0,05; Mann-Whitney test).

Tabela 4 prikazuje povezavo med odstotkom metilacije v vzorcih GC in clinicopathological značilnosti . V neoplastične vzorcev, odstotek SRC
(p = 0,002, ρ = -0.267), Lyn
(p = 0,014, ρ = -0.208) in CKB
(p = 0,024, ρ = -0,192) metilacija je (slabo) obratno povezana s starostjo bolnikov na operacijo. Poleg tega je delež SRC
(p = 0,002), Lyn
(p = 0,015) in CKB
(p = 0,024) metilacije je bila nižja v poznem nastopu kot v začetku nastopom vzorcev GC. Poleg tega smo ugotovili, da je SRC metilacija nižja v non-Cardia GC v zvezi s Cardia GC (p = 0,028).

znižani odstotek SRC
, LYN
in CKB
metilacija bili povezani s fazi, globlje tumorske invazije, in prisotnost bezgavkah in oddaljenih zasevkov (p < 0,05 za vse primerjave; tabelo 4). Primerjava SRC
in Lyn
metilacija vzorec, ki ga MSP in clinicopathological značilnosti predstavili podobne rezultate (S2 tabela). Vendar pa je delno metilacija CKB
s PPN je tudi pogosteje pojavljata kot hypermethylation v T3 /T4 tumorjev (p = 0,008; S2 tabelo). CKB
delno metilacija je tudi bolj pogoste kot hypermethylation (p < 0,001) in Hipometilacija (p = 0,009; S2 tabela). Tumorjev posameznikov z oddaljenih metastaz v zvezi s tumorji posameznikov brez oddaljenih metastaz

postopno zmanjšanje deleža SRC
in Lyn
metilacija bilo opaziti ustreza stopnji tumorja (p < 0,008, za večino primerjav; Mann-Whitney testa čemur sledi popravkom Bonferroni, slika 3C in 3F). V zvezi s CKB
metilacija, 12 14 (85,7%) vzorcev GC v fazi I je predstavil 73,3% metilacije. Odstotek CKB
metilacije je bila višja v fazi I kot v fazi II, III in IV (p < 0,008, za večino teh primerjav, slika 3I). Nasprotno pa je odstotek CKB
metilacija se je bistveno zmanjšalo v fazi IV, v zvezi z drugimi fazah (p < 0,008, za te primerjave; slika 3I).

kinaz in myc razmerja

Proučili smo myc radioinkorporacijo mRNA izražanja in podatke o stanju metilacija za sklop 49 proučevanih parov neoplastične in ne-neoplastične vzorcev.

• Plos ONE: Klinični Pomen MIR-137 izražanja pri bolnikih z želodčnim rakom Po Radical Gastrectomy
• Plos ONE: Exclusive Zveza p53 mutaciji super-visoke metilacija zaviralnih genov v p53 Pathway v Unique želodca Rak Phenotype