PLoS ONE: Hypoxie Stimuliert die EMT von Magenkrebszellen durch Autokrine TGFß Signaling

Abstrakt

Epithelial mesenchymale Transition (EMT) wird als mit Bösartigkeit von Krebszellen und verantwortlich für die Krebsinvasion und Metastasierung korreliert. Wir bereits berichtet, dass Fernmetastasen mit Hypoxie bei Magenkrebs assoziiert war. Wir untersuchten daher die Wirkung von Hypoxie auf EMT von Magenkrebszellen. Magenkarzinom-Zellen wurden in Normoxie (21% O _{2) oder Hypoxie (1% O 2) für 24 h. EMT wurde als der Prozentsatz von spindelförmigen Zellen in Gesamtzellen ausgewertet. Wirkung von transformierendem Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1) oder Tyrosin-Kinase-Inhibitoren auf die EMT wurde bewertet. Das Expressionsniveau von TGFβ1
und TGFβR und Videos in Echtzeit-RT-PCR wurde ausgewertet. Die TGFβ1 Produktion von Krebszellen wurde mittels ELISA gemessen. Hypoxie stimuliert EMT von OCUM-2MD3 und OCUM-12-Zellen, nicht aber die von OCUM-2M-Zellen. Das Expressionsniveau von TGFβ1
mRNA unter Hypoxie war signifikant höher als unter Normoxie in allen drei Zelllinien. Das Expressionsniveau von TGFβR
mRNA wurde durch Hypoxie in OCUM-2MD3 Zellen signifikant erhöht, aber nicht in OCUM-2M-Zellen. TGFβR Inhibitor SB431542 oder Ki26894, signifikant unterdrückt EMT von OCUM-2MD3 und OCUM-12. TGFβ1 Produktion von OCUM-2MD3 und OCUM-12-Zellen signifikant unter Hypoxie im Vergleich stieg mit, dass unter Normoxie. Diese Ergebnisse könnte darauf hindeuten, dass Hypoxie stimuliert die EMT von Magenkrebszellen über autokrine TGFß /TGFβR Signalisierung}

Citation. Matsuoka J, Yashiro M, Doi Y, Fuyuhiro Y, Kato Y, Shinto O, et al. (2013) Hypoxie Stimuliert die EMT von Magenkrebszellen durch Autokrine TGFß Signaling. PLoS ONE 8 (5): e62310. doi: 10.1371 /journal.pone.0062310

Herausgeber: Claudio M. Costa-Neto, Universität von São Paulo, Brasilien

Empfangen: 19. Oktober 2012; Akzeptiert: 19. März 2013 beginnen; Veröffentlicht: 17. Mai 2013

Copyright: © 2013 Matsuoka et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie teilweise durch das National Cancer Center Forschungs- und Entwicklungsfonds (23-A-9) und von Grants-in-Hilfe wurde für wissenschaftliche Forschung unterstützt (KAKENHI, Nr. 20591573, 22390262 und 23390329) aus dem Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport, Kultur und Technik von Japan. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben folgende Interessen. KS, TS, und AM sind Mitarbeiter von Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Ki26894, die in dieser Studie verwendet wurde, ist ein Produkt von Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Es gibt keine weiteren Patente, Produkte in der Entwicklung oder in Verkehr gebrachten Produkten zu erklären . Dabei werden nicht die Einhaltung der Autoren ändern, um alle Politiken PLoS ONE auf den Austausch von Daten und Materialien, wie für Autoren online in der Anleitung beschrieben.

Einführung

Epithelial mesenchymale Transition (EMT) ist gekennzeichnet durch Veränderungen in der Zellmorphologie, während der Epithelzellen mesenchymalen Eigenschaften erhalten, während Zell-Zell-Wechselwirkungen und apicobasal Polarität verlieren [1], [2]. In epithelialen Tumoren ist, EMT als einer der Mechanismen erkannt verantwortlich für die invasive und metastatische Verhalten Einleitung [3] - [5]

A existiert hypoxischen Umgebung in einigen Regionen von soliden Tumoren, die da schnelles Wachstum zeigen Angiogenese. in Karzinomen ist heterogen [6]. Hypoxie ist als mit aggressiven Tumor Phänotypen von Magenkarzinomen [7], [8], einschließlich metastatischen Fähigkeit von Krebszellen assoziiert ist [6], [9]. Klinische und experimentelle Daten auch Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der hypoxischen Umgebung zur Verfügung stellen und eine schlechte Prognose [10], [11]. Es ist daher wichtig für die zukünftige Entwicklung von Krebstherapien, den Mechanismus der Metastasierung durch Hypoxie zu klären.

Es wurde berichtet, dass verschiedene lösliche Faktoren, einschließlich der transformierende Wachstumsfaktor-β1 (TGFβ1) [12], [ ,,,0],13], epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) [14], Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) [15], Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) [16], Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) [17] wurden mit EMT korrelierten . TGFß Signale eine wichtige Rolle in verschiedenen Aspekten der Metastasierung von Krebszellen, wie Migration, Invasion und EMT [12], [13]. Die TGFß-Liganden binden an TGF &bgr; -Rezeptor Typ II (TGFβRII), die dann einen Komplex bildet mit entweder TGFβR Typ I oder II. TGFβR Typ I (TGFβRI) sendet Signale innerhalb der Zelle über Second-Messenger-Smad Proteine ​​[13], [18]. Downstream-Signale werden durch TGFβRI propagiert, die Rezeptor-regulierten Smad Proteine ​​[19] phosphoryliert, [20]

Mehrere Studien haben berichtet, dass eine Hypoxie EMT von Krebszellen induzieren könnte [21] - [24]., aber der molekulare Mechanismus verantwortlich für EMT unter hypoxischen Zustand bleibt unklar. Wir untersuchten daher die Wirkung von Hypoxie auf die morphologischen Eigenschaften von Magenkrebszellen, die Mechanismen für EMT hypoxieinduzierten verantwortlich zu klären.

Materialien und Methoden

Zellkultur und Zelllinien

Sieben Magenkrebs-Zelllinien wurden verwendet. OCUM-2MD3 [25], OCUM-12 [26], OCUM-2M [27], KATO-III [28], und MKN-45 [29] aus diffusen Typ Magenkarzinom abgeleitet wurden. MKN-74 [29] und MKN-7 [29] wurden aus Darm-Typ abgeleitet. OCUM-2M, OCUM-2MD3 und OCUM-12 wurden in unserem Labor establised, wie früher berichtet [25] - [27]. Kurz gesagt, OCUM-12was aus Aszites abgeleitet, die mit diffusen Typ Magenkarzinom und OCUM-2MD3 Zellen, einer Tochterzelllinie mit hohem Potential von Peritonealdialyse Metastasen, von OCUM-2M-Zellen etabliert wurden orthotopen Tumormodell, eine elterliche Zelllinie Aszites im Zusammenhang mit Magenkarzinom diffus-Typ. Die anderen Zelllinien wurden von der JCRB Zellbank (Osaka, Japan) oder der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Zellen wurden bei 37 ° C in 21% O kultiviert _{2 (Normoxie) oder 1% O 2 (Hypoxie). Hypoxischen Bedingungen wurden unter Verwendung eines modularen Inkubatorkammer (Hirasawa, Tokyo, Japan) mit 5% CO gehalten 2 und 1% O 2 ausgeglichen mit N 2 Gas. Das Kulturmedium bestand aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM;. Nikken Bio, Osaka, Japan) mit 10% fötalem Rinderserum (. Nichirei Bio), 100 IU /ml Penicillin (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA), 100 ug /ml Streptomycin (ICN Biomedicals) und 0,5 mM Natriumpyruvat (Cambrex, Walkersville, MD).}

Morphologische Veränderungen

Krebszellen unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen für 24 h kultiviert wurden, und die Zellmorphologie mikroskopisch beobachtet. EMT wurde bestimmt, wenn die polygonal oder Spindelform in Krebszellen durch Phasenkontrastmikroskop gefunden wurde. Die Frequenz des EMT wurde durch die Rate der polygonal oder spindelförmige Zellen in allen Krebszellen untersucht; EMT-Rate = die Anzahl der polygonal oder spindelförmige Gestalt Zellen /Gesamtzahl der Zellen × 100 (%).

Effekte verschiedener löslicher Faktoren auf morphologische Veränderungen

Wir untersuchten die Wirkungen verschiedener löslicher Faktoren einschließlich EGF (Pepro Tec, Rocky Hill, NJ), IGF1 (Pepro Tec), vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF; R & D Systems, Minneapolis, MN), Basis-FGF (Sigma, St. Louis, MO), Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-BB-Homodimer (PDGF-BB; Pepro Tech), HGF (Pepro Tech), TGFβ1 (King Brewing, Kakogawa, Japan), auf die Morphologie von Krebszellen. Die Zellen wurden in DMEM einem der oben genannten Faktoren in der erforderlichen Konzentration bei 37 ° C in Normoxie enthält. Zellmorphologie wurde nach 24 h untersucht. Die Experimente wurden für jeden Faktor doppelt durchgeführt.

Effekte von Antikörpern auf morphologische Veränderungen

Wir verwendeten neutralisierenden Antikörper, wie Anti-HGF-Antikörper (Genzyme Techne, MPLS, MN, USA) Neutralisieren, Anti-TGF β Antikörper (R & D-Systeme), anti-PDGF-BB (Genzyme), anti-FGF7 (R & D-Systeme), anti-VEGFR3 (R & D-Systeme). Zellen wurden in DMEM einem der obigen Antikörper bei 100 ug /ml in Hypoxie bei 37 ° C enthält. Zellmorphologie wurde nach 24 h untersucht.

Wirkung verschiedener Inhibitoren auf phospholylation morphologischen Veränderungen

Nachdem die Zellen erreicht semi-Konfluenz wurden die Zellen hinzugefügt TGFß oder jedes Inhibitors und unter hypoxischen Bedingungen oder Normoxie inkubiert für 24 h. Dann morphologischer Befunde wurden im Vergleich mit der Kontrolle untersucht. Fünf kleine synthetische phospholylation Inhibitoren, Ki26894 (TGFβRI Inhibitor, 10 &mgr; M; Kirin Pharma, Mishima, Japan), SB431542 (TGFβRI Inhibitor, 10 &mgr; M; Sigma, St. Louis, MO), Sunitinib (SU11248, 20 nM, eine Tyrosin-kinase-Inhibitor gegen VEGFR, PDGFR, c-KIT, FGFR2- und FLT3, LKT Laboratories, St. Pail, MN), PD173074 (FGF /VEGF-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor, 5 nM, Santa Cruz, CA), Lapatinib (GW572016, 10 nM; a Tyrosinkinase-Inhibitor gegen EGFR und ErbB2, Toronto Research Chemicals) und PHA665752 (c-MET Inhibitor, 2 uM;. Pfizer, San Diego, CA, USA) verwendet wurden

Quantitative Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)

Quantitative RT-PCR wurde zu untersuchen durchgeführt TGFβ1
, TGFβRI, TGFβRII, Poster und Vimentin
mRNA Ausdrücke. Krebszellen wurden für 24 h unter normoxischen Bedingungen und unter hypoxischen Bedingungen inkubiert. unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach den Anweisungen des Herstellers Nach der Inkubation wurde die gesamte zelluläre RNA extrahiert. Nach der Entfernung der genomischen DNA durch DNase, cDNA wurde aus 2 ug RNA mit Maloney Maus-Leukämie-Virus-Reverse-Transkriptase (Invitrogen) unter Verwendung von Zufallsprimern (Invitrogen) hergestellt. Um zu bestimmen, falten Änderungen in jedem Gen, Echtzeit-RT-PCR auf dem ABI Prism 7000 durchgeführt wurde (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Genexpressionsassays für TGFβ1
(Hs00998130,), TGFβRI
(Hs00610319), TGFβRII
(Hs00559661), Vimentin
(Hs00958116), Twist
(Hs01675818), ZEB1
(Hs 00232783), snail1
(Hs00195591), VEGFA
(Hs00900055). PCR wurde für 15 s und 60 ° C für 40 Zyklen für 60 s bei 95 ° C durchgeführt wird. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde als interner Standard verwendet mRNA-Spiegel für die Unterschiede in der Probenkonzentration und das Laden zu normieren. Fold Change bei der Expression von jeder Ziel-mRNA relativ zu GAPDH wurde berechnet auf der Schwellenzyklus basiert (Ct) als 2 ^{-Δ (ACt), wobei ACt = Ct ziel Ct GAPDH und Δ (ACt) = ACt _{Hypoxie-ACt Normoxie. Quantitative PCR-Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.}}

Western-Blot-Analyse

Für die Wirkung von Hypoxie auf Smad2 Phosphorylierung untersuchen, wurden Krebszellen unter normoxischen inkubiert oder hypoxischen Bedingungen für 24 h, respectively. Die Zellen wurden in einem Lysepuffer lysiert, und Aliquots 50 ug Gesamtprotein enthielten, wurden auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen; die Proteinbanden wurden auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (Millipore, Billerica, MA) transferiert. Die Membran wurde in TBS-T (10 mM TBS und 0,05% Tween 20), ergänzt mit 5% fettfreier Milch oder 5% Rinderalbumin (Sigma) bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Als nächstes wurde die Membran in einer TBS-T-Lösung gegeben, die primären Antikörper p-Smad2 (Ser ^{465/467; 1: 1000; Cell Signaling Technology) enthalten oder Smad2 /3 (1: 1000; Cell Signaling Technology), Vimentin (1: 1000; Cell Signaling Technology), anti-βactin (1: 1000; Sigma) und über Nacht bei 4 ° C reagieren gelassen. Dann wurde jeder Antikörper für 10 min dreimal mit TBS-T gewaschen und einem Peroxidase-markierten Sekundärantikörper (GE Healthcare, Buckinghamsire, UK) reaktiv mit dem primären Antikörper wurde zugegeben. Die Bänder wurden mit einem verstärkten Chemilumineszenz-System (Wako, Osaka, Japan) detektiert.}

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Die TGFβ1 Produktion von Krebszellen durch einen quantitativen Sandwich-Enzym gemessen wurde, Immunoassay-Technik, um ein Quantikine menschlichen TGFβ1 ELISA-Kit nach dem Hersteller `Anweisung (R & D-Systeme). Krebszellen unter Hypoxie oder Normoxie für 24 h inkubiert, dann wurde das Medium gegen 3 ml serumfreies DMEM ersetzt. Die Zellen wurden für weitere 24 h unter Hypoxie oder Normoxie inkubiert. Bedingte Medium (CM) wurde aus jeder Schale gesammelt und bei 1000 g zentrifugiert
5 min. TGFβ1 Höhe des Serum-freien CM wurde mit Kit ELISA gemessen. ELISA nachgewiesen, sowohl das aktive und latente TGFß.

Die statistische Analyse

Vergleiche zwischen Datensätze wurden mit Student gemacht t
-Test oder der Kruskal-Wallis-one-way ANOVA durch Reihen von Dunn-Mehrfachvergleichstest. Die Unterschiede wurden als statistisch signifikant zu sein, wenn der P-Wert war. ≪ 0,05

Ergebnisse

• PLoS ONE: Janus Kinase 2 Polymorphismen assoziiert sind mit Risiko bei Patienten mit Magenkrebs in einem chinesischen Population
• PLoS ONE: Multiple-to-Multiple Beziehungen zwischen MicroRNAs und Zielgene in Gastric Cancer