Финансирование:. Это исследование была частично поддержана Национальным научно-исследовательским и фонд развития рака Центр (23-а-9), а также грантами-в помощи научных исследований (KAKENHI, пп. 20591573, 22390262 и 23390329) из Министерства образования, науки, спорта, культуры и технологии Японии. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
Конкурирующие интересы:. Авторы имеют следующие интересы. KS, TS, и AM являются сотрудниками Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Ki26894, которая была использована в данном исследовании, является продуктом Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Там нет других патентов, продукты в разработке или продаваемые продукты объявить , Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов обмена, как подробно на сайте в руководстве для авторов.
Материалы и методы
Культура клеток и клеточных линий
<р> было использовано семь линий рака желудка клеток. OCUM-2MD3 [25], OCUM-12 [26], OCUM-2М [27], КАТО-III [28], и MKN-45 [29] были получены из карциномы диффузного типа желудка. MKN-74 [29] и MKN-7 [29] были получены из кишечного типа. OCUM-2М, OCUM-2MD3 и OCUM-12 были establised в нашей лаборатории, как сообщалось ранее [25] - [27]. Вкратце, OCUM-12was, полученные из асцита, связанных с диффузного типа желудочной карциномы, и клетки OCUM-2MD3, линии дочерней клетки с высоким потенциалом перитонеального метастазирования, были созданы из клеток OCUM-2М с использованием ортотопической модели опухоли, клеточная линия, асцит родителей связанная с карциномой желудка диффузного типа. Другие клеточные линии были получены из банка клеток JCRB (Осака, Япония) или Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD). Клетки культивировали при 37 ° С в 21% O <суб> 2 (нормоксии) или 1% O <суб> 2 (гипоксия). Гипоксических условия были сохранены с использованием модульного инкубатора камеры (Хирасава, Токио, Япония) с 5% CO <суб> 2 и 1% O <суб> 2 сбалансированы с N <югу> 2 газа. Культуральная среда состояла из модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM;. Nikken Bio, Осака, Япония) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (. Nichirei Bio), 100 МЕ /мл пенициллина (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA), 100 мкг /мл стрептомицина (ICN Biomedicals), и 0,5 мМ пирувата натрия (Cambrex, Walkersville, MD).
Морфологические изменения
<р> Раковые клетки культивировали под нормоксических или гипоксических условиях в течение 24 ч, и морфология клеток наблюдалась микроскопически. ЕМТ определяли, когда полигональный или шпиндель форма была найдена в раковых клетках с помощью фазово-контрастного микроскопа. Частота EMT оценивали по скорости полигональных или веретенообразных клеток во всех раковых клеток; EMT скорость = количество ломаных или шпинделя ячеек формы /общее количество клеток × 100 (%).
Количественные в режиме реального времени с использованием обратной транскриптазы-полимеразы цепной реакции (RT-PCR) Результаты Влияние гипоксии на раковых клеток морфологии эффекты гипоксии на <ЕМ> TGF 1 эффекты гипоксии на Smad2 фосфорилирования клеточных линий рака желудка в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, Smad2 фосфорилирования была увеличена при гипоксических условиях, по сравнению с тем под нормоксических состояние. В противоположность этому, Smad2 фосфорилирования не была увеличена при гипоксических условиях в клетках OCUM-2М (рис. 4). Эффекты гипоксического состояния на факторы, связанные с EMT. В последнее время некоторые исследования сообщили, что гипоксической микросреда окружающих твердых опухолевых клеток может способствуют раку прогрессии [30] - [34]. Однако молекулярные механизмы, ответственные за прогрессирования рака в условиях гипоксии остаются неясными. Сообщалось, что гипоксия является одним из триггеров для EMT [35]. В настоящем исследовании, гипоксической состояние индуцированного EMT в диффузного типа желудочных линий раковых клеток OCUM-2MD3 и OCUM-12, но не в клетках кишечного типа. Диффузный тип рака желудка характеризуется более высокой злокачественности, чем рак кишечного типа желудка [36]. ЕМТ потенциал раковых клеток при гипоксии может быть одной из причин высокой злокачественного потенциала рака желудка диффузного типа. Поддержка информации Рисунок S1
<р> Количественный ОТ-ПЦР проводили для изучения TGF 1
, TGFβRI, TGFβRII,
и выражения виментин
мРНК. Раковые клетки инкубировали при нормоксических условиях и в условиях гипоксии в течение 24 ч. После инкубации общее клеточную РНК экстрагировали с использованием реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. После удаления геномной ДНК с помощью ДНКазы, кДНК получали из 2 мкг РНК с Малони вируса мышиного лейкоза обратной транскриптазы (Invitrogen) с использованием метода случайных праймеров (Invitrogen). Для определения изменения Сложить в каждом гене, в режиме реального времени RT-PCR проводили на ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), используя коммерчески экспрессии генов анализов доступны для TGF 1
(Hs00998130,), TGFβRI
(Hs00610319), TGFβRII
(Hs00559661), виментин
(Hs00958116), Twist
(Hs01675818), Zeb1 <бр> (Hs 00232783), Snail1
(Hs00195591), VEGFA
(Hs00900055). ПЦР проводили при температуре 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 60 сек в течение 40 циклов. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве внутреннего стандарта, чтобы нормализовать уровни мРНК для различий в концентрации образца и нагрузки. Сложите изменения в экспрессии каждой мРНК-мишени по отношению к GAPDH была рассчитана на основе порогового цикла (Ct), как 2 -Δ (Δ CТ), где Δ CТ = Ct мишенями Ct GAPDH и Δ (Δ CТ) = Δ CТ <суб> гипоксией Δ CТ <суб> нормоксии. Количественные ПЦР-реакции проводили в трех повторностях.
Вестерн-блот-анализ
<р> Для изучения влияния гипоксии на Smad2 фосфорилирования, раковые клетки инкубировали при нормоксических или гипоксических условиях в течение 24 ч, соответственно. Клетки подвергали лизису в буфере для лизиса, и аликвоты, содержащие 50 мкг общего белка подвергали электрофорезу с додецилсульфатом натри в полиакриламидном геле; белковые полосы были переданы поливинилидендифторидную мембрану (Millipore, Billerica, MA). Мембрану инкубировали в TBS-T (10 мМ TBS и 0,05% Tween 20), дополненной 5% обезжиренное молоко или 5% бычьего альбумина (Sigma) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем мембрану помещают в раствор TBS-T, содержащий первичное антитело, р-Smad2 (сир 465/467; 1: 1000; Cell Signaling Technology), или Smad2 /3 (1: 1000; Cell Signaling Technology), Виментин (1: 1000; Cell Signaling Technology), анти-βactin (1: 1000; Sigma) и давали прореагировать при 4 ° с в течение ночи. Затем каждое антитело трижды промывали TBS-T в течение 10 мин, и меченых пероксидазой вторичное антитело (GE Healthcare, Buckinghamsire, Великобритания) реагирует с добавляли первичное антитело. Полосы детектировали с использованием усовершенствованной системы хемилюминесценции (WAKO, Осака, Япония).
иммуноферментного анализа (ИФА)
<р> Производство TGF 1 из раковых клеток измеряли с помощью количественного сэндвич-фермента метод иммуноанализа с использованием набора Quantikine человеческого TGF 1 ELISA, в соответствии с инструкцией (R s изготовления &Amp; D Systems). Раковые клетки инкубировали при гипоксии или нормоксии в течение 24 ч, затем среду замен ли на 3 мл DMEM, содержащей сыворотку. Клетки инкубировали при гипоксии или нормоксии, в течение дополнительных 24 ч. Условный средний (СМ) собирали из каждой чашки и центрифугировали при 1000 <ЕМ> г
в течение 5 мин. Уровень TGF 1 в сыворотке крови свободного CM измеряли с помощью ELISA набора. ИФА обнаружен как активный и латентный TGF-beta.
Статистический анализ
<р> Сравнения между наборами данных были сделаны с Студента т
-test или Крускала-Уоллиса однофакторного дисперсионного анализа с помощью ряды с последующим многократным сравнительного теста Данна. Различия считались статистически значимыми, когда значение P было &л;. 0,05
<р> гипоксического состояние значительно увеличилось число полигональных или веретенообразных клеток, подвергающихся EMT среди OCUM-2MD3 или OCUM-12 клеток, но не входит в число OCUM-2М, MKN-7, MKN-45, MKN-74 или клеток КАТО-III (рис. 1А и фиг. S1). Морфология клеток из OCUM-2MD3 и OCUM-12 начали менять через 4 ч в гипоксических культуре. Через 12 ч культуры, увеличение скорости EMT наблюдалась в обеих клеточных линиях. Скорость ТЭИ OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток была самой высокой в 24 ч гипоксического культуры (рис. 1В). Поскольку морфологические изменения были очевидны в 24 ч культивирования при гипоксии, молекулярные механизмы ЕМТ были проанализированы в 24 ч культивирования в условиях гипоксии с использованием OCUM-2MD3, OCUM-12 и OCUM-2М клетки.
Влияние различных факторов роста на клетки рака морфологии
<р> Растворимые факторы были использованы при концентрациях 10 или 100 нг /мл. OCUM-2MD3 и OCUM-12 клетки стали веретенообразный с последующим добавлением TGF 1 или HGF, но не после добавления EGF, FGF2, FGF7, IGF1, VEGF или PDGF-BB через 24 ч при нормоксии (таблица 1). В противоположность этому, OCUM-2М клетки не показали изменения морфологического после добавления каких-либо факторов (рис. 2).
Эффекты нейтрализующих антител на раковых клеток морфологии при гипоксии
<р> ЕМТ, индуцированный гипоксией было частично ингибируется анти-TGF- 1 антителом при 100 мкг /мл, а не с помощью анти-HGF антитела (таблица 2).
, TGFβRI
и TGFβRII
экспрессия мРНК клеток рака желудка
<р> уровень экспрессии TGF-beta
была существенно (р &л; 0,001) увеличилась при гипоксических условиях во всех OCUM -2MD3, OCUM-12, и OCUM-2M клеток, по сравнению с уровнем при нормоксии (рис. 3, а). Уровни экспрессии TGFβRI
и TGFβRII
были значительно увеличены при гипоксических условиях в клетках OCUM-2MD3. В противоположность этому, уровни TGFβR1
и TGFβR2
выражение значительно уменьшилось при гипоксических условиях в клетках OCUM-2М (рис. 3, б).
Влияние гипоксии на производство TGF 1 высвобождается из клеток рака желудка
<р> TGF 1 продукция из OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток достоверно (р &л; 0,001) увеличилась в условиях гипоксии по сравнению с нормоксии, но не то, что из клеток OCUM-2М (рис 3C. ).
Влияние ингибиторов киназы фосфорилирования на EMT и экспрессию виментина в гипоксия
<р> В любом из
TGFβR ингибиторы фосфорилирования, Ki26894 и SB431542, тормозил морфологические изменения OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток под гипоксического состояния, но три других ингибиторов, Лапатиниб, Сунитиниб и PHA665752, не сделал (рис 5A, 5B). С другой стороны, ни один из ингибиторов не имели никакого влияния на морфологию OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток под нормоксии (данные не показаны). Уровень экспрессии виментина
, который был использован в качестве маркера ЕМТ, была значительно увеличена гипоксией, и была уменьшена либо из ингибиторов TGFβR Ki26894 и SB431542 (5С). Уровень Виментин белка также увеличивается при гипоксии, и была уменьшена либо ингибиторов TGFβR Ki26894 и SB431542 (рисунок 5D).
<р> Гипоксическая состояние значительно увеличилось VEGF-A
уровня мРНК в OCUM-2М, OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток. Уровень экспрессии Twist
или Zeb1
была значительно увеличена гипоксией в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, но была снижена в клетках OCUM-2М. Повышенная экспрессия Twist
или Zeb1
была снижена либо из ингибиторов TGFβR Ki26894 и SB431542 в OCUM-12 клеток. Гипоксическая состояние не влияет на уровень экспрессии Snail1
(Рисунок 6).
Обсуждение
<Р> Многие исследования показали, что некоторые молекулы могут повлиять на EMT раковых клеток, в том числе TGF-beta [23 ], [37], EGF [38], и PDGF [39]. В настоящем исследовании, стимулировали TGF-beta ТЭИ OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, но EGF и PDGF не сделал. Кроме того, EMT индукция при гипоксических условиях значительно снизилась анти-TGF-beta нейтрализующих антител или ингибиторы фосфорилирования TGFβR в обоих OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток. В совокупности эти результаты указывают на то, что уровень производства TGF-beta в раковых клетках была значительно увеличена при гипоксии, а также уровни экспрессии TGFβR и Smad2 фосфорилирования были увеличены на гипоксию. Виментин является характерным компонентом мезенхимальных клеток и, как правило, не выражены в эпителиальных клетках. Поскольку выражение <ЕМ> виментин
в эпителиальных клетках играет существенную роль в EMT через взаимодействие с актином и других промежуточных филаментов [40], виментин был использован в качестве маркера ЕМТ в данном исследовании. Уровень экспрессии виментин
была значительно увеличена на гипоксию, а также была уменьшена с помощью ингибиторов фосфорилирования TGFβR Ki26894 и SB431542. Эти результаты свидетельствуют о том, что EMT при гипоксических условиях связано с акустической сигнализации аутокринная TGF-beta /TGFβR при раке желудка диффузного типа. Несколько исследований сообщили о корреляции между ЕМТ и TGF-beta сигнализации в условиях гипоксии. [2], [21], [23], [32], [37] При раке желудка, сообщалось, что ЕМТ коррелирует с злокачественности раковых клеток и отвечает за вторжение и метастазирование раковых. Однако механизмы, ответственные за ТЭИ клеток рака желудка остаются неясными. В данной статье уточнено, что EMT желудка раковых клеток индуцировали с помощью TGF-beta сигнализации при гипоксии. ингибиторы TGFβR может таким образом быть перспективными агентами для лечения желудка раковых метастаз.
<р> Гипоксия стимулировала EMT клеток OCUM-2MD3, но не то, что из клеток OCUM-2М. ЕМТ участвует в развитии инвазию и метастазирование раковых. В то время как OCUM-2MD3 является "дочка" клеточная линия OCUM-2М [25], [34], OCUM-2MD3 клетки имеют более высокий потенциал для метастазирования к брюшине у голых мышей, чем клетки OCUM-2М [25], [34] , Раковые клетки свободные мигрировать в брюшной полости подвергаются гипоксии из-за отсутствия проксимальный питающего сосуда [41]. Уровень экспрессии TGF 1
мРНК при гипоксии была значительно выше, чем при нормоксии во всех трех клеточных линий. В отличие от этого, уровень экспрессии TGFβRI
и TGFβRII
мРНК была значительно увеличена гипоксией в клетках OCUM-2MD3, но не в клетках OCUM-2М. Различные ответы TGFβR
выражение между нормоксии и гипоксии может быть одним из ключевых причин гипоксии, вызванной ЕМТ. Ранее мы сообщали, что желудочные раковые клетки при гипоксии показали EMT и высокие миграционные и инвазивные мероприятия по сравнению с раковыми клетками в нормоксии [34]. Повышающая регуляция EMT гипоксических раковых клеток может быть одной из причин более высокого потенциала для метастазами в брюшину в клетках OCUM-2MD3 по сравнению с клетками OCUM-2М.
<Р> состояние Гипоксическая значительно повысило уровень экспрессии из Twist
и Zeb1
в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, но не то, что в клетках OCUM-2М. Гипоксией повышение активности Twist
и Zeb1
выражение было снижено с ингибиторами TGFβR (Ki26894 и SB431542) в OCUM-12 клеток. ЕМТ в условиях гипоксии может быть частично регулируется факторами транскрипции, Twist
и Zeb1.
<Р> Несмотря на то, что HGF влияние морфологии клеток рака в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, гипоксия-индуцированный EMT не ингибируется анти-HGF нейтрализующих антител или ингибитора с-Met в любом OCUM-2MD3 или OCUM-12 клеток. производство HGF не был обнаружен в OCUM-2MD3 или OCUM-12 клеток при гипоксии либо и нормоксии (данные не показаны). Большинство HGF происходит из стромальных клеток при раке желудка [42]. В то время как HGF, не может играть важную роль для гипоксия-индуцированного EMT, HGF, может стимулировать EMT раковых клеток через взаимодействие с раком стромальных
. <Р> гипоксия-индуцированный EMT клеток OCUM-2MD3 частично ингибируется ингибиторами TGFβR , но различные другие ингибиторы, включая ингибитор с-Met, ингибитор PDGF, ингибитор EGFR и ингибитор VEGFR, не имел никакого влияния на гипоксия-индуцированного EMT в данном исследовании. Эти данные свидетельствуют о том, что другой фактор (ы) может быть связано с гипоксией, вызванной ЕМТ в некоторых раковых клетках. В будущих исследованиях, будет необходимо рассмотреть другие новые факторы, которые могут изменить морфологию рака
. <Р> В заключение аутокринная TGF-beta /TGFβR сигнализации при гипоксии может быть одним из факторов, связанных с агрессивным фенотипом ЕМТ в желудочные клетки карциномы. Ингибиторы сигнализации TGF-beta /TGFβR, как представляется, терапевтически перспективными при раке желудка.
.
Морфологические изменения клеток желудка под гипоксического состояния. В MKN-7, MKN-45, MKN-74 и КАТО-III, морфологические изменения не были найдены при гипоксии
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0062310.s001
(TIF)
Ученые извлекли полный геном человека из «жевательной резинки» возрастом тысячи лет.
Обычный грибок, обнаруженный на коже, может вызвать воспалительное заболевание кишечника.
Язвенный колит
Ополаскиватель для рта влияет на эффект упражнений
Половина используемых лекарств повреждает кишечные бактерии,
Бактериальные изменения кишечника влияют на результаты лечения волчанки во время беременности
Средиземноморская диета способствует здоровому старению с более здоровым микробиомом кишечника
Новое исследование опубликовано в журнале онлайн Кишечник в феврале 2020 года сообщается о поразительных оздоровительных эффектах перехода на средиземноморскую диету всего на один год. Результаты бы
Микропластик впервые обнаружен в отходах жизнедеятельности человека
Анализ образцов стула человека, взятых у участников из восьми стран, показал, что каждый протестированный образец содержал микропластик и что присутствовало до девяти различных видов пластика.
Как укрепить свою иммунную систему для борьбы с коронавирусом
Пока мир борется с пандемией коронавируса, все больше и больше людей пытаются защитить себя от вируса всеми возможными способами. В настоящее время нет вакцин против тяжелого острого респираторного си