PLoS ONE: deregulierte Expression von SRC, LYN und CKB Kinasen durch DNA-Methylierungs und seine mögliche Rolle bei Magenkrebs Invasivität und Metastasierung

Abstrakt

Kinasen sind Downstream-Modulatoren und Effektoren von mehreren zellulären Signalkaskaden und eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Tumorerkrankungen spielen. In dieser Studie wollten wir SRC, LYN und CKB-Protein und mRNA-Expression, sowie deren Promotor-Methylierung, bei Magenkrebs zu bewerten. Wir fanden eine erhöhte Expression von SRC und LYN-Kinase-mRNA und Protein, aber verringerte Niveaus von CKB kinase, Veränderungen, die eine Rolle bei der Invasivität und Metastasierung von Tumoren des Magens haben. Die Expression der drei untersuchten Kinasen wurde auch mit MYC Onkogen Ausdruck einer möglichen Biomarker für Magenkrebs in Verbindung gebracht. Um die Mechanismen zu verstehen, die die Expression dieser Gene regulieren, untersuchten wir die DNA-Promotor-Methylierung der drei Kinasen. Wir fanden, dass reduziert SRC
und LYN
Methylierung und erhöhte CKB
Methylierung wurde mit Magenkrebs in Verbindung gebracht. Die reduzierte SRC Karten und LYN
Methylierung mit erhöhten Konzentrationen von mRNA und Proteinexpression assoziiert war, was darauf hindeutet, daß die DNA-Methylierung in die Regulation der Expression dieser Kinasen beteiligt ist. Umgekehrt verringert CKB
Methylierung wurde in Proben mit reduzierten mRNA und Proteinexpression, was darauf hindeutet CKB Expression beobachtet gefunden wurde durch DNA-Methylierung nur teilweise geregelt werden. Zusätzlich fanden wir, dass Veränderungen in der DNA Methylierungsmuster der drei untersuchten Kinasen auch mit dem Auftreten von Magenkrebs, fortgeschrittenem Magenkrebs assoziiert waren, tiefer Tumorinvasion und die Anwesenheit von Metastasen. Daher SRC, LYN und CKB Expression oder DNA-Methylierung nützliche Marker für die Vorhersage der Tumorprogression und Targeting in Anti-Krebs-Strategien sein könnte

Citation:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Montenegro RC, et al. (2015) Eine deregulierte Expression von SRC, LYN und CKB Kinasen durch DNA-Methylierungs und seine mögliche Rolle bei Magenkrebs Invasivität und Metastasierung. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10.1371 /journal.pone.0140492

Editor: Jose G. Trevino, University of Florida, USA

Empfangen: 27. Mai 2015; Akzeptiert: 25. September 2015; Veröffentlicht: 13. Oktober 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Studie wurde von Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq unterstützt wurde; ZuschüsseǗ072 /2012-5 und 402283 /2013-9, Gemeinschaft zu MCS und RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; gewähren #ICAAF 123/2014 zu RRB) und Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; ZuschussÈ9 /07145-9, Gemeinschaft zu MFL) als Zuschüsse und Gemeinschaft ausgezeichnet. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebsart und die zweithäufigste Ursache der Krebssterblichkeit weltweit [1]. Die Behandlung von GC in fortgeschrittenen Stadien wie vor schwierig, und die Prognose ist immer noch schlecht, teilweise als Folge von Lokalrezidiven, Tumorinvasion und /oder Metastasen. Die gesamte relative 5-Jahres-Überlebensrate beträgt derzeit weniger als 20% [2]. Ein besseres Verständnis der Biologie des Verlaufs dieser Neoplasie ist entscheidend, um die Sterblichkeit mit der Entwicklung neuer Patientenmanagement und therapeutische Strategien zu reduzieren.

Phosphotransferasen, die auch als Kinasen bekannt ist, sind Downstream-Modulatoren und Effektoren von mehreren zelluläre signal~~POS=TRUNC und eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Tumorerkrankungen spielen [3]. Bis heute wurden mehrere Proteinkinase-interagierenden Arzneimitteln für klinische Studien registriert [4]. Wir führten bisher Screening kinase Proteine ​​in GC unter Verwendung von Capture-Compound Mass Spectrometry [5, 6] (S1 File) und 22-Kinase-Proteine, einschließlich SRC, LYN und CKB, wurden nachgewiesen (Tabelle S1) ausgedrückt zu identifizieren. Diese drei Kinasen wurden für weitere Untersuchungen (S1) Bild ausgewählt.

SRC war das erste Proto-Onkogen entdeckt, und es spielt eine zentrale Rolle bei der zellulären Signalübertragungswege. Aberrant SRC-Aktivität wird in verschiedenen menschlichen Krebsarten, einschließlich GC beobachtet [7-9], und es kann während der Tumor-Entwicklung und Progression [10, 11] von Bedeutung sein. Die mitogene Funktion der SRC ist, zumindest teilweise durch die Induktion von MYC vermittelt, einem Zellzyklus-Regulator und Transkriptionsfaktor [12, 13]. Unsere Gruppe zuvor beschriebenen MYC upregulation in menschlichen GC und in N-Methyl-nitrosourea behandelten nichtmenschlichen Primaten [14-19]. Weil die Aktivierung von SRC, sowie die der anderen Kinasen, pleiotrope Effekte aufweist, die vom Zelltyp und den Kontext abhängt [20], ist es immer noch wichtig, die mögliche Beziehung zwischen Kinasen und MYC-Expression in Magen Karzinogenese und der molekularen Mechanismen zu verstehen, in ihrer Regulation beteiligt.

LYN ist ein weiteres Mitglied der SRC-Familie von Kinasen, und die LYN
Gen befindet sich auf Chromosom 8q13 befindet. Unsere Gruppe zuvor berichtet, das Vorhandensein von Gewinnen von Chromosom 8 (auf dem der MYC
Gen auch befindet) in GC-Fälle aus Nordbrasilien [16, 21-23] und in allen GC-Zelllinien von Neoplasien gegründet diese Bevölkerung [24, 25]. Daher kann dieses Chromosom wichtige Gene in Magen-Krebsentstehung beteiligt enthalten. Unseres Wissens hat keine frühere Studie, die die Rolle der LYN und deren Regulation in GC untersucht. Jedoch LYN Überexpression wurde in verschiedenen Krebsarten berichtet [26-32]. Darüber hinaus wurde in einigen hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen die Regulierung von LYN
durch DNA-Methylierung wurde in beiden Darmkrebs und Ewing Sarkom [33, 34] und LYN
Methylierung beobachtet demonstriert Zelllinien [35]. DNA Methylierung ist eine molekulare Modifikation von DNA, die eng mit der Genfunktion und Zelltyp-spezifische Genfunktion [36] verbunden ist. Darüber hinaus kann die DNA-Methylierung eine robuste Biomarkers sein, da es erheblich stabiler als RNA oder Protein ist, und ist daher ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer Ansätze für die Diagnose und Prognose von Krebserkrankungen [36].

CKB ist einer von zwei cytosolische Isoformen von Kreatinkinase und Glykolyse in nicht-Muskelzellen [37] Einbeziehung in Stoffwechselprozessen teilnehmen. Im Gegensatz zu normalen Zellen, die in erster Linie Energie über oxidative Phosphorylierung zu erzeugen, bevorzugen die meisten Krebszellen aerobe Glykolyse, der als der Warburg-Effekt bekannt ist [38]. Interessanterweise scheint das MYC Onkogen mehrere Glucosetransporter und glykolytische Enzyme zu aktivieren, wodurch die Wirkung Warburg beitragen [39]. Unsere bisherigen Proteom-Studie ergab, dass mehrere Proteine, die in Energieerzeugungsprozessen beteiligt waren, in GC-Proben dereguliert und verstärkt den Warburg-Effekt in diesem Neoplasien [40]. Die Rolle der CKB in GC bleibt kaum verstanden: einige transkriptomischen Studien berichteten die Hochregulation von CKB
in GC-Proben [41, 42], während ein anderer zeigte CKB
Herabregulation [43]. Zusätzlich wird, wie für die LYN
Gen, CKB
Methylierung wurde vorher in hämatologischen und soliden Krebszelllinien, einschließlich GC-Zelllinien [44] beschrieben. Die Methylierung von CKB
erscheint auf seiner reduzierten Expressionsniveau bezogen werden; jedoch weitere Untersuchung ist noch notwendig, die Regulierung von CKB und Videos epigenetische Veränderungen zu verstehen.

Deshalb haben wir zunächst das Ziel, die mRNA und Protein-Expression von SRC, LYN und CKB in einem großen zu bewerten Satz von GC-Proben. Dann untersuchten wir, ob diese Gene durch DNA-Methylierung im Magen-Karzinogenese reguliert werden kann. Darüber hinaus untersuchten wir die möglichen Zusammenhang zwischen der Kinase-Expression oder Methylierung und klinische Variablen sowie MYC-Expression und Methylierung.

Material und Methoden

Gewebeproben

Kinase-Expression und Methylierungsmuster wurden in 138 Paaren von GC-Proben und die entsprechenden nicht-neoplastische Magengewebeproben, erhalten von Patienten untersucht, die Gastrektomie in Nordbrasilien unterzog. Alle Patienten hatten negative Historien der Exposition entweder Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation, und es war keine Co-Auftreten von anderen Krebserkrankungen diagnostiziert. Diese Studie wurde von der Ethikkommission von João de Barros Barreto University Hospital (Protokollļ737) genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung mit Zustimmung der Ethikkommission wurde von allen Patienten erhalten vor der Probenentnahme.

Ein Teil jeder Tumor seziert Probe wurde in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE). Abschnitte von FFPE Gewebe wurden mit Hämatoxylin-Eosin für histologische Bewertung gefärbt oder für die Immunhistochemie (IHC) Analyse verwendet. Zusätzliche Abschnitte jedes Tumors und gepaart nichtneoplastische Gewebeproben wurden schockgefroren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis Protein und Nukleinsäureaufreinigung gespeichert.

Alle Proben wurden nach Laurén klassifiziert [45 ] und die Tumoren wurden nach dem TNM-Staging Kriterien statt [46]. Die Anwesenheit von Helicobacter pylori
, eine Klasse I, in Magenproben Karzinogen wurde durch die schnelle Urease-Test nachgewiesen, und seine Virulenzfaktors Zytotoxizität assoziierten Gens A (CagA-Gen) wurde durch PCR erkennen DNA unter Verwendung von gereinigten gleichzeitig mit Proteinen und mRNA, wie zuvor von unserer Gruppe durchgeführt [47]. Epstein-Barr-Virus (EBV) wurde von RNA in situ-Hybridisierung nachgewiesen [47].

49 dieser Paare von neoplastischen und nicht-neoplastischen Proben, wir das MYC-Immunreaktivität, die mRNA-Expression und Methylierung Statusdaten beurteilt zuvor von unserer Gruppe veröffentlicht [18].

Protein, mRNA und DNA-Reinigung

insgesamt Protein, mRNA, und wurden DNA gleichzeitig isoliert von Magengewebeproben die AllPrep DNA /RNA /Protein-Kit ( Qiagen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Proteinpellet wurde in einem Puffer, enthaltend 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA), und 0,5% jeweils Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 1 und 2 (Sigma, gelöst -Aldrich, USA), wie sie bereits von unserer Gruppe durchgeführt [48]. Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Verfahren von Bradford (Sigma-Aldrich, USA) bestimmt. Die RNA-Konzentration und Qualität wurden unter Verwendung eines ND-Spektrophotometer (Kisker, Deutschland) und 1% Agarose-Gelen bestimmt, respectively. Die Proben wurden bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert.

Protein Immunoreaktivität Analyse

Tumorgewebeschnitten (3 oder 4 mm dick) wurden in Xylol und rehydriert in einer abgestuften Reihe von Ethanol entparaffiniert. Nach hitzeinduzierten Epitopdemaskierung wurden die Gewebeschnitte mit primären monoklonalen Maus-Antikörper gegen SRC (Verdünnung 1: 400; Klon 28, Life Technologies, USA) inkubiert, LYN (Verdünnung 1: 400; Klon C13F9, Life Technologies, USA) oder CKB (Verdünnung 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). Eine universelle Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper-Kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) wurde für die Detektion verwendet. Wir verwendeten 3,30-Diamino-Benzidin /H _{2 O 2 (DakoCytomation, Dänemark) als Chromogen und Hämatoxylin als Gegenfärbung. Ein Protein Immunoreaktivität-positive Probe definiert wurde als eine 10% oder mehr neoplastische Zellen aufweist, die für das Protein positiv waren.}

Protein-Expressionsanalyse

Western-Blot-Analyse durchgeführt wurde, wie zuvor von unserer Arbeitsgruppe beschrieben [49]. Reduzierte Protein (25 &mgr; g) aus jeder Probe wurde durch 12,5% SDS-PAGE homogen und elektro-geblottet getrennt auf eine PVDF-Membran (Hybond-P, GE Healthcare, USA). Die PVDF-Membran wurde mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, enthaltend 0,1% Tween 20 und 5% fettarmer Milch blockiert und über Nacht bei 4 ° C mit den entsprechenden primären Antikörpern inkubiert: Anti-SRC (Verdünnung 1: 1000; Klon 28, Life Technologies, USA), Anti-LYN (Verdünnung 1: 1000; Klon C13F9; Life Technologies, USA), Anti-CKB (Verdünnung 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA) und anti-ACTB (Verdünnung 1: 250; Ac -15, Life Technologies, USA). Nach ausgiebigem Waschen wurde bei Raumtemperatur für 1 h ein mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpers hinzugefügt. Immunreaktive Banden wurden unter Verwendung des Western-Blotting-Reagens Luminol visualisiert, und die Bilder wurden mittels eines Imagequant 350 Digitalbildsystem (GE Healthcare, Schweden) erworben. ACTB wurde als Ladereferenzkontrolle verwendet.

mRNA-Expressionsanalyse

Als erstes wurde die RNA revers transkribiert die High-Capacity cDNA Archive Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Life Technologies, USA) . Komplementäre DNA wurde dann durch real-time reverse Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) verstärkt unter Verwendung von TaqMan-Sonden gekauft als Assays-on-Demand-Produkte für die Genexpression (Life Technologies, USA) und einem 7500 Fast Real-Time-PCR-Instrument (Life Technologies , USA). Das GAPDH
Gen wurde als interne Kontrolle für die RNA-Eingang gewählt und Reverse-Transkriptionseffizienz. Alle RT-qPCRs wurden dreifach durchgeführt, sowohl für die Zielgene ( SRC
: Hs01082246_m1; LYN
: Hs00176719_m1; CKB
: Hs00176484_m1) und die interne Kontrolle ( GAPDH
. NM_002046.3)

Die relative Quantifizierung der Genexpression wurde nach Livak und Schmittgen berechnet [50]. Die entsprechende Kontrollprobe wurde als Kalibrator von jedem Tumor bezeichnet.

DNA-Methylierungsanalyse

Das Methylierungsmuster und die Häufigkeit der Kinase-Gene durch Methylierung-spezifische PCR (MSP) [51] bewertet wurden. Die EZ DNA-Methylierungs-Blitz ™ Kit (Zymo Research, USA) wurde verwendet, um die gDNA durch Bisulfit-Behandlung zu verändern, nicht methylierten Cytosine in urazile Umwandlung und methylierten Cytosine unverändert bleiben. Spezifische Primer für den Gen-Promotoren, beschrieben in Tabelle 1 sind

PCR-Reaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung von 0,1 &mgr; mol /l dNTPs, 2 &mgr; mol /L MgCl _{2, 0,5 umol Primer, 1,25 U Taq DNA-Polymerase, und 100 ng Bisulfit-modifizierte DNA. Nach der anfänglichen Denaturierung für 5 min bei 94 ° C, 40 Zyklen bei 94 ° C für 45 s, die Glühtemperatur (Tabelle 1) für 45 s und 72 ° C für 30 s durchgeführt, gefolgt von einer abschließenden Erweiterung gefolgt 5 min bei 72 ° C. Die PCR-Produkte wurden direkt auf 3% Agarosegel aufgetragen und einer Elektrophorese. Das Gel wurde gefärbt mit SYBR ^{® Sichere DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) und direkt unter UV-Beleuchtung sichtbar gemacht. Als positive Kontrolle für alle MSP Reaktionen war eine gDNA Probe vollständig methylierte CpG Methylase mit (SssI, New England Biolabs, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Weiterhin Primern zur Detektion der Wildtyp-Sequenz wurden verwendet, um die vollständige Umwandlung von DNA in der Bisulfit-Reaktion erhalten überwachen}}

Die Proben geschichtet wurden, wie folgt:. 1) eine Probe wurde definiert als hypomethyliert wenn eine positive Verstärkung Produkt wurde nur in der PCR mit spezifischen Primern für unmethylierten Sequenzen detektiert wird; 2) wurde eine Probe definiert als hypermethyliert wenn positive Amplifikation nur in der PCR mit spezifischen Primern für methylierte Sequenzen festgestellt wurde; 3) eine Probe wurde als teilweise methylierte definiert, wenn eine positive Verstärkung in der PCR mit den beiden Primersätze erkannt wurde.

Die Spezifität "Primer und MSP Ergebnisse wurden bestätigt eine Bisulfit-Sequenzierung PCR (BSP) Ansatz unter Verwendung von [52] . BSP wurde auch den Prozentsatz der Methylierung zu bewerten verwendet. Die Primer und anneling Temperaturen von BSP sind in Tabelle 1 Nach der Amplifikation beschrieben, wurden die Fragmente unter Verwendung des NucleoSpin Gel und PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Deutschland) gereinigt, ligiert in pGEM T-easy Vektor (Promega, Deutschland) und kloniert in kompetente E
. coli
JM109-Zellen. Nach der Inkubationszeit wurden weiße Kolonien für PCR mit M13 vorwärts ausgewählt (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') und M13 reverse (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') Primer [53]. Nach der anfänglichen Denaturierung für 3 min bei 94 ° C bestand die PCR-Amplifikation von 35 Zyklen bei 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 90 s durchgeführt, gefolgt von einer abschließenden Erweiterung gefolgt für 5 min bei 72 ° C. Die PCR-Produkte wurden in Agarosegel visualisiert. Sechs Klone wurden für die Reinigung, ausgewählt und sequenziert in einem ABI310 automatischen Sequenzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle Sequenzen wurden mit BioEdit v7.0.5 [54] ausgerichtet ist, und die Methylierungsanalysen wurden mit dem BiQ Analyzer-Software durchgeführt [55]. Der Prozentsatz der Methylierung für jede Probe durch Dividieren der Anzahl von methylierter CpG durch die Gesamtzahl von CpGs sequenziert (CpGs in allen sechs Klone) wurde berechnet.

Statistische Analysen

Die Daten werden dargestellt wie die Frequenz, Median und Interquartilbereich (IQB). Der Shapiro-Wilk-Test wurde verwendet, um die Verteilung des Alters, mRNA, Protein-Expression und den Prozentsatz der Methylierungsdaten zu bewerten und die entsprechenden nachfolgenden Test für statistische Vergleiche zu bestimmen. Der Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um einen möglichen Zusammenhang zwischen Kinase-mRNA oder Proteinexpression und kategoriale Variablen, wie Immunreaktivität, Methylierungsmuster und klinisch-pathologischen Eigenschaften zu untersuchen. Der Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Anteil der Methylierung und Immunreaktivität und klinisch-pathologischen Eigenschaften zu untersuchen. Wilcoxon-Test wurde verwendet, um den Prozentsatz der Methylierungs zwischen Paaren von neoplastischen und nicht-neoplastischen Proben zu vergleichen. Ein Zusammenhang zwischen kategorischen Variablen wurde mit der Chi-Quadrat (χ ^{2) Test analysiert. Ein Spearman Korrelationstest wurde verwendet, um die mögliche Korrelation zwischen mRNA und Protein-Expression sowie Promotor-Methylierung zu bewerten. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen. Bonferroni Einstellung des p-Wert angewendet wurde, wenn mehrere Vergleiche durchgeführt wurden, mit der Alpha-Ebene durch die Anzahl der Vergleiche geteilt werden.}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Klinische Bedeutung von miR-137 Expression in Patienten mit Magenkrebs nach radikaler Gastrectomy
• PLoS ONE: Exclusive Association of p53-Mutation mit Super-High Methylierung von Tumorsuppressor-Gene im p53-Pathway in einer einzigartigen Magenkrebs Phenotype