Ploche ONE: deregulované Vyjadrenie SRC Lyn a CKB kináz podľa metylácie DNA a jej potenciálnej úlohy rakovina žalúdka invazívnosti a Metastasis

abstraktné

kinázy sú následní modulátory a efektory niekoľkých bunkový signálnych kaskád a hrajú kľúčovú úlohu vo vývoji neoplastických ochorení. V tejto štúdii sme sa zamerali na vyhodnotenie SRC, Lyn a CKB bielkovín a mRNA expresie, rovnako ako ich metylácie promótorom, v karcinómu žalúdka. Zistili sme, zvýšenej expresiu SRC a LYN kinázy mRNA a bielkovín, ale došlo k poklesu hladiny CKB kinázy, zmeny, ktoré môžu mať úlohu v invazívnosti a metastázovaniu nádorov žalúdka. Expresie z troch skúmaných kináz bol tiež spájaný s MYC onkogénne expresiu, možný biomarker pre rakovinu žalúdka. Pre pochopenie mechanizmov, ktoré regulujú expresiu týchto génov, sme hodnotili promótorom DNA metyláciu troch kináz. Zistili sme, že zníži SRC stroje a Lyn
metylácie a zvýšená CKB
metylácie bola spojená s rakovinou žalúdka. Znížená SRC stroje a Lyn
metylácie bola spojená so zvýšenými hladinami mRNA a proteínovej expresie, čo naznačuje, že metylácie DNA sa podieľa na regulácii expresie týchto kináz. Naopak, znížené CKB
metylácie bola pozorovaná vo vzorkách so zníženou mRNA a proteínovej expresie, bolo zistené, čo naznačuje, výraz CKB byť len čiastočne upravené metylácie DNA. Ďalej sme zistili, že zmeny v DNA metylácie vzore z troch študovaných kinázy boli tiež spojené s žalúdočnej nástupu rakoviny, rakovina žalúdka, hlbší invázie tumoru a prítomnosť metastáz. Z tohto dôvodu, SRC, LYN a CKB výraz alebo metylácie DNA by mohli byť užitočné markerov pre predikciu progresie nádoru a cielenie do stratégií proti rakovine

Citácia :. Mello AA, MF Leal, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, hora RC, et al. (2015) deregulované Vyjadrenie SRC Lyn a CKB kináz podľa metylácie DNA a jej potenciálnej úlohy rakovina žalúdka invazívnosti a metastázovaniu. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492

Editor: Jose G. Trevino, University of Florida, Spojené štáty

prijatá: May 27, 2015; Prijaté: 25.září 2015; Uverejnené: 13. októbra 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto štúdia bola podporená Conselho Nacional de Desenvolvimento científica e Tecnológico (CNPq; grantyǗ072 /2012-5 a 402283 /2013-9; priateľstva MCS a RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa robiť Pará (FAPESPA; udeliť #ICAAF 123/2014 na RRB) a Fundação de Amparo à Pesquisa robiť Estado de Sao Paulo (FAPESP; grantÈ9 /07145-9, priateľstvo, aby MFL) as granty a priateľstva ocenenie. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je štvrtým najčastejším typom rakoviny a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete [1]. Liečba GC v pokročilých štádiách aj naďalej zložitá, a prognóza je stále zlá, čiastočne v dôsledku lokálnej recidívy, invázie nádoru a /alebo metastáz. Celkové pomernej 5-ročné prežitie je v súčasnej dobe nižšia ako 20% [2]. Lepšie pochopenie biológiu progresie tohto neoplázie je zásadný pre zníženie miery úmrtnosti s vývojom nových riadenia pacienta a terapeutické stratégie.

Phosphotransferases, známy tiež ako kinázy, sú modulátory a následné efektory niekoľko bunkové signálne kaskády a hrajú kľúčovú úlohu v rozvoji novotvaroch [3]. K dnešnému dňu lieky niekoľko proteín kinázy-interagujúce bola registrovaná pre klinické štúdie [4]. Predtým sme vykonaný skríning na identifikáciu kináz proteínov vyjadrené v GC s použitím Zachytenie zlúčeniny hmotnostnej spektrometrie [5, 6] (S1 File) a 22 kinázy bielkoviny, vrátane SRC Lyn a CKB, boli zistené (S1 tabuľka). Tieto tri kinázy boli vybrané pre ďalšie vyšetrovanie (S1 Obr).

SRC bol prvý preto-onkogén objavil, a hrá ústrednú úlohu v bunkovej ciest prenosu signálov. Aberantne SRC aktivita je pozorovaná v niekoľkých ľudských nádorov, vrátane GC [7-9], a to môže byť v priebehu vývoja nádoru a progresie [10, 11] dôležité. Mitogénnu funkcie SRC je, aspoň čiastočne, sprostredkovanú indukciu MYC, regulátor bunkového cyklu a transkripčný faktor [12, 13]. Naša skupina už skôr popísaná myc upregulaci v ľudskej GC a N-metyl-nitrosomočovina ošetrených primátov [14-19]. Vzhľadom k tomu, aktivácia SRC, ako aj ďalších kináz, má pleiotropické účinky, ktoré závisí od typu buniek a kontexte [20], je stále dôležité pochopiť možný vzťah medzi kináz a MYC prejavu v žalúdočnej karcinogenéze a molekulárneho mechanizmu podieľajú na ich reguláciu.

LYN je ďalším členom rodiny SRC kináz, a Lyn
gén je umiestnený na chromozóme 8q13. Naša skupina už bolo skôr oznámené prítomnosť zisky chromozóme 8 (na ktorom MYC
gén je tiež umiestnený) v prípadoch, GC zo severnej Brazílii [16, 21-23] a vo všetkých bunkových líniách GC nadviazaných z novotvarov v táto populácia [24, 25]. Preto sa tento chromozóm môžu obsahovať významné gény zapojené do žalúdočnej karcinogenéze. Pokiaľ je nám známe, žiadna predchádzajúca štúdia skúmala úlohu Lyn a jej regulácie v GC. Avšak, LYN nadmerná expresia bola zaznamenaná u niekoľkých druhov rakoviny [26-32]. Okrem regulácie LYN
podľa metylácie DNA bola preukázaná v oboch kolorektálneho karcinómu a Ewingov sarkóm [33, 34] a Lyn
metylácie bola pozorovaná v niektorých hematopoetických a nehematopoetického bunkové línie [35]. DNA metylácie je molekulárnej modifikácie DNA, ktorá je pevne spojená s funkciou génové a bunkové funkcie génu špecifický typ [36]. Okrem toho, DNA metylácie môže byť robustné biomarker, pretože je oveľa stabilnejší ako RNA alebo proteínu, a preto je sľubným cieľom pre vývoj nových prístupov pre diagnózu a prognózu rakoviny [36].

CKB je jedným z dvoch izoforiem cytosolu kreatínkinázy a môžu sa zúčastniť metabolických procesov zahŕňajúcich glykolýzy v non-svalových bunkách [37]. Na rozdiel od normálnych buniek, ktoré sa v prvom rade výrobe energie cez oxidačné fosforylácie, väčšina rakovinových buniek dáva prednosť aeróbne glykolýzy, ktorý je známy ako účinok Warburg [38]. Je zaujímavé, že MYC onkogén aktivovať niekoľko glukózy transportéry a glykolytickej enzýmy, a tým prispieť k efektu Warburg [39]. Naše predchádzajúce proteomický Štúdia odhalila, že niektoré proteíny podieľajúce sa na výrobných procesoch energie boli deregulované vo vzorkách GC a zosilnený účinok Warburg v tejto neoplázie [40]. Úloha CKB v GC zostáva zle pochopil: Niektoré štúdie transkriptomických ohlásil upregulaci CKB
vo vzorkách GC [41, 42], zatiaľ čo iný ukázal CKB
zníženie expresie [43]. Okrem toho, ako u Lyn
génu, CKB
metylácie bola už skôr popísaná v hematologických a solídnych nádorových bunkových línií, vrátane GC bunkové línie [44]. Metylácia CKB
Zdá sa, že v súvislosti s jeho zníženie úrovne expresie; Avšak, ďalšie vyšetrovanie, je stále potrebné na pochopenie regulácia CKB
podľa epigenetických modifikácií.

Preto sme sa prvýkrát za cieľ vyhodnotiť výraz mRNA a proteínov SRC Lyn a CKB vo veľkom sada vzoriek GC. Potom sme hodnotili, či tieto gény môžu byť upravené metylácie DNA v žalúdočnej karcinogenéze. Ďalej sme skúmali možný vzťah medzi expresiou kinázy alebo metylácie a klinických premenných, ako aj MYC expresie a metylácie.

Materiál a metódy

Vzorky tkaniva

kinázy a výraz metylácie vzory boli hodnotené v 138 párov vzoriek GC a ich zodpovedajúcich nenádorových vzoriek žalúdočnej tkanív získaných od pacientov, ktorí podstúpili gastrektómii v severnej Brazílii. Všetci pacienti mali negatívny minulosti vystavenie buď chemoterapiu alebo rádioterapiu pred operáciou, a tam bol žiadny co-výskyt ďalších diagnostikovaných nádorov. Táto štúdia bola schválená etickou komisiou João de Barros Barreto fakultnej nemocnice (Protocolļ737). Písomný informovaný súhlas so súhlasom etickej komisie bol získaný od všetkých pacientov pred odberom.

Súčasťou každého členitý vzorka nádoru bola formalínu fixované a parafínu zaliate (FFPE). Úseky FFPE tkaniva boli zafarbené hematoxylínom a eosínu pre histologické vyhodnotenie, alebo použité pre imunohistochemické analýzy (IHC). Ďalšie dávky každého nádoru a párové vzorky non-neoplastické tkanivá boli snap-zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri -80 ° C až do proteínu a purifikáciu nukleových kyselín.

Všetky vzorky boli klasifikované podľa Lauren [45 ], a nádory boli predstavené v súlade s kritériami TNM zastávky [46]. Prítomnosť Helicobacter pylori
, trieda I karcinogén, v žalúdočných vzoriek bola zistená rýchlym ureasovým testom, a jej faktor virulencie cytotoxicity spojený gén A (ČAGA gén) bol detekciu pomocou PCR pri použití DNA čistená súčasne s proteínmi a mRNA, ako bolo predtým vykonávané našej skupiny [47]. Epstein-Barr vírus (EBV), bola detekovaná RNA in situ hybridizácia [47].

49 týchto párov nádorových a nenádorových vzoriek, sme hodnotili MYC imunoreaktivitu, mRNA a metylačného statusu dát skôr publikoval našej skupiny [18].

proteín, mRNA a DNA čistenie

Celkový proteín, mRNA, DNA a boli súčasne izolované zo vzoriek žalúdočnej tkaniva pomocou AllPrep DNA /RNA /proteín Kit ( Qiagen, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu. Proteín Peleta sa rozpustí v pufri obsahujúcom 7 M močoviny, 2 M tiomočoviny, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA) a 0,5% každého fosfatáza Inhibitor Cocktail 1 a 2 (Sigma -Aldrich, USA), ako bolo predtým vykonávané našej skupiny [48]. Koncentrácia proteínov bola stanovená metódou podľa Bradford (Sigma-Aldrich, USA). Koncentrácia RNA a kvalita boli stanovené za použitia spektrofotometra Nanodrop (Kisker, Nemecko) a 1% agarosovém gélu, v danom poradí. Vzorky boli skladované pri -80 ° C až do použitia.

Proteín imunoreaktivita analýza

úseky nádorové tkanivo (3 alebo 4-mm) boli zbavené parafínu v xyléne a rehydratované v odstupňované rade etanolu. Po tepelnom vyvolané vyhľadanie epitopu, tkanivové rezy boli inkubované s primárnou myšou monoklonálne protilátky proti SRC (riedenie 1: 400, klon 28, Life Technologies, USA), LYN (riedenie 1: 400, klon C13F9, Life Technologies, USA), alebo CKB (riedenie 1: 250, HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). Súprava sekundárne protilátka univerzálny peroxidázou konjugovanou (LSAB System, DakoCytomation, USA) bol použitý na detekciu. Použili sme 3,30-diamino-benzidín /H _{2O 2 (DakoCytomation, Dánsko) ako chromogénu a hematoxylínom ako kontrastným farbivom. Proteín imunoreaktivita-pozitívna vzorka bol definovaný ako taký, ktorý má 10% alebo viac neoplastických buniek, ktoré boli pozitívne na proteínu.}

Expresia proteínu analýza

analýza Western blot bola vykonaná ako bolo opísané skôr našej skupiny [49]. Znižuje proteín (25 ug) z každej vzorky sa oddelí 12,5% homogénna SDS-PAGE a elektro-prenesené na PVDF membránu (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF membrána bola blokovaná s fosforečnanom pufrovanom soľnom roztoku obsahujúcom 0,1% Tween 20 a 5% nízkotučného mlieka a inkubuje sa cez noc pri 4 ° C so zodpovedajúcimi primárnymi protilátkami: anti-SRC (riedenie 1: 1000; klon 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (riedenie 1: 1000; klon C13F9, Life Technologies, USA), anti-CKB (riedenie 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA), a anti-ACTB (riedenie 1: 250; Ac -15, Life Technologies, USA). Po dôkladnom premytí, sekundárnou protilátkou s peroxidázou konjugovanou sa pridal po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Imunoreaktívnych pásy boli vizualizované za použitia Westernového prenosu Luminol činidlo, a obrazy boli získané pomocou ImageQuant 350 digitálneho zobrazovacieho zariadenia (GE Healthcare, Švédsko). ACTB bola použitá ako nakladacia referenčná kontrola.

mRNA expresie analýza

Po prvé, RNA bola reverzne transkribovaných s použitím High-Capacity cDNA Archive Kit podľa protokolu výrobcu (Life Technologies, USA) , Komplementárna DNA potom bola amplifikovaná pomocou real-time reverznej transkripcie kvantitatívnej PCR (RT-qPCR) s použitím TaqMan sond zakúpené as Testy na vyžiadanie pre génovú expresiu (Life Technologies, USA) a 7500 Fast real-time PCR prístroje (Life Technologies , USA). GAPDH
gén bol vybraný ako vnútorná kontrola pre vstup RNA a reverznej transkripcii účinnosť. Všetky RT-qPCRs vykonávali v triplikátech na oboch cieľových génov ( SRC
: Hs01082246_m1; LYN
: Hs00176719_m1; CKB
: Hs00176484_m1) a vnútorná kontrola ( GAPDH
:. NM_002046.3)

relatívnej kvantifikácie génovej expresie bola vypočítaná podľa Livak a Schmittgen [50]. Zodpovedajúce kontrolná vzorka bol označený ako kalibrátora z každého nádoru.

metylácie DNA analýza

Metylácia vzor a frekvencia kinázy génov boli hodnotené metylácie špecifickou PCR (MSP) [51]. Kit EZ DNA metylácie-Lightning ™ (Zymo Research, USA) bola použitá na úpravu gDNA pôsobením bisulfitového, konverzia nemethylované cytozín do uracil a opustenie methylata cytozín bezo zmeny. Špecifické priméry na promótory génov sú uvedené v tabuľke 1.

PCR reakcie boli vykonávané za použitia 0,1 umol /L dNTP, 2 pmol /l MgCI _{2, 0,5 umol primérov, 1,25 U Taq DNA polymerázy, a 100 ng hydrogensiričitan modifikované DNA. Po počiatočnej denaturáciu 5 minút pri 94 ° C, 40 cyklov pri 94 ° C počas 45 s, teplota žíhanie (tabuľka 1) po dobu 45 sekúnd a 72 ° C počas 30 s bolo vykonané, po ktorom nasleduje konečné predĺženie o 5 min pri 72 ° C. PCR produkty boli priamo nanesené na 3% agarosovém gélu a elektroforeticky. Gél bol zafarbený SYBR ^{® Safe DNA gél Stain (Life Technologies, USA) a priamo vizualizujú pod UV osvetlením. Ako pozitívna kontrola pre všetky reakcie MSP, vzorka gDNA bola úplne methylata CPG pomocou metyláza (SSSI, New England Biolabs, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Okrem toho, priméry na detekciu sekvencie divokého typu sa použili na monitorovanie úplnej konverzie DNA získanej v bisulfitová reakcie}}

Vzorky boli rozdelené nasledovne :. 1), vzorka bol definovaný ako hypomethylated keď Pozitívne amplifikácie produkt bol detekovaný iba v PCR so špecifickými primermi pre nemethylovaných sekvencie; 2) vzorka bol definovaný ako hypermethylated, kedy bol detekovaný iba Pozitívne amplifikácie v PCR so špecifickými primermi pre metylovaných sekvencie; 3) vzorka bol definovaný ako čiastočne metylovaný, keď sa zistili Pozitívne amplifikácie v PCR s dvoma sadami primerov.

špecifickosť Primery "a výsledky MSP boli potvrdené pomocou PCR prístupu hydrogensiričitan radenia (BSP) [52] , BSP boli taktiež použité pre vyhodnotenie percenta metylácie. Primery a anneling teploty BSP sú popísané v tabuľke 1. Po amplifikáciu, fragmenty boli čistené s použitím NucleoSpin Gel a PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Nemecko), ligován do pGEM T-Easy Vector (Promega, Nemecko) a klonovaný do kompetentných E
. coli JM109
bunky. Po inkubačnej dobe sa biele kolónie boli vybrané pre PCR s M13 vpred (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') a M13 reverse (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') priméry [53]. Po počiatočnej denaturáciu po dobu 3 minút pri teplote 94 ° C, amplifikácia PCR sa skladala z 35 cyklov pri 94 ° C počas 30 s, 55 ° C počas 30 s a 72 ° C počas 90 sekúnd boli vykonané, nasleduje finálny rozšírenie pre 5 min pri teplote 72 ° C. PCR produkty boli vizualizované na agarózovom gélu. Šesť klony boli vybrané pre čistenie a sekvenované v systéme automatického sekvencéri ABI310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Všetky sekvencie boli porovnané s BioEdit v7.0.5 [54], a metylácie analýzy boli vykonané pomocou softvéru BIQ Analyzer [55]. Percento metylácie pri každej vzorke sa vypočíta vydelením počtu metylovaných CPG celkovým počtom CPG CPG sekvenovania (vo všetkých šiestich klonov).

štatistickej analýzy

Údaje sú uvedené ako frekvencia, strednej a kvartily rozsahu (IQR). Test Shapiro-Wilk bol použitý pre vyhodnotenie rozloženie veku, mRNA, expresie proteínu a percento metylácie dát a pre určenie vhodnej následných testov na štatistické porovnanie. Test Mann-Whitney sa používa na skúmanie možných spojení medzi kinázy mRNA alebo proteínové expresie a kategorické premenné, ako je imunoreaktivita, metylácie vzor a klinicko-funkcií. Test Mann-Whitney sa používa na skúmanie možných asociáciou medzi percento metylácie a imunoreaktivity a klinicko-funkcií. Wilcoxonův test bol použitý pre porovnanie percento metylácie medzi párov nádorových a nenádorových vzoriek. Súvislosť medzi kategorické premenné bola analyzovaná s použitím Chi-kvadrát (χ ^{2) test. Korelácia Test Spearman bol použitý pre vyhodnotenie potenciálneho koreláciu medzi mRNA a proteínovej expresie, rovnako ako metylácie promótorom. Hodnota p nižšia ako 0,05 bola považovaná za významnú. Bonferroniho úprava p-hodnota bola použitá, keď bolo uskutočnených niekoľko porovnaní s úrovňou alfa sa vydelí počtom porovnávanie.}

Výsledky

kinázy výraz v nádorov žalúdku

Non-atypické žalúdočné bunky nepredstavoval SRC alebo LYN imunoreaktivitu (obr 1A a 1C). Avšak, SRC imunoreaktivita bola pozorovaná u dysplastických bunkách. Bunkové membrány a cytoplazmatická imunoreaktivita pre SRC a LYN bola zistená u neoplastických buniek (obr 1B a 1D), a LYN prezentované nukleové imunoreaktivitu. CKB imunoreaktivita bola detekovaná v cytoplazme alebo v bunkovej membráne v nenádorových žalúdočných buniek (obr 1e). Naproti tomu, bunky GC nepredstavovala CKB imunoreaktivitu (obrázok 1F).

SRC, LYN a CKB imunoreaktivita bola zistená u 72 (52,2%), 66 (47,8%) a 0 (0%) nádoru vzorky. SRC a LYN imunoreaktivita boli spojené s vyššou úrovňou mRNA a proteínov vo vzorkách GC (p nižšie ako 0,001 pri všetkých porovnaniach; Mann-Whitney testu, obr 2A, 2C, 2E a 2G). Úrovne proteínovej a mRNA SRC boli zvýšené najmenej 1,5-krát (najmenej 50% nárast v expresii) v 67 (48,6%) a 80 (58%), respektíve vzorky GC vo vzťahu k ich uzavreté nenádorových žalúdočných vzorky (obr 2B, 2D a 2K). Okrem toho, proteín a hladiny mRNA LYN boli zvýšené aspoň 1,5-násobne v 36 (26,1%) a 72 (52,2%) vzoriek GC, v danom poradí (obr 2F, 2H a 2K). Naopak, downregulaci CKB proteínu a mRNA (najmenej 50% pokles expresie) bola zistená 104 (75,4%) a 49 (35,5%) vzoriek GC, v danom poradí (obr 2I, 2J a 2K). Silná a priama korelácia bola pozorovaná medzi mRNA a expresiu proteínu pre SRC (p < 0,001, ρ = 0.856, Spearmanův korelačný test), LYN (p < 0,001, ρ = 0,762) a CKB (p < 0,001, ρ = . 0,819)

imunoreaktivita SRC bolo spojené s imunoreaktivity LYN (p 0,001, χ ^{2 test), 52 (37,7%) vzoriek GC predstavujú imunoreaktivitu pre oba proteíny. Okrem toho, priama korelácia bola pozorovaná medzi SRC a LYN proteínu (p 0,001, ρ = 0,556) a mRNA (p 0,001, ρ = 0,779) expresiu. Hladiny CKB proteínu a mRNA expresie bol nepriamo úmerná SRC (p 0,001, ρ = -0,734; p 0,001, ρ = -0,806, v tomto poradí) a LYN (p 0,001, ρ = -0,643; p . < 0,001, ρ = -0,703, v tomto poradí)}

Tabuľka 2 ukazuje výsledky pre SRC, LYN a CKB prejavu a klinicko vlastnosti. Nádory z pacientov s neskorým nástupom GC vykazuje mimoriadne vyššiu SRC a Lyn proteínu (podľa IHC a western blotting) a mRNA (RT-qPCR) expresie, rovnako ako zníženej CKB expresie proteínu metódou Western blot, v porovnaní s včasným začiatkom CG vzorky (p menšie ako 0,05, pre všetky porovnania, tabuľka 2). Zvýšená proteín a mRNA expresie SRC a LYN a zníženie expresie CKB boli spojené s pokročilom štádiu, hlbší invázie tumoru, a prítomnosť lymfatických uzlín a vzdialených metastáz (p menšie ako 0,05, pre všetky porovnania, tabuľka 2)
<. p> postupný významný nárast proteínu Src (western blot) a mRNA expresie bol pozorovaný zodpovedajúci fáze nádoru (p < 0,008, pre väčšinu z porovnania, Mann-Whitney testu a následne Bonferroniho korekcia; Obr 3A a 3B) , Na rozdiel od toho postupné výrazný pokles expresie proteínu CKB a mRNA sa pozorovala, čo zodpovedá štádiu nádoru (p < 0,008, pre väčšinu z porovnania, obr 3G a 3 H). S ohľadom na LYN prejavu, sme nespozorovali významný rozdiel medzi fázou I a II alebo medzi jednotlivými stupňami III a IV. Avšak, fáza I a II boli významne odlišné od etapy III a IV (p < 0,008, na základe týchto porovnaní, 3D a 3E Obr).

kinázy génu metylácie vzory v Vzorky žalúdočných

Tabuľka 3 ukazuje metylačnej vzorec študovaných proteínkinázy v nádorových a nenádorových žalúdočné vzorkách MSP. Približne 60% a 30% vzoriek GC prezentované Pozitívne amplifikácia len s nemethylovaný sady primérov (hypomethylated vzoriek) SRC stroje a Lyn
gény, respektíve (obr 4A a 4B). Hypometylácie týchto génov nebol pozorovaný ani v jednom non-neoplastických vzorky. Z tohto dôvodu, frekvencia SRC stroje a Lyn
hypomethylace bol v GC významne vyššia ako u non-neoplastických žalúdočných vzoriek (p 0,001, pre všetky porovnanie, po ktorom nasleduje χ ^{2 Test podľa Bonferroniho korekciou).}

analýza BSP potvrdila analýza MSP. Tým, BSP, 82 (59,4%) nádorových vzoriek a 0 (0%) z nenádorových vzoriek predstavila klonované sekvenciu bez CPG metylácie v src
promótor. Okrem toho, 4 (2,89%) a 1 (0,72%), nádorových a nenádorových vzoriek predstavila klonované sekvenciu bez CPG metylácie v Lyn
promótorom, v danom poradí. Tým, BSP, percento SRC
[0,135 (0,31) oproti
0,563 (0,23); p < 0,001] a LYN
[0,238 (0,40) oproti
0,7063 (0,26); p < 0,001] metylácie bolo v nádorových vzorkách nižšia ako u nenádorových vzoriek (Obr 5A a 5B).

SRC stroje a Lyn
metylácie vzory neoplastických a non -neoplastic vzorky zatiaľ čo zistené, že je spájaný (P 0,001 pre obe analýzy; χ ^{2 test). Pozorovali sme, že 70/81 (86,4%) nádorov s hypomethylated SRC
prezentovaných čiastočné metylácii tohto génu v krytej non-neoplastických vzorky. Okrem toho sme zistili, že 37/41 (90,24%) nádorov s hypomethylated LYN
prezentované čiastočné metylácii tohto génu v krytej non-neoplastických vzorky. SRC stroje a Lyn
parciálny metylácie v nenádorových vzoriek bola častejšie pozorovaná u osôb, ktoré predkladajú nádorových vzoriek s hypometylácii tohto génu v porovnaní s nádormi s čiastočným metylácie (p nižšie ako 0,001, pre oboch analýz) alebo hypermetylace (P 0,001 pre obe analýzy). Okrem toho, čiastočne methylata LYN
v non-neoplastických vzoriek bola tiež častejšie detekovaná u osôb, ktoré predkladajú vzoriek nádorových s čiastočným metylácie tohto génu v porovnaní s nádormi s hypermetylace (p = 0,004). Tým, BSP, sme tiež poznamenal, že percento SRC
(p nižšie ako 0,001, pM = 0.6902; obr 5D) a Lyn
(p nižšie ako 0,001, ρ = 0,739, obr 5E ) metylácie nádorových a nenádorových vzorky boli korelované.}

CKB
čiastočný a hypomethylace bola pozorovaná ako v neoplastických a non-neoplastických vzoriek. Avšak, 48 (39%) vzoriek GC prezentované CKB
hypermetylace (obr 4C), ktorá sa nezistí v nenádorových vzoriek. Navyše frekvencia CKB
-hypermethylated vzorky bola významne vyššia v porovnaní s neoplastickou nenádorových žalúdočných vzoriek (p 0,001), a CKB
parciálny metylácie bola tiež významne častejšie GC než u nenádorových vzoriek (p 0,001). Tým, BSP, percento CKB
metylácie bolo v nádorových vzorkách vyššia ako u nenádorových vzoriek [0,511 (0,42) oproti
0,133 (0,12); p < 0,001; Obr 5C]. Klonované sekvencie bez CPG metylácie bola detekovaná v 4 (2,89%) a 0 (0%) nádorových a nenádorových vzoriek, v danom poradí.

CKB
metylácie vzor neoplastických a non -neoplastic vzorky sa zdalo byť spájaný (p = 0,014, podľa × ^{2 testu). Analýza 2x2 pomocou χ 2 testu ukázal, že páry, v ktorých boli vzorky nádorové prezentované hypermethylated CKB stroje a zodpovedajúce nenádorových vzorky prezentované hypometylácii tohto génu boli častejšie než párov nádorov s hypermetylace a uzavreté nenádorových vzoriek s čiastočným metylácie (p = 0,0381), ale tento nález nedosiahlo štatistickej významnosti, pokiaľ bola aplikovaná úprava Bonferroniho (upravený α = 0,05 /3 = 0,0167). Avšak tým, že BSP, sme pozorovali, že percento CKB
metylácie nádorových a nenádorových vzoriek bola nepriamo úmerná (p 0,001, ρ = -0,375, obr 5F).}

priama korelácia bola pozorovaná medzi SRC stroje a Lyn
metylácie vzory v nenádorových vzoriek (p nižšie ako 0,001, ρ = 0,627). Okrem toho sa zistila inverzný korelácia medzi SRC stroje a CKB
(p nižšie ako 0,001, pM = -0.467) a LYN stroje a CKB
(p < 0,001, ρ = -0,359) metylácie. Avšak, vo vzorkách GC, priama korelácia bola pozorovaná medzi metylácie percento z troch študovaných kináz: SRC stroje a Lyn
(p 0,001, ρ = 0,840); SRC stroje a CKB
(p < 0,001, ρ = 0,684); LYN stroje a CKB
(p < 0,001, ρ = 0,663).

regulácia metylácie kinázy

Na objasnenie epigenetické regulácii skúmaných gény, sme hodnotili možnú súvislosť medzi metylácie promótorom a proteín imunoreaktivity a mRNA a expresiu proteínu (westernovým prenosom)

Pozorovali sme, že obe mRNA a proteín vyjadrenie SRC (p. < 0,001, ρ = -0,834; p 0,001, ρ = -0,718, v uvedenom poradí; obr 6A a 6B) a LYN (p 0,001, ρ = -0,792; p 0,001, ρ = -0,654, v uvedenom poradí; obr 6D a 6E) bola nepriamo úmerná k percento metylácie promótorom. Okrem toho, nádory s SRC [0,062 (0,08) proti
0,375 (0,33); p < 0,001; Mann-Whitney testu; Obr 6C] a LYN [0,127 (0,11) proti
0,500 (0,39); p < 0,001; Obr 6F] imunoreaktivita prezentované nižšie percento metylácie ako nádoru chýba tohto proteínu imunoreaktivitu

Pokiaľ ide o reguláciu CKB, priama korelácia bola pozorovaná medzi percentom metylácie a CKB mRNA a expresiu proteínu (p. ≪ 0,001, ρ = 0,684; p 0,001, ρ = 0,686, v danom poradí, obr 6G a 6 H). Je zaujímavé, že zvýšená CKB proteín a mRNA expresie bol pozorovaný v nádoroch s hypomethylated CKB
promótor v porovnaní s nádormi s čiastočne methylata promótor (p = 0,015, p = 0,008, v danom poradí; Mann-Whitney testu a následne Bonferroniho korekciou S1 obr). Avšak, nádory s hypermethylated CKB
promotér tiež prezentované zvýšenú bielkovinu a expresie mRNA v porovnaní s nádormi s čiastočne methylata promótor (p < 0,001 pre obe porovnania).

metylácie promotérov kinázy a klinicko-patologické premenné

V non-neoplastických žalúdočnej sliznice, percento SRC
(p = 0,010, ρ = -0,218) a Lyn
(p = 0,003, ρ = -0,248) metyluje (slabo) nepriamo koreluje s vekom pacientov pri operácii, aj keď žiadna iná združenia bolo pozorované medzi percentom metylácie a pohlavia, H
. pylori stroje a infekcie EBV v nenádorových vzoriek (p > 0,05; Mann-Whitney test).

Tabuľka 4 ukazuje vzťahy medzi percento metylácie vo vzorkách GC a klinicko-charakteristiky , V nádorových vzoriek percento SRC
(p = 0,002, ρ = -0.267), Lyn
(p = 0,014, ρ = -0.208) a CKB
(p = 0,024, ρ = -0,192) metyluje (slabo) nepriamo koreluje s vekom pacientov v čase operácie. Okrem toho sa podiel SRC
(p = 0,002), Lyn
(p = 0,015) a CKB
(p = 0,024), metylácie bola nižšia v neskorom nástupom než v skorým začiatkom vzoriek GC. Ďalej sme pozorovali, že SRC metylácie bola nižšia v non-kardio GC vo vzťahu k kardio GC (p = 0,028).

Znížené percento SRC
, LYN
a CKB
metylácie boli spojené s pokročilom štádiu, hlbšie invázie tumoru a prítomnosť lymfatických uzlín a vzdialených metastáz (p menšie ako 0,05 pre všetky porovnania, tabuľka 4). Porovnanie SRC stroje a Lyn
metylácie vzor od MSP a klinicko-charakteristiky prezentované podobné výsledky (S2 tabuľka). Avšak, čiastočné metylácie CKB
podľa MsP bolo tiež častejšie vyskytujú ako hypermetylace v T3 /T4 tumorov (p = 0,008; S2 tabuľka). CKB
parciálny metylácie bola tiež častejšia než hypermetylace (p 0,001) a hypomethylace (p = 0,009; S2 tabuľka). U nádorov od jedincov s vzdialených metastáz v súvislosti s nádormi od jednotlivcov bez vzdialenej metastázy

a postupný pokles v percentách SRC stroje a Lyn
metylácie bola pozorovaná zodpovedajúce stupňu nádoru (p < 0,008, pre väčšinu z porovnania; Mann-Whitneyho testu nasledované Bonferroniho korekciou, obr 3C a 3F). S ohľadom na CKB
metylácie, 12 z 14 (85,7%) vzoriek GC vo fáze I prezentované 73,3% metylácie. Percento CKB
metylácie bola vyššia v stupni I, ako v niekoľkých fázach II, III a IV (p < 0,008, pre väčšinu z týchto porovnaní Obr 3I). Naopak, percento CKB
metylácie bola významne znížená v štádiu IV vo vzťahu k ostatným etapách (p < 0,008, za týchto porovnaní, obr 3I).

kinázy a Myc vzťahy

skúmali sme MYC imunoreaktivitu, expresie mRNA a dáta o stave metylácie pre sadu 49 študovaných párov nádorových a nenádorových vzoriek. Yang et al.

• Ploche ONE: klinický význam MIR-137 expresie u pacientov s karcinómom žalúdka po radikálnej gastrektómia
• Ploche ONE: Exkluzívne Association of p53 mutácie sa Super-High metylácie nádorových supresorových génov v p53 v jedinečnom Žalúdočné Cancer Phenotype