PLoS ONE: nereguliuojamoje išraiška SRC, Lyn CKB kinazės DNR metilinimo ir jos galimą vaidmenį skrandžio vėžio invazijos ir Metastasis

Anotacija

kinazės yra tolesni moduliatoriai ir vykdymo kelių ląstelių signalinių kaskadomis ir vaidina pagrindinius vaidmenis neoplastinių ligos eigą. Šiame tyrime siekėme įvertinti SRC, Lyn CKB baltymų ir iRNR raiška, taip pat jų promotorių metilinimas, skrandžio vėžio. Mes nustatėme padidėjusį išraišką SRC ir Lyn kinazės mRNR ir baltymų, bet sumažėjo lygius CKB kinazės, pokyčių, kurie gali turėti vaidmenį invazijos ir metastazių skrandžio navikų. Išraiška trijų tiriamųjų aktyvumo taip pat buvo susijęs su MYC onkogeno išraiškos, galimas biologinis žymuo skrandžio vėžio. Norėdami suprasti mechanizmus, kurie reguliuoja šių genų ekspresiją, mes įvertino DNR promotoriaus metilinimas trijų kinazės. Mes nustatėme, kad sumažintas SRC parsisiųsti ir Lyn
metilinimas ir padidėjo CKB
metilinimas buvo susijęs su skrandžio vėžiu. Sumažintas SRC parsisiųsti ir Lyn
metilinimas buvo susijęs su padidėjusiu mRNR ir baltymų ekspresijos, o tai rodo, kad DNR metilinimas dalyvauja reguliuojant šių kinazės išraiška. Ir atvirkščiai, sumažinamas CKB
metilinimas buvo pastebėtas mėginių riboto mRNR ir baltymų raiškos, buvo nustatyta rodo CKB išraiška turi būti tik iš dalies reguliuoja DNR metilinimo. Be to, mes nustatėme, kad pakitimai DNR metilinimo modelio trijų tiriamųjų aktyvumo taip pat buvo susijęs su skrandžio vėžiu pradžios, išplitusiu skrandžio vėžiu, giliau naviko invazijos ir metastazių buvimas. Todėl, SKC, Lyn CKB išraiška arba DNR metilinimas gali būti naudinga žymekliai prognozuoti naviko progresavimą ir orientuojantis į priešvėžinių strategijas

nurodomoji dalis:. Mello A., Leal MF Rey JA Pinto GR, Lamarão LM, juodkalnija RC, ir kt. (2015) nereguliuojamoje išraiška SRC, Lyn CKB kinazės DNR metilinimo ir jos galimą vaidmenį skrandžio vėžio invazijos ir metastazes. PLoS ONE 10 (10): e0140492. Doi: 10,1371 /journal.pone.0140492

redaktorius: Chosė G. Trevino, Floridos universitetas, JAV

Įstojo: Gegužės 27, 2015; Priimta rugsėjo 25, 2015 m Paskelbta: Vasaris 13, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Mello et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis tyrimas parėmė Conselho Nacional de Header Científico e Tecnológico (CNPq; dotacijosǗ.072 /2012-5 ir 402.283 /2013-9; bendravimas su MCS ir RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa padaryti Para (FAPESPA; suteikti #ICAAF 123/2014 į RRB) ir Fundação de Amparo à Pesquisa padaryti Estado de São Paulo (FAPESP; dotacijaÈ9 /07.145-9; bendravimas su MFL), kaip dotacijos ir stipendijų apdovanojimai. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirta dažniausia vėžio tipą ir antras didžiausias priežastis, dėl vėžio mirtingumo pasaulyje [1]. Gydymas GC ne stadijose vis dar sunku, o prognozės vis dar prastas, iš dalies dėl vietos pasikartojimo, naviko invazijos ir /arba metastazių rezultatas. Bendras santykinis 5-metų išgyvenamumas yra šiuo metu mažiau nei 20% [2]. Geresnis supratimas šio navikų progresavimo biologijos yra labai svarbus siekiant sumažinti mirtingumą su nauju pacientui gydyti ir gydymo strategijas.

fosforiltransferazės, taip pat žinomas kaip kinazės yra tolesni moduliatoriai ir vykdymo kelių ląstelių signalinių kaskadomis ir vaidina pagrindinius vaidmenis navikinių ligų [3] plėtrai. Iki šiol, keletas baltymų kinazės-bendrauja narkotikai buvo užregistruota klinikinių tyrimų [4]. Mes anksčiau vykdyta atranka nustatyti kinazės baltymus išreikštų GC naudojant "Capture Kombinuotieji masių spektrometrija [5, 6] (S1 failą) ir 22 kinazės baltymų, įskaitant SRC, Lyn CKB, buvo aptikta (S1 lentelę). Šie trys kinazės buvo atrinkti papildomus tyrimus (S1 pav).

SRC buvo pirmasis Proto-onkogeno atrado, ir vaidina pagrindinį vaidmenį ląstelių signalo perdavimo kelius. Netipinė SRC veikla pastebėta keliomis žmogaus vėžio, įskaitant GC [7-9], ir tai gali būti svarbu per naviko vystymąsi ir progresavimą [10, 11]. Mitogeninis funkcija SRC yra, bent jau iš dalies, tarpininkaujant myc, mobiliojo ciklo reguliatoriaus ir transkripcijos faktorius [12, 13] indukcijos. Mūsų grupė buvo aprašyta anksčiau Myc ląstelę žmogaus GC ir N-metil-nitrozokarbamidu gydytų nežmoginių primatų [14-19]. Kadangi SRC aktyvavimo, taip pat kitų kinazės, turi pleiotropic poveikį, kuris priklauso nuo ląstelės tipo ir kontekste [20], ji vis dar yra svarbu suprasti galimą ryšį tarp aktyvumo ir MYC raiškos skrandžio kancerogenezėje ir molekulinio mechanizmo dalyvauja jų reguliavimas.

LYN yra dar vienas SRC šeimos kinazės narys, o Lyn
genas yra įsikūręs chromosomos 8q13. Mūsų grupė anksčiau pranešė apie pelną chromosomos 8 (dėl kurių MYC
genas taip pat yra) GC atvejais buvimas iš Šiaurės Brazilijoje [16, 21-23] ir visose GC ląstelių linijas nustatoma pagal neoplasias į tai gyventojų [24, 25]. Todėl, tai chromosomos gali būti svarbius genus skrandžio kancerogenezės. Mūsų žiniomis, nė Ankstesnis tyrimas tyrė Lyn vaidmenį ir jos reguliavimą GC. Tačiau LYN raiška buvo pranešta keliose vėžio [26-32]. Be to, Lyn
reguliavimas DNR metilinimo parodė ir tiesiosios žarnos vėžiu ir Ewing sarkoma [33, 34] ir Lyn
metilinimas buvo pastebėta tam tikra kraujodaros ir ne kraujodaros Mobilaus ryšio linijos [35]. DNR metilinimas yra molekulinės modifikacija DNR, kuri yra glaudžiai susijusi su genų funkcijai ir ląstelių tipo konkrečių genų funkcijai [36]. Be to, DNR metilinimas gali būti tvirta biologinis, nes ji yra labai labiau stabili nei RNR arba baltymų, todėl yra perspektyvi taikiniu naujų metodų, skirtų diagnozės ir prognozės vėžio [36] plėtrai.

CKB yra viena iš dviejų citozolio izoformų kreatino kinazės ir gali dalyvauti apykaitos procesuose glikolizės ne raumenų ląstelėse [37]. Skirtingai normalios ląstelės, kurios visų pirma energijai per oksidacinio fosforilinimo, dauguma vėžinių ląstelių nori aerobikos glikolizės, kuri yra žinoma kaip Warburg poveikio [38]. Įdomu tai, Myc onkogeno atrodo aktyvuoti kelis gliukozės nešiklių ir glikolizinių fermentų, tokiu būdu prisidedant prie Warburg poveikio [39]. Mūsų Ankstesnis PROTEOMIKOS tyrimas atskleidė, kad kelios baltymų, dalyvaujančių energijos gamybos procesų buvo liberalizuotas GC mėginių ir sustiprino Warburg poveikį šiame neoplazija [40]. Iš CKB vaidmuo GC menkai suprantama: kai transcriptomic tyrimai pranešė apie ląstelę, CKB
GC pavyzdžių [41, 42], o kitas parodė, CKB
downregulation [43]. Be to, kaip ir Lyn
geno CKB
metilinimas buvo aprašyta anksčiau hematologinių ir kietųjų vėžio ląstelių linijų, įskaitant GC ląstelių linijų [44]. Iš metilinimas CKB
atrodo, susijęs su jo riboto lygio išraiška; Tačiau tolesnis tyrimas vis dar reikia suprasti reguliavimas CKB
pagal epigenetinių modifikacijų.

Todėl, pirmiausia buvo siekiama įvertinti iRNR ir baltymų ekspresiją SRC, Lyn CKB Dideliame rinkinys GC pavyzdžius. Tada, mes įvertinta, ar šie genai gali būti reguliuojami ir DNR metilinimo skrandžio kancerogenezės. Be to, mes ištirti galimą ryšį tarp kinazės išraiškos ar metilinimo ir klinikinių kintamųjų, taip pat MYC saviraiškos ir metilinimo.

Medžiaga ir metodai

Audinių mėginiai

kinazės išraiška ir metilinimo modeliai buvo įvertinti 138 porų GC mėginių ir juos atitinkančios ne navikinių skrandžio audinių mėginių, gautų iš pacientų, kuriems buvo atlikta pašalintas skrandis Šiaurės Brazilijoje. Visi pacientai turėjo neigiamų istorijų poveikio arba chemoterapija ar radioterapija prieš operaciją, ir nebuvo bendro įvykis kitų diagnozuojamų vėžio. Šis tyrimas buvo patvirtintas etikos komisijos João de Barros Barreto universitetinės ligoninės (protokolasļ.737). Parašė informuotas sutikimas su patvirtinimo etikos komisijos buvo gauta iš visų prieš MĖGINIŲ ĖMIMAS pacientams.

Dalis kiekvieno išpjaustytų auglio mėginį buvo formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų (FFPE). Skyriai FFPE audinio buvo tamsintas hematoksilinu-eozinu už histologinio vertinimo arba naudojami imunohistocheminis (IHC) analizė. Papildomos dalys kiekvieną naviko ir suporuoti ne navikiniai audinio mėginiai buvo Snap-šaldyta skystame azote ir saugomi -80 ° C iki baltymų ir nukleorūgščių gryninimo.

Visi mėginiai buvo klasifikuojami pagal Lauren [45 ], o augliai buvo pastatytas pagal TNM sustojimo kriterijus [46]. Iš Helicobacter pylori
buvimas A klasė I kancerogenas, skrandžio mėginius buvo aptikta greito ureazės testas, o jo virulentiškumo faktorius citotoksiškumo susijęs genas A (CagA genas) buvo aptikti PGR naudojant DNR išgryninta kartu su baltymais ir iRNR, kaip anksčiau vykdyta mūsų grupėje [47]. Epstein-Barr virusas (EBV) buvo aptikta RNR in situ hibridizacijos [47].

49 šių navikinių ir ne navikinių mėginių porų, mes įvertino Myc reaktyvumas, iRNR išraiška ir metilinimas būsena duomenys anksčiau paskelbti mūsų grupės [18].

baltymai, iRNR ir DNR gryninimas

viso baltymai, iRNR, o DNR buvo vienu metu izoliuotas nuo skrandžio audinių mėginių, naudojant AllPrep DNR /RNR /baltymų komplektas ( Qiagen, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Baltymų nuosėdos ištirpintos buferyje, kurio sudėtyje yra 7 m karbamido, 2 M tiokarbamido, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% proteazės inhibitorius kokteilis (Sigma-Aldrich, JAV), ir 0,5% kiekviena fosfatazės inhibitoriaus kokteilis 1 ir 2 (Sigma -Aldrich, JAV), kaip anksčiau mūsų grupės [48] atliktas. Sudėtyje esantis baltymų koncentracijos buvo nustatomas pagal Bradford (Sigma-Aldrich, JAV) metodu. RNR koncentracija ir kokybė buvo nustatoma naudojant NanoDrop spektrofotometru (Kisker, Vokietija) ir 1% agarozės geliai, atitinkamai. Mėginiai buvo laikomi -80 ° C iki naudojimo.

Baltymai reaktyvumas analizė

vėžinių audinių skyriai (3 ar 4 mm storio) buvo deparaffinized į ksileno ir rehidrataciją diferencijuotai serijos etanolio. Po šilumos sukelta epitopą paieška, audinių dalys buvo inkubuojami su pirminės pelės monokloniniai antikūnai prieš SRC (skiedimo 1: 400; klonas 28, Life Technologies, JAV), Lyn (skiedimo 1: 400; klonas C13F9; Gyvosios Technologies, JAV) arba CKB (skiedimo 1: 250; HPA001254, Santa Cruz biotechnologijos, JAV). Universalus peroksidazės konjuguoto vidurinė antikūnų rinkinys (LSAB sistema, DakoCytomation, JAV) buvo naudojamas aptikti. Mes naudojome 3,30-diamino-Benzidino /H _{2O 2 (DakoCytomation, Danija), kaip chromogeną ir hematoksilinu kaip kontrasto. Baltymas, reaktyvumas-teigiamas mėginys buvo apibrėžtas kaip iš kurių vienas turi 10% arba daugiau neoplastinių ląstelių, kurios buvo teigiamas dėl baltymų.}

baltymo ekspresiją analizė

Western blot analizė buvo atlikta kaip buvo aprašyta anksčiau mūsų grupės [49]. Sumažintas baltymų (25 mikrogramų) Iš kiekvieno mėginio buvo atskirtos 12,5% homogeninės SDS-PAGE ir elektro-Lik ant PVDF membranos (Hybond-p, "GE Healthcare", JAV). PVDF membrana buvo užblokuotas su fosfato-buferio druskų tirpalo, kuriame yra 0,1% Tween 20, ir 5% mažai riebalų pieno ir inkubuojami per naktį 4 ° C su atitinkamais pirminiais antikUnais: anti-SRC (praskiestas santykiu 1: 1000; klono 28, Life "technologijas, JAV), anti-LYN (skiedimo 1: 1000; klonas C13F9; Gyvosios technologijos, JAV), anti-CKB (atskiesti 1: 400; HPA001254, Santa Cruz biotechnologijos, JAV) ir anti-ACTB (skiedimo 1: 250; AC -15, gyvenimas technologijos, JAV). Po intensyvių plovimo, fosfatazės-konjuguoto antrinis antikūnas buvo įtraukta 1 valandą, o esant kambario temperatūrai. Imunoreaktyvių juostos buvo ryškinamos naudojant Imunoblotingo Luminol reagentą, ir vaizdai buvo įsigytos naudojantis ImageQuant 350 Skaitmeninis vaizdo sistemą ( "GE Healthcare", Švedija). ACTB buvo naudojamas kaip pakrovimo atskaitos kontrolę.

iRNR raiška analizė

Pirmiausia, RNR atvirkštinio transkripcija naudojant didelės talpos kDNR Archyvas Rinkinys pagal gamintojo protokolu (Life Technologies ", JAV) , tada Papildoma DNR sustiprino realaus laiko atvirkštinės transkripcijos kiekybine PGR (RT-qPCR), naudojant TaqMan zondai perkami kaip Bandymai-on-demand preparatų genų ekspresiją (Life technologies ", JAV) ir 7500 Fast Real-Time PCR priemonės (Life Technologies" , JAV). GAPDH
genas buvo pasirinktas kaip vidaus kontrolės RNR įvesties ir atvirkštinio transkripcijos efektyvumą. Visi RT-qPCRs buvo atliekami tris kartus, tiek tikslinių genų ( SRC
: Hs01082246_m1 LYN
: Hs00176719_m1 CKB
: Hs00176484_m1) ir vidaus kontrolė ( GAPDH
:. NM_002046.3)

santykinis kiekybinis genų ekspresijos buvo apskaičiuojamas pagal Livak ir Schmittgen [50]. Atitinkamas bandinys buvo paskirta kaip kalibratorių iš kiekvienos naviko.

DNR metilinimo analizė

metilinimas modelis ir dažnis kinazės genų vertino metilinimo konkrečių PGR (MSP) [51]. EZ DNR Metilinimas-Žaibas ™ komplektas (Zymo tyrimų, JAV) buvo naudojami pakeisti gDNA iki bisulfito gydymo, konvertuoti nedenatūruotą cytosines į uracilai ir paliekant denatūruoti cytosines nepakitusi. Konkretūs gruntai genų vykdytojų aprašyti 1 lentelėje

PGR reakcijos buvo atliekami naudojant 0,1 mkmol /l dNTP, 2 mikromoliai /l MgCl _{2, 0,5 mkmol pradmenis, 1.25 V Taq DNR polimerazės, ir 100 ng bisulfito modifikuotas DNR. Po pirminio denatūracija, 5 min, esant 94 ° C, 40 ciklų, esant 94 ° C temperatūroje 45 S, kur atkaitinimo temperatūros (1 lentelė) 45-S, ir 72 ° C temperatūroje 30 s buvo atlikti, o po to paskutinį kartą pratęsti už 5 min, esant 72 ° C temperatūroje. PGR produktai buvo tiesiogiai pakrauti 3% agarozės gelyje ir elektroforezė. Gelis tamsintas su SYBR ^{® Safe DNR Gel Stain (Life Technologies, JAV) ir tiesiogiai vizualizuojami UV apšvietimą. Kaip teigiamą kontrolę visų JEP reakcijų A gDNA pavyzdys buvo visiškai metilo naudojant CPG metilazę (SssI, Naujoji Anglija BioLabs, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Be to, pradmenys aptikimo laukinio tipo seka buvo naudojami stebėti visiškai pakeisti DNR, gautos bisulfito reakcijos}}

mėginiai buvo suskirstyti į grupes taip:. 1) bandinys, buvo apibrėžtas kaip hypomethylated, kai teigiamas amplifikacija produktas buvo aptiktas tik PGR su specialiais gruntais už nedenatūruotą sekomis; 2) mėginys buvo apibrėžiamas kaip hypermethylated kai teigiamas stiprinimas buvo aptiktas tik PGR su konkrečių gruntams už denatūruotu sekas; 3) mėginys buvo apibrėžiamas kaip iš dalies metilo, kai teigiamas stiprinimas buvo aptiktas PGR su dviem pradmenų rinkinius.

Gruntai "specifiškumą ir MSP rezultatai buvo patvirtinti naudojant bisulfito sekvenavimo PGR (BSP) metodą [52] , BSP taip pat buvo naudojama įvertinti metilinimo procentą. Pradmenys ir anneling temperatūra BSP aprašyti 1 lentelėje Po amplifikacijos, fragmentai buvo išgrynintas naudojant NucleoSpin gelio ir PGR valymo komplektas (Macherey-Nagel, Vokietija), susiūta į pGEM T-lengva Vektorius (Promega, Vokietija) ir klonuotas į kompetentingos E
. coli
JM109 ląstelės. Po inkubacijos metu, baltos kolonijos buvo atrinkti PGR su M13 į priekį (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') ir M13 antros (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ") pradmenų [53]. Po pirminio denatūracija, 3 min, esant 94 ° C, PGR amplifikacija sudarė 35 ciklų 94 ° C temperatūroje 30 S, 55 ° C temperatūroje 30 s, ir 72 ° C temperatūroje 90 s atliktų, o po to paskutinį kartą pratęsti dėl 5 min, esant 72 ° C temperatūroje. PGR produktai buvo vizualizuojami agarozės gelyje. Šeši klonai buvo pasirinktas skirtos gryninimui, ir sekos į ABI310 automatinio sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Visi sekos buvo suderinta su BioEdit v7.0.5 [54], ir metilinimo analizė buvo atlikta su BIQ Analyzer programinę įrangą [55]. Iš metilinimo procentinis kiekvieno mėginio buvo apskaičiuojamas dalijant denatūruotu CpGs skaičių iš viso CpGs eiliškumą (CpGs visose šešių klonai).

statistines analizes

duomenys parodė, kaip dažnio, medianos ir interkvartilinis plotis (IQR). Šapiro-Wilk testas buvo naudojamas įvertinti amžiaus, mRNR, baltymų ekspresijos ir procentais metilinimas duomenų pasiskirstymą ir nustatyti tinkamą tolesnį testą statistinių palyginimų. Mann-Whitney testas buvo naudojami tiriant galimus ryšius tarp kinazės iRNR ar baltymo raiškos ir kategorinių kintamųjų, tokių kaip reaktyvumas, metilinimo modelio ir klinikos funkcijų. Mann-Whitney testas buvo naudojamas tirti galimą asociacijas tarp metilinimo ir reaktyvumas ir klinikos funkcijų procentais. Wilcoxon testą buvo naudojamas palyginti metilinimo procentą tarp porų neoplastinių ir ne-neoplastinių mėginių. Asociaciją tarp kategorinių kintamųjų buvo analizuojami naudojant Chi-kvadrato (χ ^{2) testą. Ietininkas koreliacija bandymas buvo naudojamas įvertinti galimą koreliaciją tarp mRNR ir baltymų raiškos, taip pat promotoriaus metilinimas. P-reikšmė mažesnė nei 0,05 buvo laikomas reikšmingu. buvo taikomas Bonferroni reguliavimas p-reikšmė, kai buvo atlikti keli palyginimai su alfa lygio dalijama palyginimų numerį.}

Rezultatai

kinazės išraiška skrandžio navikų

ne netipiniai skrandžio ląstelės nepateikė SRC arba LYN reaktyvumas (pav 1A ir 1C). Tačiau, SRC reaktyvumas buvo pastebėtas displazija ląstelių. Ląstelių membranos ir citoplazmos reaktyvumas už SRC ir Lyn buvo aptiktas navikinių ląstelių (pav 1b ir 1d) ir LYN taip pat pristatė nukleino reaktyvumas. CKB reaktyvumas buvo aptikta citoplazmą arba ląstelių membranos ne neoplastinių skrandžio ląstelių (pav 1e). Priešingai, GC ląstelės nepateikė CKB reaktyvumas (pav 1F).

SRC, Lyn CKB reaktyvumas buvo aptikta 72 (52,2%), 66 (47,8%) ir 0 (0%) naviko pavyzdžiai. SKC ir LYN reaktyvumas buvo susijęs su didesniu mRNR ir baltymų kiekiai GC mėginių (p < 0,001, visų palyginimų; Mann-Whitney testas; pav 2A, 2C, 2E ir 2G). Baltymų ir iRNR lygiai SRC padidėjo bent 1,5 karto (bent 50% padidinti raiškos) 67 (48,6%) ir 80 (58%), atitinkamai, GC pavyzdžių, susijusių su atitinkama ne neoplastiniu skrandžio pavyzdžiai (pav 2B, 2D ir 2k). Be to, baltymų ir iRNR lygiai Lyn buvo padidinamas ne mažesniu negu 1,5 karto 36 (26,1%) ir 72 (52,2%) GC mėginių, atitinkamai (pav 2F, 2H ir 2k). Priešingai, downregulation iš CKB baltymų ir mRNR (ne mažiau kaip 50% sumažėjimas išraiškos) buvo aptikta 104 (75,4%) ir 49 (35,5%) GC mėginių, atitinkamai (pav 2i, 2j ir 2k). Stiprus ir tiesioginis ryšys buvo pastebėtas tarp iRNR ir baltymų saviraiškos SRC (p < 0,001, ρ = 0,856, Ietininkas koreliacijos testas), LYN (p < 0,001, ρ = 0,762) ir CKB (p < 0,001, ρ = . 0,819)

apie SRC reaktyvumas buvo susijęs su Lyn (p <reaktyvumas; 0,001, χ ^{2 testas), 52 (37,7%) GC pavyzdžių, keliančių reaktyvumas tiek baltymų. Be to, tiesioginė koreliacija tarp SRC ir Lyn baltymų (p < 0,001, ρ = 0,556) ir iRNR (p < 0,001, ρ = 0,779) išraiška. Į CKB baltymų ir iRNR išraiškos lygis buvo atvirkščiai koreliuoja su SRC (p < 0,001, ρ = -0,734; p < 0,001, ρ = -0,806, atitinkamai) ir Lyn (p < 0,001, ρ = -0,643; p . < 0,001, ρ = -0,703, atitinkamai)}

2 lentelėje parodytos SRC, Lyn CKB išraiškos ir klinikos ypatumus rezultatus. Ligonių navikai vėlai pasireiškimo GC pateikti žymiai didesnę SRC ir Lyn baltymų (IHC ir Imunoblotingo) ir mRNR (RT-qPCR) išraiška, taip pat sumažintas CKB baltymų ekspresijos iki Imunoblotingo, palyginti su anksčiau pasireiškusios CG mėginiai (p < 0,05, visais atžvilgiais lyginant; 2 lentelė). Didesnis baltymų ir iRNR raiška SRC ir Lyn ir sumažinta CKB išraiška buvo susiję su pažengęs, giliau naviko invazijos, ir limfmazgiuose buvimą ir tolimų metastazių (p < 0,05, visų palyginimų; 2 lentelę)
<. p> laipsniškas reikšmingas padidėjimas SRC baltymo (Imunoblotingo metodu) ir mRNR išraiška buvo pastebėta, atitinkantis naviko etape (p < 0,008, dauguma palyginimų; Mann-Whitney testas po Bonferroni korekcijos; Fig 3A ir 3B) , Priešingai, laipsniškas žymiai sumažėjo į CKB baltymų ir iRNR išraiškos buvo pastebėtas atitinkantis naviko etape (p < 0,008, dauguma palyginimų; pav 3G ir 3H). Kalbant apie Lyn išraiška, mes nesilaikė didelį skirtumą tarp etapų I ir II arba tarp etapai III ir IV. Tačiau etapai I ir II buvo gerokai skiriasi nuo etapai III ir IV (p < 0,008, šių palyginimų, pav 3D ir 3E).

kinazės geno metilinimo modeliai skrandžio mėginius

lentelės 3 rodo metilinimo modelio tirtų baltymų kinazės į navikinių ir ne navikinių skrandžio mėginius pagal JEP. Maždaug 60% ir 30% GC pavyzdžių pateikti teigiamą amplifikacija tik nedenatūruotu pradmenimis (hypomethylated mėginių) už SRC parsisiųsti ir Lyn
genai, atitinkamai (pav 4A ir 4B). Hipometilinimas šių genų nebuvo pastebėta bet kokiu kitu ne-neoplastinės mėginio. Todėl, SRC parsisiųsti ir Lyn
hipometilinimas buvo reikšmingai didesnis GC nei ne navikinių skrandžio mėginius (p <dažnis; 0,001, visų palyginimų; χ ^{2 testas po iki Bonferroni pataisymų).}

BSP analizė patvirtino MSP analizę. Iki BSP, 82 (59,4%) ir navikinių mėginių ir 0 (0%) ne navikinių mėginių pristatė klonuotą seka be CpG metilinimo į src
rengėjas. Be to, 4 (2,89%) ir 1 (0,72%) ir navikinių ir ne navikinių mėginių pristatė klonuotą seka be CpG metilinimo į Lyn
rengėjas, atitinkamai. Iki BSP, kad procentas SRC
[0,135 (0,31), , palyginti
0,563 (0,23); p < 0,001] ir LYN
[0,238 (0,40), , palyginti
0,7063 (0,26); p < 0,001] metilinimas buvo mažesnis navikinių mėginių nei ne navikinių mėginių (pav 5a ir 5b).

SRC parsisiųsti ir Lyn
metilinimo dėsningumai neoplastinė ir ne -neoplastic mėginiai tarpu nustatyta, kad susijęs (p < 0,001, tiek analizę; χ ^{2 testas). Mes pastebėjo, kad 70/81 (86,4%) navikai su hypomethylated SRC
pateiktų dalinį metilinimas šio geno suderintos ne neoplastiniu mėginyje. Be to, mes nustatėme, kad 37/41 (90,24%) navikai su hypomethylated Lyn
pateikti dalinį metilinimas šio geno suderintos ne neoplastiniu mėginyje. SRC parsisiųsti ir Lyn
dalinis metilinimas ne navikinių mėginių buvo dažniau pastebėti pateikiančių fizinių asmenų navikų mėginiuose su hipometilinimą šio geno, palyginti su auglių su daline metilinimo (p < 0,001, tiek analizuoja) arba hypermethylation (p < 0,001, tiek analizes). Be to, iš dalies metilo LYN
ne navikinių pavyzdžių taip pat buvo dažniau nustatytas asmenų, keliančių navikų mėginiuose su daline metilinimo šio geno, palyginti su navikais sergantiems hypermethylation (p = 0,004). Iki BSP, mes taip pat pažymėjo, kad SRC pervežimas (p < 0,001, p = 0.6902; pav 5D) procentas ir Lyn
(p < 0,001, ρ = 0,739; Fig 5E ) metilinimas navikinių ir ne navikinių pavyzdžių buvo susijęs.}

CKB
dalinis ir hipometilinimas buvo stebimas abiejose navikinių ir ne navikinių pavyzdžius. Tačiau 48 (39%) GC pavyzdžių pateikti, CKB
hypermethylation (pav 4C), kuris nebuvo aptikti per ne navikinių pavyzdžius. Be to, dažnis CKB
-hypermethylated mėginiai buvo reikšmingai didesnis neoplazminė palyginti su ne navikinių skrandžio mėginius (p < 0,001), ir CKB
dalinis metilinimas buvo reikšmingai dažnesnis GC nei ne-neoplastinių mėginių (p < 0,001). Iki BSP, kad procentas CKB
metilinimas buvo didesnis navikinių mėginių nei ne navikinių mėginių [0,511 (0,42) , palyginti
0,133 (0,12); p < 0,001; Pav 5C]. Klonuotų sekas be CpG metilinimo buvo aptiktas 4 (2.89%) ir 0 (0%) navikinių ir ne navikinių pavyzdžių, atitinkamai.

CKB
metilinimas modelis iš neoplazminė ir ne -neoplastic mėginiai buvo susijusi (p = 0,014, χ iki ^{2 bandymas). 2x2 analizė naudojant χ 2 testas parodė, kad poros, kuriose navikų mėginiuose pristatė hypermethylated CKB parsisiųsti ir suderintus ne navikiniai pavyzdžiai pateikti hipometilinimas šio geno buvo dažnesni nei porų auglių su hypermethylation ir atitiko ne neoplastiniq mėginius su daline metilinimo (p = 0,0381), tačiau ši išvada nebuvo statistiškai reikšmingas, jei buvo taikomas Bonferroni reguliavimas (pakoreguota α = 0,05 /3 = 0,0167). Tačiau, BSP, mes nustatėme, kad CKB
metilinimo navikinių ir ne navikinių mėginių buvo atvirkščiai koreliuoja procentais (p < 0,001, ρ = -0,375; pav 5F).}

tiesioginė koreliacija pastebėta tarp SRC parsisiųsti ir Lyn
metilinimo modeliai nesuteikiančių navikinių mėginių (p < 0,001, ρ = 0.627). Be to, atvirkštinis ryšys buvo aptiktas tarp SRC parsisiųsti ir CKB pervežimas (p < 0,001, p = -0.467) ir Lyn parsisiųsti ir CKB
(p < 0,001, ρ = -0,359) metilinimas. Tačiau GC mėginių, tiesioginis ryšys buvo pastebėtas tarp metilinimo procentais iš trijų tirtų kinazės: SRC parsisiųsti ir Lyn
(p < 0,001, ρ = 0,840); SRC parsisiųsti ir CKB
(p < 0,001, ρ = 0,684); LYN parsisiųsti ir CKB
(p < 0,001, ρ = 0,663).

Metilinimas reguliavimas kinazės

Jei išsiaiškinti epigenetinius reguliavimą tiriamųjų genai, mes įvertinti galimą asociaciją tarp promotoriaus metilinimo ir baltymų reaktyvumas ir mRNR ir baltymų raiškos (Imunoblotingo metodu)

mes pastebėjo, kad tiek mRNR ir baltymų išraiška SRC (p. < 0,001, ρ = -0,834; p < 0,001, ρ = -0,718; atitinkamai; pav 6A ir 6B) ir LYN (p < 0,001, ρ = -0,792; p < 0,001, ρ = -0,654; atitinkamai; pav 6D ir 6E) buvo atvirkščiai koreliuoja su promotoriaus metilinimo procentais. Be to, augliai su SRC [0,062 (0,08), , palyginti
0,375 (0,33); p < 0,001; Mann-Whitney testas; Pav 6C] ir LYN [0,127 (0,11), , palyginti
0,500 (0,39); p < 0,001; Pav 6F] reaktyvumas pristatė mažesnį procentą metilinimo nei naviko trūksta šio baltymo reaktyvumas

Dėl CKB reguliavimą, tiesioginis ryšys buvo pastebėtas tarp metilinimo procentais ir CKB mRNR ir baltymų raiškos (p. ≪ 0,001, ρ = 0,684; p < 0,001, ρ = 0,686; atitinkamai; pav 6G ir 6H). Įdomu tai, kad padidėjo CKB baltymų ir iRNR raiška buvo pastebėtas auglių su hypomethylated CKB
rengėjas palyginti su auglių su dalinai denatūruotą promotoriaus (p = 0,015, p = 0,008, atitinkamai; Mann-Whitney testas, po kurio Bonferroni korekcijų; S1 pav). Tačiau navikai, kurių hypermethylated CKB
rengėjas taip pat pristatė padidintą baltymų ir iRNR raiška lyginant su auglių su dalinai denatūruotą promotoriaus (p < 0,001, tiek palyginimų).

metilinimo kinazės rengėjams ir klinikos kintamieji

ne neoplastiniu skrandžio gleivinę, kad procentas SRC
(p = 0,010, ρ = -0,218) ir Lyn
(p = 0,003, ρ = -0,248) metilinimas buvo (silpnai) atvirkščiai koreliuoja su pacientų amžius operacijos, nors buvo pastebėta jokia kita asociacija tarp metilinimo ir lytį, H
procentais. pylori parsisiųsti ir EBV infekcija ne navikinių mėginių (p > 0,05; Mann-Whitney testas).

4 lentelėje parodytos tarp metilinimo procentais GC pavyzdžių ir klinikos ypatumus asociacijas , Be navikinių mėginių, iš SRC
(p = 0,002, ρ = -0.267) Lyn
(p = 0,014, ρ = -0.208) ir CKB
procentais (p = 0,024, ρ = -0,192) metilinimas buvo (silpnai) atvirkščiai koreliuoja su pacientų amžiaus operacijos metu. Be to, dalis procentais, SRC
(p = 0,002), Lyn
(p = 0,015) ir CKB
(p = 0,024) metilinimas buvo mažesnis pabaigoje prasidėjusią nei anksti atsiradusių GC pavyzdžius. Be to, mes nustatėme, kad SRC metilinimas buvo mažesnis ne CARDIA GC atsižvelgiant į CARDIA GC (p = 0,028).

Sumažintas procentas SRC
LYN parsisiųsti ir CKB
metilinimas buvo susiję su pažengęs, giliau naviko invazijos, ir limfmazgiuose buvimą ir tolimų metastazių (p < 0,05, visų palyginimų; 4 lentelę). Iš palyginimo SRC parsisiųsti ir Lyn
metilinimas tekstūros JEP ir klinikos ypatumus pateikti panašius rezultatus (S2 lentelė). Tačiau, dalinė metilinimo CKB
pagal JEP taip pat buvo dažniau nustatyta nei hypermethylation T3 /T4 navikai (p = 0,008; S2 lentelę). CKB
dalinis metilinimas buvo dažnesni nei hypermethylation (p < 0,001) ir hipometilinimas (p = 0,009; S2 lentelė). Navikuose iš asmenų, turinčių tolimoje metastazių, susijusių su navikais iš asmenų be tolimoje metastazių

laipsniškas sumažėjimas SRC parsisiųsti ir Lyn
metilinimas buvo pastebėtas atitinkantis naviko stadijos (p <procentais; 0,008 daugumai palyginimų; Mann-Whitney testas po Bonferroni korekcijos; pav 3C ir 3F). Kalbant apie CKB
metilinimas, 12 iš 14 (85,7%) iš GC mėginių scenoje aš pateikiau 73,3% iš metilinimo. Iš procentas CKB
metilinimas buvo didesnis I etape nei etapais, II, III ir IV (p < 0,008, dauguma šių palyginimų, pav 3I). Priešingai, procentas CKB
metilinimas buvo žymiai sumažintas IV stadijos, palyginti su kitų etapų (p < 0,008, šių palyginimų, pav 3I).

kinazės ir MYC santykiai

Mes išnagrinėjome Myc reaktyvumas, iRNR raiška ir metilinimas būsenos duomenis iš 49 tirtų porų navikinių ir ne navikinių pavyzdžių rinkinys. Yang ir kt.

• PLoS ONE: klinikinė reikšmė MIR-137 Expression pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu Po ​​Radical pašalintas skrandis
• PLoS ONE: Išskirtinis asociacija p53 mutacijos Super High metilinimas naviko slopintuvas genų p53 eigos unikalus skrandžio vėžys Fenotipas