PLoS ONE: Deregulacija Iskazivanje SRC Lyn i CKB kinaza metilacije DNA i njegove potencijalne uloge u rak želuca invazivnost i Metastasis

Sažetak pregled

kinaze nizvodno modulatori i efektora nekoliko staničnih signalnih kaskada i igraju ključne uloge u razvoju neoplastičnih bolesti. U ovom istraživanju, mi cilj procijeniti src, Lyn i CKB proteina i mRNA ekspresije, kao i njihov promotor metilacije, kod raka želuca. našli smo povišenu ekspresiju SRC i LYN kinaze mRNA i proteina, ali smanjene razine CKB kinaze, promjene koje mogu imati ulogu u invazivnost i metastaziranje želučanih tumora. Izražavanje tri proučavane kinaza je također bio povezan s myc onkogena izražavanja, mogući biomarker za rak želuca. Da bismo razumjeli mehanizme koji reguliraju ekspresiju tih gena, procijenili smo DNK promoter metilacije tri kinaze. Otkrili smo da je smanjena SRC pregled i Lyn pregled metilacije i povećana CKB pregled metilacije je povezana s rakom želuca. Smanjena SRC pregled i Lyn pregled metilacije je bio povezan s povećanim razinama mRNA i proteina, što ukazuje da je DNA metilacije sudjeluje u regulaciji ekspresije ovih kinaza. S druge strane, smanjiti CKB pregled metilacija opažena u uzorku sa smanjenom mRNA i proteina, što ukazuje CKB ekspresija je utvrđeno da je samo djelomično regulirana metilacije DNA. Osim toga, našli smo da se promjene u obrasca metilacije DNA od tri proučavane kinaza također povezana i s želučanom pojave raka uznapredovalog karcinoma želuca, dublji invazije tumora i prisustvo metastaza. Dakle, SRC, Lyn i CKB izraz ili DNA metilacije mogao biti koristan markera za predviđanje progresije tumora i ciljanje u strategijama protiv raka pregled

Izvor:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Crna Gora RC, i sur. (2015) Deregulacija Izražavanje SRC Lyn i CKB kinaza metilacije DNA i njegove potencijalne uloge u rak želuca invazivnosti i metastaziranje. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492 pregled

Urednik: Jose G. Trevino, University of Florida, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 27. svibanj 2015; Prihvaćeno: 25. rujna 2015; Objavljeno: 13. listopad 2015 pregled

Copyright: © 2015 Mello et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ova studija je podržan od strane Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; potporeǗ072 /2012-5 i 402.283 /2013-9, zajedništvo s MCS i RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa učiniti Pará (FAPESPA, dati #ICAAF 123/2014 za RRB) i Fundação de Amparo à Pesquisa učiniti Estado de Sao Paulo (FAPESP; grantÈ9 /07145-9; zajedništvo s MFL) kao donacije i stipendije nagrade. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je četvrti najčešći tip raka i drugi najviši uzrok smrtnosti od raka u svijetu [1]. Liječenje GC u uznapredovalom stadiju i dalje teško, a prognoza je i dalje loša, dijelom kao rezultat lokalnog recidiva, invazije tumora i /ili metastaza. Ukupna relativna stopa preživljavanja od 5 godina je trenutno manje od 20% [2]. Bolje razumijevanje biologije progresiji ove neoplazija je ključno za smanjenje stope smrtnosti s razvojem novih upravljanje pacijenta i terapijske strategije. Pregled

Phosphotransferases, također poznat kao kinaza su nizvodno modulatori i efektora o nekoliko staničnih signalnih kaskada i igraju ključnu ulogu u razvoju neoplastičnih bolesti [3]. Do danas, lijekovi nekoliko protein kinaza-u interakciji su registrirane za klinička ispitivanja [4]. Mi smo ranije provedena probira za identifikaciju proteina kinaze izražene u GC uz Capture spoj spektrometrija masa [5, 6] (S1 datoteka), a 22-kinaze proteina, uključujući i SRC Lyn i CKB, otkrivene su (S1 tablicu). Te tri kinaze odabrane su za daljnja ispitivanja (S1 sl). Pregled

SRC je prvi protoonkogen otkriven, i ima središnju ulogu u staničnih signalnih transdukcijskih ciklusa. Abnormalna aktivnost SRC zabilježen je u nekoliko oblika raka kod ljudi, uključujući i GC [7-9], a to može biti važno u razvoju tumora i napredovanje [10, 11]. Mitogenoj funkciji SRC, barem djelomično, posredovan indukcije myc, regulator staničnog ciklusa i faktora transkripcije [12, 13]. Naša grupa je ranije opisano myc doreguliranje u ljudskoj GC i N-metil-nitrosourea tretirane nehumanih primata [14-19]. Budući da je aktivacija SRC, kao i kod ostalih kinaza, ima plejotropskih efekte koje ovise o tipu stanica i kontekst [20], još uvijek je važno razumjeti moguću vezu između kinaze i myc izražavanja u želučanom karcinogeneze i molekularni mehanizam koji su uključeni u njihovu regulaciju. pregled

LYN je još jedan član obitelji SRC kinaza, a Lyn pregled, gen se nalazi na kromosomu 8q13. Naša grupa je ranije izvijestili prisutnost dobitke od kromosoma 8 (na kojoj myc pregled gena također je locirana) u GC slučajevima iz Sjeverne Brazilu [16, 21-23] i svim staničnim linijama GC utvrđenih neoplazija u ova populacija [24, 25]. Stoga, ovaj kromosom može sadržavati važne gene koji su uključeni u želučanom karcinogeneze. Prema našim saznanjima, nema ranija istraživanja koja istražuju ulogu Lyn i njegov propis u GC. Međutim Lyn prekomjerna ekspresija je prijavljen u nekoliko vrsta raka [26-32]. Osim toga, regulacija LYN Netlogu DNA metilacije je pokazao kako u rak debelog crijeva i Ewingovog sarkoma [33, 34], i Lyn pregled metilacije uočen u nekim krvotvornog i nehematopoetskih stanične linije [35]. DNA metilacije je molekularna modifikacija DNA koja je čvrsto povezana s gena funkcije i tip-specifičnih stanica gena funkcije [36]. Štoviše, DNA metilacije može biti robustan biomarkera, kao što je znatno stabilniji od RNA ili proteina i stoga je obećavajuća meta za razvoj novih postupaka za dijagnozu i prognozu raka [36]. Pregled

CKB je jedan od dva citosolu izoforme kreatin kinaze i mogu sudjelovati u metaboličkim procesima koji uključuju glukozu u ne-mišićnim stanicama [37]. Za razliku od normalnih stanica, što se prvenstveno proizvodnju energije putem oksidativne fosforilacije, većina stanica raka radije aerobnu glikolizu, koji je poznat kao Warburg efekt [38]. Zanimljivo je da myc onkogena čini se aktivirati nekoliko transportera glukoze i glikolitne enzime, čime se doprinosi Warburg efekt [39]. Naša prethodna proteomske studija otkrila je da je nekoliko proteina koji sudjeluju u proizvodnim procesima energije su deregulirano u uzorcima GC i armirano Warburg efekt u ovom neoplazije [40]. Uloga CKB u GC ostaje slabo razumljivo: neki transkriptomskih studije izvijestio je povećanje ekspresije CKB pregled u uzorcima GC [41, 42], dok je drugi pokazao CKB pregled regulacija [43]. Osim toga, kao i za Lyn pregled gena CKB pregled metiliranje je ranije opisano u hematološkim i krute staničnim linijama raka, uključujući GC stanicama [44]. Metilacija CKB pregled Čini se da je povezano s njegovom smanjenom razinom ekspresije; Međutim, daljnja istraga je i dalje potrebno razumjeti regulaciju CKB
prema epigenetičkim izmjenama. pregled

Dakle, prvo smo cilj procijeniti mRNA i proteina izraz SRC Lyn i CKB u velikom set uzoraka GC. Zatim, procijenili smo da li su ti geni mogu se urediti metilacije DNA u želučanom karcinogeneze. Osim toga, istražili smo moguću povezanost između ekspresije kinaze ili metilacije i kliničkim varijablama, kao i myc izražavanja i metilacije. Pregled

Materijal i metode

Uzorci tkiva

kinazu izraz i metilacije uzorci su ocijenjeni u 138 parova GC uzoraka i njihovih odgovarajućih ne-maligne uzoraka želučane tkiva dobivenih od pacijenata koji su se podvrgnuli gastrektomije u sjevernoj Brazilu. Svi pacijenti imali negativne povijesti izloženosti ili kemoterapijom ili radioterapijom prije operacije, a nije bilo ko-pojava drugih dijagnosticiranih karcinoma. Ova studija je odobrilo Etičko povjerenstvo João de Barros Barreto Sveučilišne bolnice (Protokolļ737). Pismeni informirani pristanak uz odobrenje povjerenstva za etiku koji je dobiven od svih bolesnika prije Prikupljanje uzoraka. Pregled

Jedan dio svakog izrezanim uzorku tumora je formalinom fiksiranih i parafin uklopljenih (FFPE). Dijelovi FFPE tkiva su obojeni hematoksilin-eozinom za histološki pregled ili koristiti za imunohistokemijske (IHH) analize. Dodatni obroci svakog tumora i upareni uzorci nisu neoplastična tkiva su smrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do proteina i pročišćavanje nukleinskih kiselina. Pregled

Svi uzorci su klasificirani u skladu s Laurenov [45 ], a tumori su postavljena u skladu s kriterijima TNM [46]. Prisutnost Helicobacter pylori pregled, klasa I karcinogen u uzoraka želuca detektirana je brzom testu ureaze, a virulentnost faktor citotoksičnost povezana gena A (CagA gen) je bio otkriti pomoću PCR korištenjem DNA pročišćeni istovremeno s proteinima i mRNA, kao što je već provedena od strane naše grupe [47]. Epstein-Barrov virus (EBV) je otkriven RNA in situ hibridizacije [47]. Pregled

Za 49 tih para maligne i ne-maligne uzoraka, procjenjuje myc imunoreaktivnost, mRNA i status metilacije podataka prije objavljeno od strane naše grupe [18]. pregled

proteini, mRNA i DNA pročišćavanje pregled

Ukupno proteina, mRNA, te DNA su istovremeno izolirana iz uzoraka želučane tkiva koriste AllPrep DNK /RNK /protein Kit ( Qiagen, Njemačka), prema uputama proizvođača. Protein pelet je otopljen u puferu koji sadrži 7 M urea, 2 M tiurea, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA) i 0,5% svake fosfataza inhibitor cocktail 1 i 2 (Sigma -Aldrich, USA), kao što je prethodno izvedbi našoj skupini [48]. Koncentracija proteina je određena prema metodi Braford (Sigma-Aldrich, USA). Koncentracija i kvaliteta RNA određene su pomoću spektrofotometra (NanoDrop Kisker, Njemačka) i 1% agaroznim gelovima, respektivno. Uzorci su pohranjeni na -80 ° C do upotrebe. Pregled

Protein imunoreaktivnost analiza pregled

sekcije tkiva tumora (3 ili 4 mm debljine) se deparafmizirani u ksilenu i rehidriraju u gradiranog nizu etanola. Nakon izazvanog toplinom epitop dohvat, sekcije tkiva su inkubirani sa primarnim mišjim monoklonskim protutijelima SRC (razrjeđenje 1: 400, klon 28, Life Technologies, USA), LYN (razrjeđenje 1: 400, klon C13F9, Life Technologies, USA) ili CKB (razrjeđenje 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). Univerzalni Komplet sekundarnog protutijela konjugiranog s peroksidazom (LSAB sustav, DakoCytomation, USA) je korišten za detekciju. Koristili smo 3,30-diamino-benzidina /H _{2O 2 (DakoCytomation, Danska) kao kromogena i hematoksilinom kao counterstain. Protein imunoreaktivnost pozitivne uzorak je definiran kao onaj koji ima 10% ili više neoplastičnih stanica koje su bile pozitivne za protein. Pregled}

Ekspresija proteina analiza pregled

Western blot analiza je provedena kao što je prethodno opisano u našoj skupini [49]. Smanjena proteina (25 mg), iz svakog uzorka je odvojen 12,5% homogenim SDS-PAGE i elektro-upijen na PVDF membranu (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF membrana je bila blokirana s fosfat-puferiranom fiziološkom otopinom koja sadrži 0,1% Tween 20 i 5% nemasnog mlijeka i inkubiraju preko noći na 4 ° C s odgovarajućim primarnim antitijelima: anti-src (razrjeđenje 1: 1000, klon 28, Life Technologies, SAD), anti-LYN (razrjeđenje 1: 1000; klon C13F9, Life Technologies, USA), anti-CKB (razrjeđivanja 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, SAD), a anti-ACTB (razrjeđenje 1: 250 Ac -15, Life Technologies, USA). Nakon opsežnog ispiranja, peroksidazom-konjugirani sekundarno antitijelo se dodaje tijekom 1 h na sobnoj temperaturi. Imunološki reaktivne bendovi su vizualizirani pomoću Western blot luminol reagensa, a slike su stečene pomoću ImageQuant 350 digitalni sustav slike (GE Healthcare, Švedska). ACTB je korišten kao opterećenje referentnog kontrolom. Pregled

mRNA analiza pregled

Prvo, RNA je reverzibilno-prepisana pomoću velikog kapaciteta cDNA Arhiva kompleta prema uputama proizvođača (Life Technologies, SAD) , Komplementarna DNA je pojačan u realnom vremenu reverzne transkripcije kvantitativnog PCR (RT-qPCR) korištenjem TaqMan proba kupljene kao Testovi na zahtjev Proizvodi za Gene Expression (Life Technologies, USA) i 7500 Fast real-time PCR instrumenta (Life Technologies , USA). GAPDH pregled, gen koji je izabran kao interna kontrola za unos RNA i natrag-transkripcije učinkovitost. Sve RT-qPCRs su izvedeni u tri primjerka i za ciljnih gena ( SRC pregled: Hs01082246_m1; LYN pregled: Hs00176719_m1; CKB pregled: Hs00176484_m1) i unutarnje kontrole ( GAPDH pregled. NM_002046.3) pregled

Relativno kvantificiranje ekspresije gena je izračunata prema Livak i Schmittgen [50]. Odgovarajući kontrolni uzorak je označen kao kalibrator iz svakog tumora. Pregled

metilacije DNA analiza pregled

obrasca metilacije i učestalost gena kinaze su ocijenjeni od strane metilacije specifičan PCR (MSP) [51]. EZ metilacije DNA-Lightning ™ Kit (Zymo Research, USA) je korišten za izmjenu gDNA po bisulfita liječenja, pretvaranje nemetilirane citozini u uracile i ostavljajući metilirani citozini nepromijenjen. Specifični početnici za promotora gena opisani su u tablici 1.

PCR reakcije su izvedene uz upotrebu 0,1 umol /L dNTPs, 2 umol /L MgCl _{2, 0,5 umol primera, 1.25 U Taq DNA polimeraze, i 100 ng bisulfit modificirani DNA. Nakon početne denaturacije za 5 minuta na 94 ° C, 40 ciklusa na 94 ° C za 45 s, je temperatura (Tablica 1) za 45 s, a na 72 ° C u trajanju od 30 sekundi su provedena, a nakon čega slijedi konačno proširenje za 5 min na 72 ° C. PCR produkti su direktno stavi na 3% agaroznom gelu i elektroforetski. Gel je zamrljan SYBR ^{® sigurnom DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) i direktno vizualizirati pod UV osvjetljenje. Kao pozitivna kontrola za sve MSP reakcije, uzorak gDNA bio potpuno metiliran pomoću CpG metilazom (SssI, New England Biolabs, USA) u skladu s uputama proizvođača. Nadalje, primjeri za detekciju odsječak divljeg tipa se koristiti za praćenje potpunu pretvorbu DNA dobivene u reakciji bisulfitnog pregled}}

Uzorci su poredani kako slijedi: a. 1) je uzorak definiran kao hypomethylated kada pozitivan pojačanje produkt je otkriven samo u PCR sa specifičnim primerima za nemetiliranih sekvencama; 2) uzorak je definiran kao hypermethylated kada pozitivno pojačanje je otkriven samo u PCR uz specifične klice za metilirani sekvencama; 3) uzorak je definiran kao djelomično metilirani kada pozitivna pojačanje nije uočeno u PCR sa dva primera skupine. Pregled

specifičnost prajmera "i rezultati su potvrđeni MSP upotrebom bisulfita sekvenciranje PCR (BSP) pristup [52] , BSP također koristi da se procijeni postotak metilacije. Prajmeri i anneling temperature BSS su opisani u Tabeli 1. Nakon pojačanja, a fragmenti su pročišćeni pomoću NucleoSpin gel i PCR čišćenje Kit (Macherey-Nagel, Njemačka), ligiran u pGEM-T lako Vector (Promega, Njemačka) i klonira u nadležnom E Netlogu. coli
JM109 stanica. Nakon vremena inkubacije, bijele kolonije su odabrani za PCR s M13 naprijed (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') i M13 obrnuto (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') početnica [53]. Nakon početne denaturacije od 3 minute na 94 ° C, PCR amplifikacija koja se sastoji od 35 ciklusa na 94 ° C tijekom 30 s, 55 ° C 30 s, i 72 ° C u trajanju od 90 sekundi su se provesti, nakon čega slijedi konačno proširenje za 5 min pri 72 ° C. PCR produkti su vizualizirani u agaroznom gelu. Šest klonovi su odabrani za čišćenje i sekvencionirao u ABI310 automatski sekvencer (tnom City, CA, USA). Sve sekvence su usklađeni s BioEdit v7.0.5 [54], a metilacije Analize su provedene uz BiQ Analyzer softvera [55]. Postotak metilacije za svaki uzorak je izračunata dijeljenjem broja metilnim CpGs od ukupnog broja CpGs nanizani (CpGs u svih šest klonova). Pregled

Statistički analizira

Podaci su prikazani kao frekvencija, medijana i interquartile raspona (IQR). Shapiro-Wilk testom za procjenu distribucije dobi, mRNA, ekspresija proteina i postotak metilacije podataka i odrediti odgovarajući naknadni test za statističke usporedbe. Mann-Whitney test korišten je za istražiti moguće povezanost između kinaze mRNA ili ekspresiju proteina i kategoričke varijable, kao što je imunoreaktivnost, obrasca metilacije i kliničkopatološkim značajke. Mann-Whitney test je korišten za istraživanje moguće povezanost između postotka metiliranje i imunoreaktivnosti i klinikopatološkim značajke. Wilcoxon test je korišten za usporedbu postotak metilacije između parova neoplastičnih i ne-maligne uzoraka. Povezanost između kategoričke varijable su analizirani korištenjem hi-kvadrat (χ ^{2) test. Spearman korelacija test korišten je za procjenu povezanost između mRNA i proteina, kao i promotor metilacije. P-vrijednost manja od 0,05 smatra se značajnom. Bonferronijev prilagodba p-vrijednost je primijenjena kada su provedene višestruke usporedbe, s razina alfa podijeljen od broja usporedbe. Pregled}

Rezultati

kinazu izraz u želučanim tumora pregled

Non-atipičnih stanica želuca nije prikazala SRC ili LYN imunoreaktivnost (Slika 1A i 1C). Međutim, SRC imunoreaktivnost uočena je u displazije stanicama. Stanične membrane i citoplazmatski imunoreaktivnost za SRC i Lyn je otkriven u neoplastičnim stanicama (slika 1B i 1D) i LYN predstavili nukleinske imunoreaktivnost. CKB imunoreaktivnost je pronađena u citoplazmi, ili u staničnoj membrani u ne-neoplastičnih stanica želuca (Slika 1E). Nasuprot tome, GC stanice se nije prisutan CKB imunoreaktivnost (Slika 1F). Pregled

SRC, LYN i CKB imunoreaktivnost je otkriven u 72 (52,2%), 66 (47,8%) i 0 (0%) tumora uzorci. SRC i LYN imunoreaktivnost su povezani s višim razinama mRNA i proteina u uzorcima GC (p 0,001 za sve usporedbe; Mann-Whitney Test, Slika 2A, 2C, 2E i 2G). Proteina i mRNA razine SRC povećani su barem 1,5 puta (barem 50% povećanje u izrazu) u 67 (48,6%) i 80 (58%), odnosno, uzorke GC u odnosu na njihovu podudarnog ne-neoplastičnim želuca uzorci (Slika 2B, 2D i 2K). Osim toga, protein i razine mRNA Lyn povećani najmanje 1,5 puta u 36 (26,1%) i 72 (52,2%) uzoraka GC, odnosno (Slika 2F, 2H i 2K). Obratno, podreguliranje CKB proteina i mRNA (najmanje 50% smanjenje ekspresije) otkrivena je u 104 (75,4%) i 49 (35,5%) uzoraka GC, odnosno (sl 2i, 2j i 2K). Snažna i izravna korelacija između mRNA i proteina za SRC (p < 0,001, ρ = 0,856, Spearman korelacija test) Lyn (p < 0,001, ρ = 0,762) i CKB (p < 0,001, ρ = . 0.819) pregled

imunoreaktivnost SRC bio povezan s imunoreaktivnosti od LYN (p < 0.001, χ ^{2 test), 52 (37,7%) uzoraka GC prezentiraju imunoreaktivnost za oba proteina. Osim toga, izravna korelacija između SRC i LYN proteina (p < 0.001, ρ = 0,556) i mRNA (p < 0.001, ρ = 0,779) ekspresije. Razine CKB proteina i mRNA ekspresije obrnutoj su korelaciji s SRC (p < 0.001, ρ = -0,734, p < 0.001, ρ = -0,806, redom) i LYN (p < 0.001, ρ = -0,643 p . < 0,001, ρ = -0,703, respektivno) pregled}

Tablica 2 prikazuje rezultate SRC Lyn i CKB izražavanja i kliničkopatološkim karakteristikama. Tumori bolesnika s kasnim naletom GC predstavio znatno veći SRC i Lyn proteina (IHC i zapadnoj upijajući) i mRNA (RT-qPCR) izražavanja, kao i smanjenom CKB ekspresija proteina pomoću Western blot, u usporedbi s početkom nastupa CG uzorci (p < 0.05 za sve usporedbe, tablica 2). Povećana proteina i mRNA od SRC-a i Lyn i smanjene ekspresije CKB bili su povezani s uznapredovalom stadiju, dubljim invazije tumora, te prisutnost limfnog čvora i udaljenih metastaza (p < 0,05, za sve usporedbe; tablica 2) pregled <. p> postupno značajan porast SRC proteina (s western blot analizom), a mRNA je uočena odgovara stupnju tumora (p < 0.008 za većinu usporedbe, Mann-Whitneyev test slijedi Bonferroni korekcijom, slici 3A i 3B) , Nasuprot tome, postupno značajno smanjenje u CKB proteina i mRNA ekspresije je opaženo odgovara stupnju tumora (p < 0.008 za većinu usporedbe, Slika 3G i 3H). S obzirom na LYN izražavanja, nismo promatrati značajnu razliku između faze I i II ili između stadija III i IV. Međutim, faze I i II se bitno razlikuju od fazama III i IV (p < 0.008 za ove usporedbe, Slika 3D i 3E), pregled

kinaze genskih metilacije uzoraka u Primjerci želučanog

tablici Slika 3 prikazuje obrasca metilacije proučavanih proteinskih kinaza u maligne i ne-maligne uzoraka želuca od strane MSP. Oko 60% i 30% uzoraka GC predstavio pozitivno pojačanje sa samo unmethylated vodeći skup (hypomethylated uzoraka) za SRC pregled i Lyn pregled, geni, odnosno (Slika 4A i 4B). Hypomethylation ovih gena nije opažena u bilo kojem ne-neoplastičnog uzorku. Dakle, učestalost SRC pregled i Lyn pregled hypomethylation bila je značajno viša u GC nego u ne-maligne želučanih uzoraka (p < 0,001, za sve usporedbe; χ ^{2 test slijedi by Bonferronijev ispravke). pregled}

BSP analiza potvrdila MSP analizu. Do BSP, 82 (59,4%) od maligne uzoraka i 0 (0%) ne-maligne uzorcima predstavila klonirani slijed bez CpG metilacije u src pregled promotora. Osim toga, 4 (2,89%) i 1 (0,72%), neoplastičnih i ne-maligne uzorka prikazani klonirani slijed bez CpG metilacije na Lyn pregled promotora, respektivno. Do BSP, postotak SRC pregled [0,135 (0.31) u odnosu na pregled, 0.563 (0,23); p < 0.001] i LYN pregled [0,238 (0.40) u odnosu na pregled 0,7063 (0,26); p < 0.001] metilacije bila je niža u maligne uzoraka u odnosu na ne-maligne uzoraka (slika 5A i 5B). Pregled

SRC pregled i Lyn pregled metilacije obrasci neoplastična i ne -neoplastic uzorci BUDUĆI utvrđeno da je povezan (p < 0.001, i za analize; χ ^{2 test). Uočili smo da je 70/81 (86,4%) tumora s hypomethylated SRC pregled prikazanih djelomično metilacije ovog gena u odgovarao non-neoplastičnim uzorku. Osim toga, otkrili smo da 37/41 (90,24%) tumora s hypomethylated Lyn
predstavljeni djelomični metilacije ovog gena u odgovarao non-neoplastičnim uzorku. SRC pregled i Lyn pregled djelomična metilacije u ne-maligne uzoraka je češća kod osoba koje predstavljaju uzorke tumora s hypomethylation tog gena u usporedbi s tumorima s djelomičnim metilacije (p < 0,001, i za analiza) ili Hipermetilacija (p 0,001, i za analize). Nadalje, djelomično metilirani LYN pregled u ne-maligne uzorka također češće detektirana kod pojedinaca koji pokazuju uzorke tumora s djelomičnim metiliranjem tog gena u usporedbi s tumora Hipermetilacija (p = 0,004). Do BSS-a, također je primijetio da je postotak SRC
(p < 0,001, r = 0.6902; Slika 5D) i Lyn pregled (p < 0,001, ρ = 0,739 Sl 5E ) metilacija maligne i ne-maligne uzoraka korelaciji. pregled}

CKB pregled, djelomična i hypomethylation zabilježen je u oba maligne i ne-maligne uzoraka. Međutim, 48 (39%) uzoraka GC prikazana CKB pregled Hipermetilacija (slika 4C) koja nije detektirati u ne-maligne uzoraka. Štoviše, učestalost CKB pregled -hypermethylated uzoraka bila je značajno viša u neoplastičnim u odnosu na ne-maligne uzoraka želuca (p < 0,001), i CKB pregled djelomična metilacije je također značajno češći u GC nego u ne-maligne uzoraka (p < 0.001). Do BSP, postotak CKB pregled metilacije bila je veća u maligne uzoraka u odnosu na ne-maligne uzoraka [0.511 (0,42) u odnosu na pregled, 0.133 (0,12); p < 0.001; Slika 5C]. Klonirani sekvence bez CpG metilacije otkrivena je u 4 (2,89%) i 0 (0%) od maligne i ne-maligne uzoraka, respektivno. Pregled

CKB pregled metilacije obrazac neoplastična i ne -neoplastic uzorci su se da je povezan (p = 0,014, tako χ ^{2 test). Analiza 2x2 pomoću χ 2 testa pokazala je da parovi u kojima su uzorci tumora predstavila hypermethylated CKB pregled i podudarni ne-maligne uzorci predstavljeni hypomethylation ovog gena su češća od parova tumora Hipermetilacija i uskladiti non-neoplastične uzorke s djelomičnim metilacije (p = 0,0381), ali ovaj nalaz nije dosegla statističku značajnost, ako je primijenjena prilagodba Bonferronijev (prilagođena α = 0,05 /3 = 0,0167). Međutim, BSP, primijetili smo da je postotak CKB pregled metiliranje maligne i ne-maligne uzoraka obrnuto su korelaciji (p < 0,001, ρ = -0,375; Slika 5F). Pregled}

izravan korelacija između SRC pregled i Lyn pregled metilacije obrasce u ne-maligne uzoraka (p < 0,001, ρ = 0,627). Osim toga, inverzna korelacija je otkrivena između SRC
i CKB
(p < 0,001, r = -0.467) i LYN
i CKB Netlogu (p < 0.001, ρ = -0,359) metilacije. Međutim, u uzorcima GC, izravna korelacija između postotka metiliranjem tri proučavane kinaza: SRC pregled i Lyn pregled (p < 0.001, ρ = 0.840); SRC pregled i CKB pregled (p < 0,001, ρ = 0,684); LYN pregled i CKB pregled (p < 0,001, ρ = 0,663). Pregled

Metilacija regulacija kinaze pregled

Kako bi se razjasnila epigenetičku regulaciju istraživanog geni, istražili smo moguću povezanost između promotora metilacije i proteina imunoreaktivnost i mRNA i proteina (pomoću Western blot) pregled

Uočili smo da su i mRNA i proteina izraz za SRC (p. < 0,001, ρ = -0,834 p < 0.001, ρ = -0,718, istim redom; Slika 6A i 6B) i LYN (p < 0.001, ρ = -0,792, p < 0.001, ρ = -0,654, istim redom; Slika 6D i 6E) je obrnuto koreliraju s postotkom promotora metilacije. Štoviše, tumori s SRC [0.062 (0,08) u odnosu na pregled, 0.375 (0,33); p < 0.001; Mann-Whitney testa; Slika 6C] i LYN [0.127 (0,11) u odnosu na pregled, 0.500 (0,39); p < 0.001; Slika 6F] imunoreaktivnost prikazana niži postotak metilacije od tumora nedostaje ovaj protein imunoreaktivnost pregled

pri regulaciji CKB, izravna korelacija između postotka metilacije i CKB mRNA i proteina (p <, 0,001, ρ = 0,684; p < 0.001, ρ = 0,686, istim redom, Sl 6G i 6H). Zanimljivo je da je povećana CKB proteina i mRNA je uočena u tumorima s hypomethylated CKB pregled promotor u usporedbi s tumorima s djelomično metiliranog promotor (p = 0,015, p = 0,008, odnosno; Mann-Whitney test, a zatim Bonferronijev korekcije; S1 sl). Međutim, tumori s hypermethylated CKB pregled promotor također predstavila povećanu proteina i mRNA ekspresije u odnosu na tumore s djelomično metiliranog promotora (p < 0,001, za oba usporedbe). Pregled

Metilacija kinaze promotora i kliničkopatološkim varijable

U ne-neoplastičnim želučane sluznice, postotak SRC pregled (p = 0,010, ρ = -0,218) i Lyn pregled (p = 0,003, ρ = -0,248) metilacije je (slabo) obrnutoj su korelaciji s dobi bolesnika kod operacije, iako je uočen niti jedan drugi povezanost između postotka metilacije i spolu, H Netlogu. pylori pregled i EBV infekcije u ne-maligne uzoraka (p > 0,05; Mann-Whitney test). Pregled

Tablica 4 pokazuje povezanost između postotka metilacije u GC uzoraka i kliničkopatološkim karakteristikama , U maligne uzoraka, postotak SRC pregled (p = 0,002, ρ = -0.267), Lyn pregled (p = 0,014, ρ = -0.208) i CKB Netlogu (p = 0.024, ρ = -0,192) metilacije je (slabo) obrnutoj su korelaciji s dobi bolesnika kod operacije. Osim toga, postotak SRC pregled (p = 0,002), Lyn pregled (p = 0,015) i CKB pregled (p = 0,024) metilacije bila je niža u kasnim početkom nego u ranu pojavu uzoraka GC. Osim toga, mi smo opazili da SRC metilacija bila je manja u ne-cardia GC u odnosu kardija GC (p = 0,028). Pregled

Smanjena postotak SRC pregled, LYN pregled i CKB pregled metilacije bili povezani s uznapredovalom stadiju, dubljim invazije tumora, te prisutnost limfnog čvora i udaljenih metastaza (p 0.05, za sve usporedbe; tablicu 4). Usporedba SRC pregled i Lyn pregled obrasca metilacije strane MSP i kliničkopatološkim karakteristike predstavljeni su slične rezultate (S2 tablicu). Međutim, djelomična metiliranje CKB pregled od strane MSP je također češće nego Hipermetilacija u T3 /T4 tumora (p = 0,008; S2 tablicu). CKB pregled djelomična metilacije također je češći nego Hipermetilacija (p < 0,001) i hypomethylation (p = 0,009; S2 Tablica). Kod tumora od pojedinaca s udaljenim metastazama u odnosu na tumore od pojedinaca bez udaljenih metastaza

a postupno smanjenje u postotku SRC
i Lyn pregled metilacije se uočava odgovara stadiju tumora (p < 0,008, za većinu usporedbe; Mann-Whitney test nakon čega slijedi Bonferroni korekcije; Sl 3C i 3F). S obzirom na CKB pregled metilacije, 12 14 (85,7%) uzoraka iz GC u fazi sam predstavio 73,3% metilacije. Postotak CKB pregled metilacije bila je veća u fazi I. nego u fazi II, III i IV (p < 0,008, za većinu od tih usporedbi, Sl 3I). S druge strane, postotak CKB pregled metilacije je znatno smanjena u stadiju IV u odnosu na ostale faze (p < 0,008, za ove usporedbe; Sl 3I). Pregled

kinaze i myc odnosa pregled

ispitali smo myc imunoreaktivnost, ekspresiju mRNA i podatke o statusu metilacije za skup od 49 istraživanih parova maligne i ne-maligne uzoraka. Li et al.