PLoS ONE: дерегулируемых Выражение SRC, Lyn и ЦКБ киназ с помощью метилирования ДНК и его потенциальную роль в рак желудка инвазии и метастазированию

Абстрактные
<р> киназ вниз по течению модуляторы и эффекторами нескольких сигнальных каскадов сотовой связи и играют ключевую роль в развитии опухолевого заболевания. В данном исследовании мы стремились оценить SRC, Lyn и CKB белка и экспрессии мРНК, а также их метилирования промотора, при раке желудка. Мы обнаружили повышенную экспрессию SRC и LYN мРНК киназы и белка, но снижение уровня CKB-киназы, изменения, которые могут иметь определенную роль в инвазии и метастазирования опухолей желудка. Выражение из трех исследованных киназ был также связан с экспрессии онкогенов MYC, возможного биомаркера для рака желудка. Для того, чтобы понять механизмы, которые регулируют экспрессию этих генов, мы оценивали промотор метилирование ДНК трех киназ. Мы обнаружили, что сокращение SRC
и Lyn
метилирования и увеличение CKB
метилирование было связано с раком желудка. Уменьшенная SRC
и Lyn
метилирование было связано с повышением уровня мРНК и экспрессии белка, предполагая, что метилирование ДНК участвует в регуляции экспрессии этих киназ. И наоборот, уменьшение <ЕМ> CKB
метилирование наблюдалась в образцах с пониженной мРНК и экспрессии белка, что свидетельствует выражение CKB было установлено, что частично регулируется только метилирование ДНК. Кроме того, мы обнаружили, что изменения в структуре ДНК метилирования трех исследованных киназ также были связаны с желудочным началом рака, раком желудка, более глубокой инвазии опухоли и наличием метастазов. Таким образом, SRC, экспрессия LYN и ЦКБ или метилирование ДНК может быть полезными маркерами для прогнозирования прогрессирования опухоли и ориентации в стратегии противораковых
<р> Цитирование:. Mello А.А., Лил М.Ф., Рей JA, Пинто GR, Ламаран Л.М., Черногория RC, и др. (2015) дерегулируемых Выражение SRC, Lyn и ЦКБ киназ с помощью метилирования ДНК и его потенциальную роль в рак желудка инвазии и метастазированию. PLoS ONE 10 (10): e0140492. DOI: 10.1371 /journal.pone.0140492
<р> Редактор: Хосе Г. Тревино, Университет штата Флорида, США
<р> Поступило: 27 мая 2015; Принято: 25 сентября 2015 года; Опубликовано: 13 октября 2015
<р> Copyright: © 2015 Мелло и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано Conselho Насиональ де Desenvolvimento Científico е Tecnológico (CNPq; грантыǗ072 /2012-5 и 402283 /2013-9; общение с MCS и РРК), Fundação де Ампаро à Pesquisa делают Pará (FAPESPA; грант #ICAAF 123/2014 РРК) и Fundação де Ампаро à Pesquisa сделать Estado-де-Сан-Паулу (FAPESP; грант № 2009 /07145-9; общение с MFL), как грантов и предоставления стипендий. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй по значимости причиной смертности от рака во всем мире [1]. Лечение GC на поздних стадиях остается сложной, а прогноз по-прежнему бедны, отчасти в результате местного рецидива, инвазии опухоли и /или метастазов. Общий относительный показатель 5-летней выживаемости в настоящее время не менее 20% [2]. Лучшее понимание биологии прогрессирования этого неоплазии имеет решающее значение для снижения смертности с развитием нового пациента управления и терапевтических стратегий.
<Р> Phosphotransferases, также известный как киназ, являются нижестоящими модуляторы и эффекторами нескольких сотовые сигнальные каскады и играют ключевую роль в развитии опухолевого заболевания [3]. На сегодняшний день, несколько протеинкиназы взаимодействующих препаратов было зарегистрировано для клинических испытаний [4]. Ранее мы проводили скрининг для выявления киназы белков, выраженных в GC с помощью захвата соединения масс-спектрометрия [5, 6] (S1 файла) и 22 киназ белки, в том числе SRC, Lyn и ЦКБ, были обнаружены (S1 таблицу). Эти три киназ были выбраны для дальнейших исследований (S1 рис).
<Р> SRC был первым прото-онкогенов обнаружил, и он играет центральную роль в трансдукции путей клеточного сигнала. Ненормальная активность SRC наблюдается в ряде злокачественных опухолей человека, в том числе GC [7-9], и это может иметь важное значение в процессе развития и прогрессии опухоли [10, 11]. Митогенная функция SRC является, по крайней мере частично, опосредовано индукции MYC, регулятора клеточного цикла и фактора транскрипции [12, 13]. Наша группа ранее описанных Мус повышающую регуляцию в человеческом GC и в N-метил-нитрозомочевины обработанных нечеловеческих приматов [14-19]. Так как активация SRC, а также у других киназ, имеет плейотропных эффектов, которые зависят от типа клеток и контекста [20], он по-прежнему важно понимать возможную взаимосвязь между киназ и экспрессии MYC в желудочном канцерогенезе и молекулярного механизма участвующих в их регуляции.
<р> LYN является еще одним членом семейства SRC киназ, и Lyn
ген локализован на хромосоме 8q13. Наша группа ранее сообщалось о наличии прибыли хромосомы 8 (на котором ген MYC
также находится) в случаях GC из Северной Бразилии [16, 21-23], и во всех линиях GC клеток, созданных из новообразованиях это население [24, 25]. Таким образом, эта хромосома может содержать важные гены, участвующие в желудочном канцерогенезе. Насколько нам известно, ни предыдущее исследование не исследовал роль Lyn и его регулирование в GC. Однако избыточная экспрессия LYN сообщалось в ряде видов рака [26-32]. Кроме того, регулирование <ЕМ> LYN Ру по метилирование ДНК была продемонстрирована в обоих колоректального рака и саркомы Юинга [33, 34], и Lyn
метилирование наблюдается в некоторых гемопоэтических и негемопоэтических клеточные линии [35]. Метилирование ДНК представляет собой молекулярную форму ДНК, которая тесно связана с функцией гена и типоспецифичной функции генов клеток [36]. Более того, метилирование ДНК может быть надежной биомаркеров, поскольку она является гораздо более стабильным, чем РНК или белка, и, следовательно, является перспективной мишенью для разработки новых подходов к диагностике и прогнозе рака [36].
<Р> CKB является одним из двух цитозольных изоформ креатинкиназы и могут участвовать в обменных процессах с участием гликолиза в не-мышечных клеток [37]. В отличие от нормальных клеток, которые в основном производят энергию с помощью окислительного фосфорилирования, большинство раковых клеток предпочитают аэробный гликолиз, который известен как эффект Варбурга [38]. Интересно, что MYC онкоген появляется, чтобы активировать несколько транспортеров глюкозы и гликолитических ферментов, способствуя тем самым эффект Варбурга [39]. Наше предыдущее Протеомные исследование показало, что несколько белков, участвующих в процессах производства энергии не регулировались в образцах GC и усилил эффект Варбурга в этом неоплазии [40]. Роль ЦКБ в GC остается плохо изученным: некоторые транскриптомных исследования сообщили о повышающую регуляцию CKB
в образцах GC [41, 42], в то время как другой показал CKB
деактивация [43]. Кроме того, как и для Lyn
гена, CKB
метилирование ранее описана в гематологические и солидных раковых клеточных линий, в том числе ГХ клеточных линий [44]. Метилирование CKB
по-видимому, связано с его пониженным уровнем экспрессии; Однако, дальнейшее расследование по-прежнему необходимо понимать регулирование CKB Ру по эпигенетических модификаций
. <р> Таким образом, мы сначала целью оценки экспрессии мРНК и белка SRC, Lyn и CKB в большой набор образцов GC. Затем мы оценили ли эти гены могут регулироваться метилирование ДНК в желудочном канцерогенезе. Кроме того, мы исследовали возможную связь между экспрессией киназы или метилирования и клинических переменных, а также экспрессии MYC и метилирования.

Материалы и методы

Образцы тканей
выражение <р> киназа и паттерны метилирования были оценены в 138 пар образцов ГХ и их соответствующих неопухолевых образцах ткани желудка, полученных от пациентов, перенесших гастрэктомию в Северной Бразилии. Все пациенты имели отрицательные историй воздействия либо химиотерапии или лучевой терапии до операции, и не было никакого совместного появления других диагностированных раковых образований. Это исследование было одобрено этическим комитетом Жоао де Баррос Баррето University Hospital (Протокол № 316737). Письменное информированное согласие с утверждением комитета по этике было получено от всех больных до сбора образцов.
<Р> Часть каждого расчлененного образца опухоли был формалином фиксированной и парафин (FFPE). Разделы FFPE ткани окрашивали гематоксилин-эозином для гистологической оценки или используется для иммуногистохимии (IHC) анализа. Дополнительные участки каждой опухоли и спаренные образцы без опухолевой ткани были быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до белка и очистки нуклеиновых кислот.
<Р> Все образцы были классифицированы в соответствии с Lauren [45 ], а опухоли были поставлены в соответствии с критериями TNM стадирования [46]. Присутствие <ЕМ> Helicobacter Pylori
, класс I канцерогенов, в желудочном образцах определяли с помощью быстрого уреазного теста, а его фактором вирулентности цитотоксичность, связанный ген А (ген CagA) был обнаружить с помощью ПЦР с использованием ДНК очищают одновременно с белками и мРНК, как и ранее выполненной нашей группой [47]. Вирус Эпштейна-Барр (EBV) была обнаружена РНК гибридизация в [47].
<Р> Для 49 из этих пар неопластических и неопухолевых образцах, мы оценивали MYC иммунореактивности, экспрессия и статус метилирования данных мРНК ранее опубликованные в нашей группе [18].

белка, мРНК и ДНК очистки
<р> Общий белок, мРНК и ДНК одновременно выделяли из образцов желудочных тканей с использованием /РНК белка Kit /AllPrep ДНК ( Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Белок осадок растворяли в буфере, содержащем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 50 мМ ДТТ, 1% протеаза Ингибитор Коктейль (Sigma-Aldrich, США) и 0,5% каждый фосфатаза Ингибитор Коктейль 1 и 2 (Sigma -Aldrich, США), как и ранее выполненной нашей группой [48]. Концентрации белка определяли по методу Брэдфорда (Sigma-Aldrich, США). Концентрацию РНК и качество определяли с помощью спектрофотометра (NanoDrop Kisker, Германия) и 1% агарозном геле, соответственно. Образцы хранили при -80 ° С до использования.

Белок иммунореактивности анализ
<р> секции опухолевой ткани (3 или 4-мм толщиной) были депарафинировали в ксилоле и регидратации в серии градуированных этанола. После извлечения эпитопа тепла индуцированных срезы ткани инкубировали с первичным мышиных моноклональных антител против СРК (разбавление 1: 400; клон 28, Life Technologies, USA), Lyn (разведение 1: 400; клон C13F9; Life Technologies, USA) или CKB (разведение 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, США). Универсальный Комплект вторичного антитела, конъюгированные с пероксидазой (LSAB система, DakoCytomation, США) использовали для обнаружения. Мы использовали 3,30-диамино-бензидина /H <суб> 2О <суб> 2 (DakoCytomation, Дания) в качестве хромогена и гематоксилином как контрастирующая. Белок иммунореактивности-положительный образец был определен как один, имеющий не менее 10% опухолевых клеток, которые были положительными дл белка.

Экспрессию белка анализ
<р> Вестерн-блот-анализ проводили, как описано ранее нашей группой [49]. Снижение белка (25 мкг) из каждого образца отделяли 12,5% гомогенность SDS-PAGE и электромеханических блоттингом на PVDF мембрану (Hybond-P, GE Healthcare, США). PVDF-мембрану блокировали фосфатно-буферном солевом растворе, содержащем 0,1% Tween 20, 5% обезжиренного молока и инкубируют в течение ночи при 4 ° С с соответствующими первичными антителами: анти-Src (разведение 1: 1000; клон 28, Life Technologies, США), анти-LYN (разведение 1: 1000; клон C13F9; Life Technologies, USA), анти-CKB (разведение 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, США), и анти-ACTB (разведение 1: 250; Ас -15, Life Technologies, США). После тщательной промывки, пероксидаза-конъюгированными вторичное антитело было добавлено в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммунореактивного полосы визуализируют с помощью промокательной реагента западного люминола, и изображения были получены с использованием цифровой системы изображения ImageQuant 350 (GE Healthcare, Швеция). ACTB был использован в качестве нагрузки опорного элемента управления.

экспрессия мРНК анализ
<р> Во-первых, РНК обратной транскрипции с использованием высокой емкости кДНК Архив комплект в соответствии с протоколом производителя (Life Technologies, США) , Комплементарной ДНК затем усиливается в режиме реального времени обратной транскрипции количественной ПЦР (RT-КПЦР) с использованием TaqMan зондов, приобретенных в качестве продуктов Assays по требованию для экспрессии генов (Life Technologies, США) и 7500 Fast ПЦР в реальном времени инструмент (Life Technologies , США). GAPDH
ген был выбран в качестве внутреннего контроля для ввода РНК и обратной транскрипции эффективность. Все RT-qPCRs были выполнены в трех экземплярах для обоих генов-мишеней ( SRC
: Hs01082246_m1; LYN
: Hs00176719_m1; CKB
: Hs00176484_m1) и внутренний контроль ( GAPDH
:. NM_002046.3)
<р> относительное количественное определение экспрессии гена рассчитывали в соответствии с Livak и Schmittgen [50]. Соответствующий контрольный образец был определен в качестве калибратора от каждой опухоли.

метилирование ДНК анализ
<р> паттерн метилирования и частота генов киназ оценивали с помощью метилирования специфической ПЦР (ССП) [51]. Kit EZ метилирование ДНК-Lightning ™ (Zymo Research, США) использовали для изменения GDNA путем бисульфита обработки, преобразования неметилированные цитозина в урацила и оставляя метилированных цитозина неизменным. Специфические праймеры для промоторов генов, описаны в таблице 1.

Реакции ПЦР проводили с использованием 0,1 мкмоль /л дНТФ, 2 мкмоль /л MgCl <суб> 2, 0,5 мкмоль праймеров, 1,25 U Taq ДНК-полимеразы, и 100 нг бисульфит-модифицированной ДНК. После первоначальной денатурации в течение 5 мин при 94 ° С, 40 циклов при 94 ° С в течение 45 с, температура отжига (таблица 1) в течение 45 с, и 72 ° С в течение 30 сек, были проведены, с последующим конечным удлинением в течение 5 мин при 72 ° С. Продукты ПЦР непосредственно загружали на 3% -ном агарозном геле и подвергали электрофорезу. Гель окрашивали SYBR ^{® Safe ДНК Gel Stain (Life Technologies, США) и непосредственно визуализируется при ультрафиолетовом освещении. В качестве положительного контроля для всех реакций MSP, образец гДНК был полностью метилированный использованием CpG метилазой (УОНИ, New England Biolabs, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Кроме того, праймеры для обнаружения последовательности дикого типа были использованы для мониторинга полной конверсии ДНК, полученной в реакции бисульфита
<р> Образцы были разделены следующим образом: 1). Образец был определен как hypomethylated когда положительное усиление продукт был обнаружен только в ПЦР со специфическими праймерами для неметилированных последовательностей; 2) образец был определен как гиперметилированы при положительной амплификации была обнаружена только в ПЦР с использованием праймеров, специфичных для метилированных последовательностей; 3) образец был определен как частично метилированной при положительной амплификации был обнаружен в ПЦР с использованием двух наборов праймеров.
<Р> специфичность Праймеры 'и результаты были подтверждены MSP использованием ПЦР подход бисульфит секвенирования (BSP) [52] , БСП также был использован для оценки процент метилирования. Праймеры и anneling температуры BSP описаны в таблице 1. После амплификации фрагменты были очищены с использованием NucleoSpin геля и ПЦР-Clean-Up Kit (Macherey-Nagel, Германия), лигируют в pGEM T-легко Vector (Promega, Германия) и клонировали в компетентный E
. палочка
JM109 клетки. После инкубационного периода, белые колонии были отобраны для ПЦР с M13 вперед (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') и М13 (реверсе 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' праймеров) [53]. После первоначальной денатурации в течение 3 мин при 94 ° С, ПЦР-амплификации состояла из 35 циклов при 94 ° С в течение 30 с, 55 ° С в течение 30 с, и 72 ° С в течение 90 секунд были проведены, с последующим конечным удлинением для 5 мин при 72 ° С. Продукты ПЦР визуализировали в агарозном геле. Шесть клонов были выбраны для очистки и секвенируют в автоматическом секвенсор ABI310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Все последовательности были приведены в соответствие с BioEdit v7.0.5 [54], а также анализ метилирования проводили с программным обеспечением BIQ Analyzer [55]. Процент метилирования для каждого образца рассчитывали путем деления количества метилированных CpGs от общего количества CpGs секвенированы (ЦГ во всех шести клонов).}

Статистический анализ
<р> Данные приведены как частоты, срединной и межквартильного диапазоне (IQR). Испытание Шапиро-Уилк использовали для оценки распределения возраста, мРНК, экспрессии белка и процент данных метилирования и определить соответствующий последующий тест для статистических сравнений. Тест Манна-Уитни был использован для выявления возможных связей между мРНК-киназы или экспрессии белка и категориальные переменные, такие как иммунореактивности, метилирования и клинико-патологическими особенностями. Тест Манна-Уитни был использован для выявления возможных связей между процентом метилирования и иммунореактивности и клинико-патологическими особенностями. тест Вилкоксона использовали для сравнения процент метилирования между парами неопластических и не-неопластических образцов. Связь между категориальными переменными анализировали с использованием хи-квадрат (χ 2) тест. Корреляция тест Спирмен использовали для оценки возможной корреляции между мРНК и экспрессии белка, а также метилирования промотора. Р-значение меньше 0,05 считается значительным. Бонферони регулировка значения р была применена, когда были проведены множественные сравнения с уровнем альфа разделяется на число сравнений.

Результаты

экспрессия киназа в опухолях желудка
<р> Non-атипичные клетки желудка не представили SRC или LYN иммунореактивности (рис 1А и 1С). Тем не менее, ГНЦ иммунореактивность наблюдали в диспластических клетках. Клеточная мембрана и цитоплазматическая иммунореактивность для SRC и Lyn был обнаружен в опухолевые клетки (рис 1B и 1D) и LYN также представлены нуклеиновую иммунореактивности. CKB иммунореактивности был обнаружен в цитоплазме или в клеточной мембране в неопухолевых клетках желудка (рис 1д). В противоположность этому, GC клетки не представляли CKB иммунореактивности (рис 1F).
<Р> SRC, LYN и CKB иммунореактивность была обнаружена у 72 (52,2%), 66 (47,8%) и 0 (0%) опухоли образцы. SRC и LYN иммунореактивности были связаны с более высокими уровнями мРНК и белка в образцах GC (р < 0,001 для всех сравнений; Манна-Уитни тест; рис 2А, 2С, 2Е и 2G). Уровни белка и мРНК SRC были увеличены по крайней мере, в 1,5 раза (по меньшей мере, 50% -е увеличение экспрессии) в 67 (48,6%) и 80 (58%), соответственно, образцы GC по отношению к их совпавшего неопухолевых желудка образцы (рис 2B, 2D и 2K). Кроме того, белок и уровни мРНК Lyn были увеличены по крайней мере, в 1,5 раза в 36 (26,1%) и 72 (52,2%) образцов ГЦ, соответственно (рис 2F, 2Н и 2K). С другой стороны, снижение экспрессии белка CKB и мРНК (по крайней мере 50% снижение экспрессии) была обнаружена в 104 (75,4%) и 49 (35,5%) образцов ГЦ, соответственно (рис 2I, 2J и 2K). Сильная и прямая корреляция наблюдалась между мРНК и экспрессии белка для SRC (р &л; 0,001, ρ = 0,856, Спирмен корреляции тест), LYN (р &л; 0,001, ρ = 0,762) и ЦКБ (р &л; 0,001, ρ = . 0,819)
<р> иммунореактивности SRC был связан с иммунореактивности LYN (р &ЛТ; 0,001, χ ^{2 тест), 52 (37,7%) образцов GC представляющих иммунореактивности для обоих белков. Кроме того, наблюдается прямая корреляция между SRC и белком LYN (р < 0,001, ρ = 0,556) и мРНК (р &л; 0,001, ρ = 0,779) выражение. Уровни белка CKB и экспрессии мРНК были обратно коррелируют с СРК (р &л; 0,001, ρ = -0,734; р &л; 0,001, ρ = -0,806 соответственно) и Lyn (р &ЛТ; 0,001, ρ = -0,643; р &л;. 0.001, ρ = -0,703 соответственно)
<р> в таблице 2 приведены результаты для SRC, Lyn и экспрессии CKB и клинико-патологическими характеристиками. Опухоли у пациентов с поздним началом GC представлены значительно более высокий SRC и белок Lyn (по IHC и вестерн-блоттинга) и мРНК (посредством RT-КПЦР) экспрессии, а также снижение экспрессии белка CKB с помощью вестерн-блоттинга, по сравнению с ранним началом CG образцы (р &л; 0,05, для всех сравнений; Таблица 2). Увеличение белка и экспрессии мРНК SRC и Lyn и снижение экспрессии CKB были связаны с продвинутой стадии, более глубокой инвазии опухоли, а также наличие лимфатического узла и отдаленных метастазов (р &ЛТ; 0,05, для всех сравнений; таблица 2)
<. р> постепенное значительное увеличение белка SRC (с помощью вестерн-блоттинга), и экспрессия мРНК наблюдалась соответствующая стадии опухоли (р &ЛТ; 0.008, для большинства сравнений; критерий Манна-Уитни с последующей коррекцией Бонферрони; фиг.3А и 3В) , В противоположность этому, постепенное значительное снижение экспрессии белка и мРНК CKB наблюдалось соответствующее стадии опухоли (р &ЛТ; 0.008, для большинства сравнений; рис 3G и 3H). Что касается выражения LYN, мы не наблюдали значительную разницу между этапами I и II или между стадиями III и IV. Тем не менее, этапы I и II значительно отличались от стадий III и IV (р &Лт; 0,008, для этих сравнений; рис 3D и 3Е).}

Киназные гена паттерны метилирования в образцах желудочного
Таблица

3 показана картина метилирования исследованных протеинкиназ в неопластических и не-неопластических образцов желудочного ССП. Примерно 60% и 30% образцов GC представлен положительный результат амплификации только с неметилированной набором праймеров (hypomethylated образцов) для SRC
и Lyn
гены, соответственно (рис 4А и 4Б). Гипометилирование этих генов не наблюдалось ни в неопухолевых образце. Таким образом, частота SRC
и Lyn
гипометилирование был в GC значительно выше, чем в неопухолевых образцов желудочного (р &ЛТ; 0,001 для всех сравнений; χ ^{2 теста с последующим по Бонферрони поправок).
<р> анализ BSP подтвердил анализ MSP. По БСП, 82 (59,4%) опухолевых образцов и 0 (0%) от неопухолевых образцов представлены клонированной последовательности без CpG метилирования в SRC
промоутер. Кроме того, 4 (2,89%) и 1 (0,72%), неопластических и не-неопластических образцов представлены клонированной последовательности без CpG метилирование Lyn
промотора, соответственно. По БСП, процент SRC
[0,135 (0,31) по сравнению с
0,563 (0,23); р &л; 0,001] и LYN
[0,238 (0,40) по сравнению с
0,7063 (0,26); р &л; 0,001] метилирования в неопластических образцах ниже, чем в неопухолевых образцах (рис 5А и 5В).
<Р> SRC
и Lyn
метилирования неопластическая и не -neoplastic образцы, тогда как установлено, что связано (р &лт; 0,001, для обоих анализов; χ 2 тест). Мы наблюдали, что 70/81 (86,4%) опухолей с hypomethylated SRC
представленных частичную метилирование этого гена в совпадающей неопухолевых образца. Кроме того, мы обнаружили, что 37/41 (90,24%) опухолей с hypomethylated Lyn
представлен частичный метилирование этого гена в совпавшего неопухолевых образца. SRC
и Lyn
частичная метилирование в неопухолевых образцах чаще наблюдается у лиц, представляющих образцы опухолей с гипометилированию этого гена по сравнению с опухолями с частичным метилирования (р < 0,001, для обоих анализ) или гиперметилирование (р &лт; 0,001, для обоих анализов). Кроме того, частично метилированной LYN
в неопухолевых образцах также чаще обнаруживается у лиц, представляющих образцы опухолей с частичным метилирования этого гена по сравнению с опухолями с гиперметилированием (р = 0,004). К BSP, мы также отметили, что процент SRC
(р < 0,001, р = 0.6902; Рис 5D) и Lyn
(р < 0,001, ρ = 0,739; рис 5E ) метилирование неопластических и неопухолевых образцах были соотнесены.}

CKB
частичная и гипометилирование наблюдалась в обоих неопластических и неопухолевых образцах. Тем не менее, 48 (39%) образцов GC представлены CKB
гиперметилирование (рис 4C), который не был обнаружить в неопухолевых образцах. Кроме того, частота CKB
-hypermethylated образцов была значительно выше в сравнении с опухолевое неопухолевых образцов желудочного (р &л; 0,001), и CKB
частичная метилирование была также значительно чаще в GC, чем в неопухолевых образцах (р &л; 0,001). По БСП, процент CKB
метилирования в неопластических образцах выше, чем в неопухолевых образцах [0,511 (0,42) по сравнению с
0,133 (0,12); р &л; 0,001; Рисунок 5C]. Клонированные последовательности без CpG метилирования был обнаружен в 4 (2,89%) и 0 (0%) опухолевые и неопухолевых образцов соответственно.
<Р> CKB
метилирование неопластическая и не -neoplastic образцы, как представляется, связаны (р = 0,014, по х ^{2 теста). Анализ 2х2 с использованием χ 2 теста показали, что пары, в которых образцы опухоли гиперметилированы представил CKB
и совпадающая неопухолевых образцы представлены гипометилирование этого гена были более частыми, чем пар опухолей с гиперметилированием и соответствует неопухолевых образцы с частичной метилирования (р = 0,0381), но эта находка не достигла статистической значимости, если была применена корректировка Бонферрони (скорректированный α = 0,05 /3 = 0,0167). Однако, БСП, мы наблюдали, что процент CKB
метилирование неопластических и неопухолевых образцах были в обратной корреляции (р &л; 0,001, ρ = -0,375; Рис 5F).
<Р> прямая корреляция наблюдалась между SRC
и Lyn
паттерны метилирования в неопухолевых образцах (р &Лт; 0,001, ρ = 0,627). Кроме того, обратная корреляция была обнаружена между SRC
и CKB
(р < 0,001, р = -0.467) и LYN
и CKB
(р &л; 0,001, ρ = -0,359) метилирование. Тем не менее, в образцах GC, наблюдалась прямая корреляция между процентом метилирования трех исследованных киназ: SRC
и Lyn
(р &л; 0,001, ρ = 0,840); SRC
и CKB
(р &л; 0,001, ρ = 0,684); LYN
и CKB
(р &л; 0,001, ρ = 0,663).}

Метилирование регулирование киназ
<р> Для выяснения эпигенетической регуляции изученного гены, мы оценивали возможную связь между метилирования промотора и белка иммунореактивности и мРНК и экспрессии белка (по вестерн-блоттинга)
<р> мы наблюдали, что как мРНК и экспрессию белка SRC (р &л;. 0.001, ρ = -0,834; р &л; 0,001, ρ = -0,718; соответственно; фиг.6А и 6В) и LYN (р &л; 0,001, ρ = -0,792; р &л; 0,001, ρ = -0,654; соответственно; рис 6D и 6E) обратно коррелирует с процентом метилирования промотора. Кроме того, опухоли с SRC [0,062 (0,08) по сравнению с
0,375 (0,33); р &л; 0,001; тест Манна-Уитни; Рис 6C] и LYN [0,127 (0,11) по сравнению с
0,500 (0,39); р &л; 0,001; Рисунок 6F] иммунореактивности представлен более низкий процент метилирования, чем опухоли, не имеющего такой белок иммунореактивности
<р> Что касается регулирования CKB, наблюдалась прямая корреляция между процентом метилирования и мРНК CKB и экспрессии белка (р &л;., 0,001 ρ = 0,684; р &л; 0,001, ρ = 0,686; соответственно; рис 6G и 6Н). Интересно отметить, что увеличение экспрессии белка и мРНК CKB наблюдалась в опухолях с hypomethylated CKB
промотор по сравнению с опухолями с частично денатурированного промотор (р = 0,015, р = 0,008, соответственно, Манна-Уитни тест с последующим Бонферрони поправок; S1 рис). Однако опухоли с гиперметилированы CKB
промотор также представлен увеличенный белок и экспрессию мРНК по сравнению с опухолями с частично денатурированного промотор (р &л; 0,001, для обоих сравнений).

Метилирование киназы промоутеров и клинико-патологические переменные
<р> В неопухолевых слизистой оболочки желудка, процент SRC
(р = 0,010, ρ = -0,218) и Lyn
(р = 0,003, ρ = -0,248) метилирование (слабо) обратно коррелирует с возрастом пациентов во время операции, хотя ни одна другая ассоциация не наблюдалась между процентом метилирования и пола, H
. пилори
и EBV инфекции в неопухолевых образцах (р ≫ 0,05; Манна-Уитни тест).
<Р> Таблица 4 показывает связь между процентом метилирования в образцах ГХ и клинико-патологическими характеристиками , В опухолевых образцах, процент SRC
(р = 0,002, ρ = -0.267), Lyn
(р = 0,014, ρ = -0.208) и CKB
(р = 0,024, ρ = -0,192) метилирование (слабо) обратно коррелирует с возрастом пациентов в хирургии. Кроме того, процент SRC
(р = 0,002), Lyn
(р = 0,015) и CKB
(р = 0,024) метилирование была ниже в с поздним началом чем в ранним началом образцов GC. Кроме того, мы обнаружили, что метилирование SRC был ниже в не-кардии GC по отношению к кардии GC (р = 0,028).
<Р> Уменьшение процента SRC
, LYN
и CKB
метилирование были связаны с продвинутой стадии, более глубокой инвазии опухоли, а также наличие лимфатического узла и отдаленных метастазов (р &ЛТ; 0,05, для всех сравнений, таблица 4). Сравнение SRC
и Lyn
картины метилирования ССП и клинико-патологическими характеристиками представлены аналогичные результаты (S2 таблицу). Однако частичное метилирование CKB
ССП также чаще всего встречается, чем гиперметилированием в T3 /T4 опухолей (р = 0,008; S2 таблицу). CKB
частичная метилирование также чаще, чем гиперметилированием (р &л; 0,001) и гипометилирование (р = 0,009; S2 Таблица). В опухолях от пациентов с отдаленными метастазами в отношении опухолей от лиц без отдаленных метастазов <бр> <р> постепенное снижение доли SRC
и Lyn
метилирование наблюдалась соответствующая стадия опухоли (р &л; 0,008, для большинства сравнений; тест Манна-Уитни с последующей коррекцией Бонферрони; фиг.3С и 3F). Что касается CKB
метилирование, 12 из 14 (85,7%) образцов ГХ на стадии I представлены 73,3% метилирования. Процент CKB
метилирования был выше на стадии I, чем в стадии II, III и IV (р &л; 0,008, для большинства из этих сравнений; рис 3I). С другой стороны, процент CKB
метилирование была значительно уменьшена в стадии IV по отношению к другим этапам (р &Лт; 0.008, для этих сравнений; рис 3I).

киназ и MYC отношения
<р> Мы исследовали MYC иммунореактивности, экспрессию мРНК и данные о состоянии метилирование для набора из 49 исследованных пар неопластических и не-неопластических образцов.

• PLoS ONE: Клиническое значение MIR-137 Expression у пациентов с раком желудка после радикальной Gastrectomy
• PLoS ONE: Эксклюзивная Ассоциация p53 Мутации с сверхвысокие Метилирование опухолевый супрессор Гены в Pathway р53 в у…