PLoS One: szabályozatlan expressziója SRC, LYN és CKB kinázok DNS metiláció és potenciális szerepe a gyomorrák invazív és metasztatikus

absztrakt katalógusa

A kinázok downstream modulátorok és effektorait számos celluláris jelátviteli kaszkád és kulcsfontosságú szerepet játszanak a fejlesztés a daganatos betegségek. Ebben a vizsgálatban a célul tűztük, hogy értékelje SRC, LYN és CKB fehérje és mRNS expresszióját, valamint ezek promotor metiláció, a gyomorrák. Azt találtuk megemelkedett expressziója SRC és LYN kináz mRNS és fehérje de csökkent szintje CKB kináz, változtatások, amelyek esetleg szerepe van a invazivitását és metasztázis a gyomor tumorok. Expression a három vizsgált kinázok is társult MYC onkogén expresszió, egy lehetséges biomarker gyomorrák. Ahhoz, hogy megértsük azokat a mechanizmusokat, amelyek szabályozzák a expresszióját e gének, értékeltük a DNS promoter metiláció a három kinázok. Azt találtuk, hogy csökkent SRC katalógusa és LYN katalógusa metiláció és fokozott CKB katalógusa metilációs járt gyomorrákban. A csökkentett SRC
és a LYN
metilációs társult megnövekedett mRNS és fehérje expresszió, ami arra utal, hogy a DNS metiláció részt vesz expresszióját szabályozó ezen kinázok. Ezzel szemben, a csökkentett CKB
metiláció volt megfigyelhető mintákban csökkent mRNS és fehérje expresszió, ami arra utal, CKB kifejezés azt találtuk, hogy csak részlegesen szabályozott DNS metiláció. Továbbá, azt találtuk, hogy a változások a DNS metilációs minta a vizsgált három kinázok is társult a gyomorrák kialakulását, az előrehaladott gyomorrák, a daganat mélyebb invázió és a jelenléte a metasztázist. Ezért, SRC, LYN és CKB kifejezést, vagy a DNS metiláció hasznos lehet markerek előrejelzésére tumor progresszió és célzás rákellenes stratégiák. Katalógusa

Citation: Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Montenegró RC, et al. (2015) szabályozatlan expressziója SRC, LYN és CKB kinázok DNS metiláció és potenciális szerepe a gyomorrák invazív és metasztatikus. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492 katalógusa

Szerkesztő: Jose G. Trevino, University of Florida, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: May 27, 2015; Elfogadva: szeptember 25, 2015; Megjelent: október 13, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Mello et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány által támogatott Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; támogatásokǗ072 /2012-5 és 402283 /2013-9; ösztöndíjjal MCS és RRB), Fundacao de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; megadását #ICAAF 123/2014 hogy RRB) és Fundacao de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; támogatásÈ9 /07145-9; ösztöndíjjal MFL), mint támogatások és ösztöndíj díjat. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a negyedik leggyakoribb rák típusától és a második legmagasabb daganatos halálok világszerte. [1] Kezelése GC előrehaladott szakaszában továbbra is nehéz, és a prognózis továbbra is gyenge, ami részben a helyi kiújulás, tumor invázió és /vagy áttét. A teljes relatív 5 éves túlélési arány jelenleg kevesebb, mint 20% [2]. Egy jobb megértéséhez a biológia a progresszió ennek neoplasia elengedhetetlen, hogy csökkenjen a halálozási arány a fejlesztését újszerű beteg kezelésére és terápiás stratégiák.

Phosphotransferases, más néven kinázok, downstream modulátorok és effektorok több celluláris jelzőkaszkádok és kulcsfontosságú szerepet játszanak a fejlesztés a neoplasztikus betegség [3]. Eddig számos protein-kináz-kölcsönható gyógyszerek már regisztrált klinikai vizsgálatok [4]. Mi korábban elvégzett szűrés azonosítani kináz kifejezett fehérjét GC Capture vegyület tömegspektrometria [5, 6] (S1 File), és 22-kináz fehérje, beleértve az SRC, LYN és CKB, kimutatható volt (S1 táblázat). Ez a három kinázok választottunk ki további vizsgálatok (S1 ábra).

SRC volt az első, proto-onkogén felfedezték, és központi szerepet játszik a celluláris jelátviteli utak. Aberráns Src-aktivitás figyelhető meg számos emberi rákos megbetegedések, beleértve a GC [7-9], és fontos lehet a tumoros kialakulásában és fejlődésében [10, 11]. A mitogén funkciója SRC, legalábbis részben, által közvetített indukcióját MYC, egy sejtciklus-szabályozó, és a transzkripciós faktor [12, 13]. A csoport korábban leírt MYC upreguláció humán GC és N-metil-nitrozo-karbamid-kezelt főemlősök [14-19]. Mivel az aktiválás SRC, valamint, hogy a más kinázok, MTA pleiotrop hatások, hogy függ a sejttípustól és az összefüggésben [20], mégis fontos, hogy megértsük a lehetséges kapcsolatát kinázok és MYC expresszió gyomor karcinogenezis, és a molekuláris mechanizmus részt vesz a szabályozás. katalógusa

LYN egy másik tagja az SRC család kinázok, és a LYN katalógusa gén található kromoszóma 8q13. Csoportunk korábban bejelentett jelenlétében nyeresége 8. kromoszóma (amely a MYC katalógusa gén is található) a GC esetben Észak-Brazília [16, 21-23], és az összes GC sejtvonalak létre neopláziákban a Ebben a populációban [24, 25]. Ezért ez a kromoszóma amelyek fontos szerepet játszó gének gyomor kialakulásában. Tudomásunk szerint nem a korábbi kutatás már betöltött szerepét vizsgáltuk LYN és szabályozása a GC. Azonban, LYN overexpressziója leírták számos rák [26-32]. Ezen túlmenően, a szabályozás a LYN
DNS metiláció kimutatható volt mindkét colorectalis rák és Ewing-szarkóma [33, 34], és a LYN
metiláció észlelték néhány hematopoietikus és nem hematopoietikus sejtvonalak [35]. DNS metiláció egy molekuláris módosítását DNS, amely szorosan összefüggő génfunkció és sejttípus-specifikus gén funkció [36]. Továbbá, a DNS-metiláció lehet egy robusztus biomarker, mivel ez sokkal stabilabb, mint az RNS vagy fehérje, és ezért ígéretes célpontja az új megközelítéseket a diagnózis és a prognózis rákok [36].

CKB egyike annak a két citoszol izoformája kreatin-kináz, és részt vehetnek a metabolikus folyamatok bevonásával glikolízis nem-izom sejtekben [37]. Ezzel szemben a normál sejtek, amelyek elsősorban energianyerés keresztül oxidatív foszforiláció, a legtöbb ráksejt inkább aerob glikolízis, amelyről ismert, mint a Warburg hatás [38]. Érdekes, hogy a myc onkogén tűnik, hogy aktiválja több glükóz transzporterek és glikolitikus enzimek, ezáltal hozzájárulva a Warburg hatás [39]. Korábbi proteomikai vizsgálat során kiderült, hogy több résztvevő fehérjék energiatermelő folyamatok szabályozatlan GC minták és megerősítették a Warburg hatása ebben neoplasia [40]. A szerepe a CKB GC továbbra sem elég ismert: néhány transzkriptomikai tanulmány számolt be az túlszabályzását CKB katalógusa GC minták [41, 42], míg egy másik azt mutatta, CKB katalógusa alulszabályozottsághoz [43]. Ezen túlmenően, mivel a LYN
gén, CKB
metilezési korábban ismertetett hematológiai és szilárd rákos sejtvonalak, ideértve a GC sejtvonalak [44]. A metiláció a CKB katalógusa tűnik, hogy kapcsolatban áll a csökkent expresszió szintje; azonban további vizsgálatot is szükség van, hogy megértsük a szabályozás CKB katalógusa által epigenetikai módosítások. katalógusa

Ezért először kívánta értékelni mRNS és fehérje expressziója SRC, LYN és CKB egy nagy meghatározott GC minta. Ezután értékeltük, hogy ezek a gének lehet szabályozni DNS metiláció a gyomorrák kialakulásában. Emellett megvizsgáltuk a lehetséges összefüggés a kináz expresszióját vagy metiláció és klinikai változók, valamint MYC expresszió és metilációs. Katalógusa

Anyag és módszer katalógusa

A szövetminták

kináz expresszióját és metilációs mintázat értékelték 138 pár GC minták és a hozzájuk tartozó nem-daganatos gyomor szövetminta nyert átesett betegek gastrectomián Észak-Brazíliában. Minden beteg negatív múltbeli expozíció vagy kemoterápia vagy sugárkezelés a műtét előtt, és nem volt együttes előfordulása más diagnosztizált rák. Ez a tanulmány által jóváhagyott etikai bizottsága João de Barros Barreto University Hospital (Protocolļ737). Írásos beleegyezését adta jóváhagyásával az etikai bizottság kaptuk előtt minden betegnél a mintavétel. Katalógusa

rész minden boncolt tumor minta formalinban fixált és paraffinba ágyazott (FFPE). Alosztályai FFPE szövetet festettünk hematoxilin-eozin szövettani kiértékelés vagy használt immunhisztokémiai (IHC) elemzést. További adag minden egyes tumor és párosítva nem neoplasztikus szövet minta volt lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on, amíg fehérje és a nukleinsav tisztítás.

Minden a minták szerint osztályozott Laurén [45 ], és a tumorokat rendeztek szerint a TNM átmeneti kritériumokat [46]. A jelenléte Helicobacter pylori katalógusa, egy osztály karcinogén anyagok I., a gyomor mintákban kimutatható volt a gyors ureáz vizsgálat, és annak virulencia faktor citotoxicitási asszociált gén A (CagA gén) volt kimutatására PCR segítségével DNS-t tisztítottuk, egyidejűleg fehérjékkel és mRNS, ahogy korábban végzett mi csoport [47]. Epstein-Barr-vírus (EBV) kimutatható volt az RNS in situ hibridizációval [47].

49 ilyen pár neoplasztikus és nem neoplasztikus mintákban megvizsgáltuk az MYC immunreaktivitást, mRNS-expresszió és metilációs állapotának adatait korábban által közzétett mi csoport [18].

protein, mRNS és DNS-tisztítási

Összes fehérje, mRNS, és a DNS-t egyidejűleg izoláltunk gyomor szöveti mintákban a AllPrep DNS /RNS /fehérje Kit ( Qiagen, Németország) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A fehérje üledéket feloldjuk egy pufferben, amely 7 M karbamidot, 2 M tiokarbamid, 4% CHAPS, 50 mM DTT-t, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA), és 0,5% minden egyes foszfatáz-gátló koktél 1 és 2 (Sigma -Aldrich, USA), a korábban végzett a csoport [48]. A fehérje-koncentrációkat határoztuk meg Bradford módszerével (Sigma-Aldrich, USA). Az RNS-koncentráció és a minőség segítségével határoztuk meg egy NanoDrop spektrofotométerrel (Kisker, Németország) és 1% -os agaróz gélen, ill. A mintákat -80 ° C-on tároltuk felhasználásig.

Protein immunreaktivitás elemzés

Tumor szöveti metszeteken (3 vagy 4 mm vastag) adtunk paraffint xilolban és rehidratált egy fokozatos sorozat etanolt. Miután hővel indukált epitóp visszakeresés, a szöveti metszeteket elsődleges monoklonális egér elleni antitestek SRC (hígítás 1: 400; klón 28, Life Technologies, USA), LYN (hígítás 1: 400; klón C13F9; Life Technologies, USA), vagy CKB (hígítás 1: 250; HPA001254, santa Cruz Biotechnology, amerikai Egyesült Államok). Egy univerzális peroxidáz-konjugált másodlagos antitesttel készlet (LSAB Rendszer, DakoCytomation, USA) használtunk kimutatására. Mi használt 3,30-diamino-benzidin /H _{2 O 2 (DakoCytomation, Dánia), chromogén és hematoxilin a Counterstain. Egy protein immunreaktivitást-pozitív mintát meg, mint amelyek 10% vagy ennél több neoplasztikus sejteket, amelyek pozitívak voltak a fehérje.}

Protein expressziós analízis

Western-blot-analízist végeztünk a korábban leírtak szerint a csoport [49]. Csökkentett fehérje (25 ug) minden mintából elválasztjuk 12,5% homogén SDS-PAGE és elektro-blottoltuk PVDF membránra (Hybond-P, GE Healthcare, USA). A PVDF membránt blokkoltuk foszfáttal pufferolt sóoldatban, amely 0,1% Tween 20-t és 5% alacsony zsírtartalmú tej és egy éjszakán át inkubáljuk 4 ° C hőmérsékleten a megfelelő primer antitestek: anti-SRC (hígítás 1: 1000; klón 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (hígítás 1: 1000; klón C13F9; Life Technologies, USA), az anti-CKB (hígítás 1: 400; HPA001254, santa Cruz Biotechnology, amerikai Egyesült Államok), és az anti-ACTB (hígítás 1: 250; Ac -15, Life Technologies, USA). Alapos mosás után, egy peroxidáz-konjugált szekunder antitestet adtunk hozzá 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Immunreaktív sávokat vizualizáljuk Western blot Luminol reagens, és a kép szerzett alkalmazásával ImageQuant 350 digitális kép rendszerben (GE Healthcare, Svédország). ACTB használtunk telítő referencia kontrollként.

mRNS expressziós analízis

Először is, az RNS-t reverz transzkripció révén nagy kapacitású cDNS Archive szerinti készlet a gyártó protokollja (Life Technologies, USA) . Komplementer DNS-t ezután erősítve valós idejű reverz transzkripciós kvantitatív PCR (RT-qPCR) TaqMan próbák vásárolt esszék-on-demand Termékek Gene Expression (Life Technologies, USA) és a 7500 Fast Real-Time PCR eszköz (Life Technologies , USA). A GAPDH katalógusa gént választották a belső kontroll RNS bemenet és fordított transzkripció hatékonyságát. Minden RT-qPCRs háromszoros ismétlésben végeztünk mind a megcélzott gén ( SRC katalógusa: Hs01082246_m1; LYN katalógusa: Hs00176719_m1; CKB katalógusa: Hs00176484_m1) és a belső kontroll ( GAPDH
: NM_002046.3).

A relatív mennyiségi génexpresszió szerint számítottuk Livak és Schmittgen [50]. A megfelelő kontroll minta jelölték kalibráló minden tumor. Katalógusa

metilációs elemzés katalógusa

A metilációs mintázatát és gyakorisága kináz gének értékelték metiláció-specifikus PCR (MSP) [51]. Az EZ DNS metiláció-Lightning ™ Kit (Zymo Research, USA) használtunk, hogy módosítsa a gDNS biszulfit kezelés konvertáló metilálatlanok citozineket be uracil és az onnan denaturált citozineket változatlan. Specifikus primerek esetében a gén promotereket ismertetnek az 1. táblázatban

PCR-reakciókat végeztünk 0,1

• PLoS One: klinikai jelentősége a miR-137 expressziója a gyomorrákos betegeknél után Radical gasztrektómiának
• PLoS One: Exkluzív Szövetsége p53 mutáció Super-High metilezése tumor szupresszor gének a p53 egyedülálló gyomorkarcinóma Phenotype