PLO ON: Interleukin 17A promovira rak želuca invazivnosti preko NF-kB, posredovano matričnih metaloproteinaza 2 i 9 Expression

Sažetak pregled

interleukin 17A (IL-17A), kao pro-inflamatornih citokina, koji su uključeni u patologiju upalne bolesti i tumor okoline. Cilj ovog istraživanja je ispitati učinak IL-17A na invazivnosti raka želuca (GC). U istraživanju, otkrili smo da IL-17A može potaknuti migraciju i invaziju GC stanicama. Nadalje, nakon što je tretirana s IL-17A, izrazi i aktivnosti matrične metaloproteinaze 2 (MMP-2) i MMP-9 su nadregulirani, a izrazi TIMP-1 i TIMP-2 su regulirani. Osim toga, nuklearni /ukupni udjeli P65 i P50 dramatično su povišena IL-17A. Predtretman helenalin, inhibitor nuklearne faktor kB (NF-kB), dokazano je da se poništi promoviranje učinak IL-17A na sposobnost invazije GC stanicama i pojačanja djelovanja MMP-2 i MMP-9. U zaključku, naši rezultati ilustrirani da IL-17A može se promicati invaziju GC stanicama aktiviranjem NF-kB puta, a nakon toga regulirajući ekspresiju MMP-2 i MMP-9. Ovi rezultati mogu dovesti do identifikacije novih dijagnostičkih biljega i terapijskih ciljeva GC pregled

Izvor:. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) interleukin 17A promovira rak želuca invazivnosti putem NF -κB posredovana matričnih metaloproteinaza 2 i 9 izražavanja. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678 pregled

Urednik: Nikos K. Karamanos, Sveučilište u Patras, Grčka pregled

Primljeno: 26. studeni 2013; Prihvaćeno: 11. travnja 2014; Objavljeno: 6. lipnja 2014 pregled

Copyright: © 2014 Wang et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Projekt je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 81070536) i mladih znanstvenih fondova Središnjeg bolnici Taian (2011ZRQNO35). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Kao jedan od najboljih uzroka smrti od karcinoma povezanih u svijetu, GC je odgovoran za više od 700.000 smrtnih slučajeva godišnje [1]. To je drugi najčešći oblik raka i treći vodeći uzrok smrti kod pacijenata oboljelih od raka u Kini. [2] Jaka invazija i metastaze sposobnost GC je jedan od važnih faktora koji dovode do lošom prognozom [3]. Dakle, to je značajan otkriti temeljne mehanizme, za identifikaciju novih molekularnih terapijske ciljeve koji reguliraju invazije sposobnosti GC stanica, a time i za razvoj unapređenja tretmana za GC. Pregled

IL-17A je od osnivača IL -17 obitelj koja se kreće od IL-17A na IL-17F [4] - [8]. IL-17 članova obitelji imaju aktivnu ulogu u različitim bolestima, kao što su autoimune bolesti, upalne bolesti i malignih oboljenja. Uporna upala se smatra da se u korelaciji s povećanim rizikom od GC [9]. Rani koraci u želučanom karcinogeneze uključiti Helicobacter pylori pregled (H. pylori) Infekcija dovodi do kroničnog aktivnog i atrofični gastritis s proizvodnjom proupalnih medijatora [10] - [13], kao što su IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 i IL-8. Međutim, uloga IL-17A kod raka nije bilo u skladu prema prethodnim izvješćima. Neki dokazi otkrila je da IL-17A može poticati tumorski rast kroz poticanje angiogeneze i invazivne sposobnosti tumorskih stanica [14]. Nasuprot tome, drugi studije tvrde da IL-17A pokazuje zaštitni učinak protiv razvoja kronične limfocitne leukemije, promicanjem imunološkog odbacivanja tumora sustava posredovane [15]. Nadalje, IL-17A poboljšane citotoksičnih efekata NK stanica protiv stanica tumora povećavanjem ekspresije molekula citotoksičnih [16]. Do sada, ima manje izvještaj o ulozi IL-17A u invaziji na GC. Pregled

U ovom istraživanju, otkrili smo da IL-17A može povećati GC pokretljivost stanica za regulirajući MMP-2 i MMP -9 putem aktiviranje NF-kB transkripte faktora. pregled

Materijali i metode pregled

Kultura stanica pregled

Ljudski GC stanične linije AGS je kupljen od ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) i uzgajali u DMEM uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 u /L penicilina i 100 mg /l streptomicin. Ljudske GC stanične linije BGC-823 i sGC 7901 dobiveni su iz kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina) i uzgojene u RPMI-1640 mediju koji sadrži 10% telećeg seruma, penicilin (100 U /mL) i streptomicina (100 ug /ml). Sve stanice su kultivirane na 37 ° C, 5% CO _{2 atmosfere zraka. Pregled}

zacjeljivanja rana Ispitivanje

GC stanice bile su uzgajane kao monoslojevi u konfluentnim 6 jamica i ranjeno uklanjanjem 1 mm trake preko jažice s vrhom pipete kada se ljepe na površinu ploče. Su ranjene monoslojevi su zatim isprane dva puta s PBS-om da se odstrane nezaljepljene stanice, prije nego 1 ml medija sa ili bez IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) su dodani. Nakon 12 sati inkubacije, različite koncentracije skupine su fotografirali obratnim mikroskopa. Pregled

In vitro pregled Invazija Test pregled

In vitro pregled invazije ispitivanje se provodi korištenjem Bio-Coat Matrigelove invazije sustav analiza (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) kako je prethodno opisano [17]. Nakon tretira sa ili bez IL-17A (50 ng /ml), GC stanice su posađene u 200 ul medija bez seruma i smješten u gornje komore u 2 x 10 ^{5 stanicama i normalan medij za rast su bili smješteni u ispod komore , Dvadeset i četiri sata kasnije, stanice na gornjoj površini membrane su skinute s pamučnim brisevi, dok stanice na donjoj strani filtra su fiksirane, obojene, a mjeri. Postotak invazivnog stopa je izražena kao postotak kontrole. Pregled}

Western blotting analiza pregled

cijelih stanica lizat iz GC stanice su sakupljene sa staničnim puferom za lizu. Nuklearnih lizat iz kultiviranih stanica su sakupljene sa NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Njemačka), prema uputama proizvođača. Western blotting analiza izvedena sa standardnom protokolu, koristeći protutijela protiv MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, str52 i β-aktin (Cell Signalling Technology, Beverly, MA), NF-kB P50, P65 /relativnog, c-rel, RelB i histon H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). pregled

zimografiia pregled

Stanice su tretirane s različitim koncentracijama IL-17A na 37 ° C tijekom 24 sata, te uzorci kondicioniranog medija su skupljene. Odgovarajuće količine uzoraka (podesiti broj vitalnih stanica) su razdvojeni 0,1% želatine-8% SDS-PAGE elektroforeze. Nakon elektroforeze, gelovi su isprani dva puta s 2.5% Triton X-100 pri sobnoj temperaturi 30 minuta, a potom stavljane u reakcijskom puferu (10 mM CaClz _{2, 40 mM Tris-HCl, 0,01% NaN 3, pH 8,0) na 37 ° C tijekom 12 h. Coomassie brilliant blue R-250 gel mrlja je zatim korišten kako bi se obojilo gela. Intenzitet prugama na gelovi su izračunate primjenom sustava za analizu slike (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Pregled}

Statistička analiza pregled

Svi podaci su izraženi kao sredstvo ± SD. Statistička analiza je provedena pomoću softvera SPSS 16,0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) za procjenu statističke razlike. Student je t pregled -test se koristi za usporedbe između dvije skupine i jednosmjernu ili dvosmjernu analizu varijance korištena je za analizu statističkih razlika između skupina u različitim uvjetima. p pregled vrijednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom. Svi statistički testovi bili su dvostrani. Pregled

Rezultati pregled

IL-17A Povećava pokretljivost stanica u GC stanicama pregled

Test ogrebotine rana je provedeno kako bi se odredio učinak IL-17A na migraciju u AGS, BGC-823 i SGC-7901 stanica. Proširenje stanične migracije je ocijenjeno na temelju izmjerene postotak ponovnog naseljavanja na površini rane nakon 24 sata. U kontrolnoj skupini, kretanje nije očit. U prisutnosti IL-17A, ovaj pokret značajno unaprijeđen nakon 12 h inkubacije (Slika 1A). Kvantifikacija analiza je pokazala da je razlika je značajna (slika 1B). Štoviše, invazija analiza je pokazala da je invazivna sposobnost IL-17A tretira stanice bio je znatno jače od kontrolira roditeljsko stanice u sva tri testiranih staničnih linija (Slika 1C i 1D). Ovi podaci su pokazali da je IL-17A može povećati migraciju GC stanica i invazivnosti. Osim toga, mi također primijetio da IL-17A nema značajan učinak na proliferaciju BGC-823, SGC-7901 i AGS stanica (Slika S1), što ukazuje da je promicanje učinak IL-17A za migracije i invazivnosti ne ometaju po stanicu proliferacija. pregled

Učinak IL-17A na doreguliranje MMP-2 i MMP-9 i podreguliranje TIMP-1 i TIMP-2 u GC stanicama

Budući prekomjerna ekspresija MMP može promovirati metastaza raka [18], [19], što sljedeći put istražili učinak IL-17A na ekspresiju MMP u staničnim linijama GC. Kao što je prikazano na slici 2 i slici S2, izrazi MMP-2 i MMP-9 su uspoređene pomoću Western upijanja između IL-17A tretiranim i netretiranim stanicama. Rezultati su pokazali da se MMP-2 i MMP-9 su reguliran u IL-17A tretirane stanice (AGS i BGC-823) (slika 2a i 2b). Istovremeno, izrazi TIMP-1 i TIMP-2 su regulirani (slika 2A i 2B). Želatinske zimografije također je izveden za utvrđivanje aktivnosti MMP-2 i MMP-9 u GC stanica tretiranih sa i bez IL-17A. Rezultati su pokazali da je IL-17A poboljšanu aktivnost MMP-2 i MMP-9 u GC stanicama (AGS i BGC-823) (Slika 2C i 2D). Slični rezultati uočeni su u SGC-7901 stanica (Slika S2). Ovi rezultati sugeriraju da je pro-metastaze učinak IL-17A na GC može biti kroz reguliranje MMP /TIMP ravnotežu i potaknuo nas je na daljnje istraživanje mehanizma djelovanja. Pregled

IL-17A regulira povišenje MMP-2 i MMP 9 Izrazi putem Aktiviranje NF-kB put pregled

NF-kB je prijavljen kao nizvodni cilj IL-17A signalnog puta u mnogim stanicama [17], [20], [21], koji je u stanju pojačanog MMP-2 i MMP-9 izrazi [14], [17]. I IL-17A također opisano da se poveća ekspresiju MMP putem aktivacije NF-kB put u mnogim stanicama [14], [17]. Stoga, sljedeći provjerava se postoji li IL-17A doreguliran MMP-2 i MMP-9 izraza u GC stanicama preko aktivacije NF-kB. Kao što je prikazano na slici 3, ekspresija i translokacija NF-kB podjedinica u jezgri analizirani su pomoću Western blot-a. Uočili smo da je razina p65 i p50 u jezgrama dramatično je uzdignut u AGS stanica nakon IL-17A liječenje, dok je razina ukupne P65 i P50 nema promjene (slika 3A-D). Osim toga, nuklearna /ukupni broj tih molekula je povećan na IL-17a liječenja (Slika 3e). Slični su rezultati opaženi kod BGC-823 stanične linije (Slika S3A-E), što ukazuje da IL-17A aktivira NF-kB u stanicama s GC.

Nadalje, kada helenalin (5 um) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), inhibitor NF-kB, doda se AGS ili BGC-823 stanica medij prije IL-17A tretmana, razine ekspresije MMP-2 i MMP-9 značajno smanjena (Slika 4C-D, slika S4C-D). Rezultat je pokazao da je IL-17A inducirana MMP-2 i MMP-9 ekspresija u GC stanice kroz NF-kB aktivacije. Prema tome, IL-17A induciranih GC stanica invazivnost može također blokirao helenalin in vitro pregled (Slika 4A-B, slika S4A-B). Dakle, ovi rezultati ukazuju na to da je IL-17A aktivira NF-kB puta, nakon toga regulira ekspresiju MMP, i na taj način utječe na migraciju i invazivnost GC stanicama. Pregled

Rasprava pregled

GC je jedan od većina teške maligne bolesti u svijetu zbog svoje visoke stope recidiva nakon ljekovitim terapijama [3], [22]. GC je usko povezana s kroničnim upalnim bolestima, u kojem mnoštvo upalnih citokina infiltriraju. IL-17A je jedan od važnih citokina u razvoju brojnih upalnih bolesti, a također je često otkriven u tumorskom mikrookolini [23] - [26]. Prethodna studija sugerira da je razina ekspresije IL-17 u tumor može biti samostalna prognostički pokazatelj u adenokarcinoma bolesnika želuca [27]. Usporedba stope preživljavanja među pacijentima s visokim i niskim razinama IL-17 su otkrili da pacijenti s visokim razinama IL-17 ima stopu preživljavanja od 5 godina od 47% u usporedbi s 84% ​​u bolesnika s niskom razinom [28]. Međutim, molekularni mehanizmi za takve korelacije, koji može nam pomoći da bolje razumijemo ulogu IL-17 u razvoju i napretku GC, tek treba razjasniti. Pregled

U ovom istraživanju, otkrili smo da IL 17A promovirao invaziju GC stanicama. Metastaza je jedna od vodećih uzroka raka povezanih smrti među GC pacijenata. Razgradnja ECM krvi ili limfne žile je kritična za metastaze zbog gubitka ECM omogućuje stanice raka upasti krvi ili limfnog sustava proširiti na druga tkiva i organe [29]. MMP, naročito MMP-2 i MMP-9 su odgovorne za razgradnju ECM [19], [29]. IL-17A je prijavljen za promicanje invaziju stanica raka putem regulirajući ekspresiju MMP-2 i MMP-9 [17], [26]. Općenito je prihvaćeno da su MMP aktivnosti inhibirani TIMP kako bi se spriječilo veliko propadanje ECM [29]. Pojasniti mehanizam djelovanja IL-17A, ispitali smo da li je promicanje učinak IL-17A na invaziju stanica kroz regulaciju izrazima MMP-2, MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2. Naši rezultati pokazuju da je IL-17A povišen izraze i aktivnosti MMP-2 i MMP-9, a regulirani iskaza TIMP-1 i TIMP-2, što je dodatno objasnio da je IL-17A promovira migraciju stanica u liječenju ogrebotine rana test. Stoga, pro-metastaze učinak IL-17A na GC može biti kroz reguliranje MMP /TIMP ravnotežu. Pregled

NF-kB je prijavljen kao nizvodni cilj IL-17A signalnog puta u mnogim stanicama [17] [20], [21], koji je u stanju da regulira MMP-2 i MMP-9 izraza [14], [17]. I IL-17A također opisano da se poveća ekspresiju MMP putem aktivacije NF-kB put u mnogim stanicama [14], [17]. Tako da smo ispitivali su da li doreguliranje MMP-2 i MMP-9 inducirane IL-17A kroz aktivaciju NF-kB put. Rezultati su pokazali IL-17A promovira nuklearne translokacije na p65 i p50 podjedinice GC stanicama i zatim povišeni ekspresiju MMP-2 i MMP-9. Ovaj se učinak može se učinkovito blokira NF-kB inhibitora, što sugerira da je aktivacija NF-kB je potencijal mehanizam u povećanju ekspresije MMP-2 i MMP-9 pomoću IL-17A. Pregled

U zaključku, naši nalazi sugeriraju da IL-17A bio u mogućnosti promovirati migraciju i invazivnost GC stanicama aktivacijom NF-kB puteve, koji su nakon toga povišeni izraza MMP-2 i MMP-9 i na taj način utjecati migraciju i invazivnost GC stanicama. Daljnja karakterizacija učinak IL-17A na GC invaziju i metastaziranje može dovesti do identifikacije novih dijagnostičkih biljega i terapijskih ciljeva.

popratne podatke Slika S1. pregled Učinak IL-17A na proliferaciju BGC-823, SGC-7901 i AGS stanice pregled doi. 10,1371 /journal.pone.0096678.s001 pregled (TIF)
Slika S2. pregled, IL-17A promiče izraze MMP-2 i MMP-9 i potiskuje iskaza TIMP-1 i TIMP-2 u SGC-7901 stanica. (A) Izrazi MMP u SGC-7901 stanice su uspoređene pomoću Western blot pokusa između stanice tretirane sa i bez IL-17A (50 ng /ml) kroz 24 h. (B) Kvantifikacija razina proteina u MMP-2 i MMP-9. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD za tri nezavisna eksperimenta provedenih po tri puta. *. p pregled < 0,05, u usporedbi s kontrolnom skupinom pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002 pregled (TIF) pregled Slika S3. pregled, IL-17A aktivira NF-kB u BGC-823 stanicama. (A) Western blot analiza je korištena za detekciju ukupni p50, p65, str52, c-rel i RelB ekspresije u BGC-823 stanicama koje su tretirane s IL-17A (50 ng /ml) na naznačenim vremenskim točkama. (B) Kvantifikacija razina proteina ukupnog p50, p65, str52, C-rel i RelB. (C) Western blot analiza je korištena za detekciju nuklearne p50, p65, str52, c-rel i RelB ekspresije u BGC-823 stanicama koje su tretirane s IL-17A (50 ng /ml) na naznačenim vremenskim točkama. (D) Kvantifikacija razina proteina nuklearne P50, P65, str52, C-rel i RelB. (E) relativni omjer nuklearnog ukupnom udjelu P50, P65, str52, C-rel i RelB. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD za tri nezavisna eksperimenta provedenih po tri puta. *. p pregled < 0,05, u usporedbi s kontrolnom skupinom pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003 pregled (TIF) pregled Slika S4.
Učinci helenalin i IL-17A na invaziju stanica i izrazima MMP-2 i MMP-9 u BGC-823 stanicama. (A) 1 x 10 6 BGC-823 stanice se predtretira s helenalin (5 uM), te potom inkubiraju u prisutnosti ili odsutnosti IL-17A (50 ng /ml) tijekom 24 h. Stanični invazivnosti je mjerena pomoću testa Transwell® invazije. (B) Stopa invazija posto je izražena kao postotak kontrole. (C, D) Razine proteina MMP-2 i MMP-9 su detektirani Western blot pokusa, kada BGC-823 stanice su bile tretirane s helenalin i /ili IL-17A. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD za tri nezavisna eksperimenta provedenih po tri puta. * p pregled < 0,05, u usporedbi s kontrolnom skupinom pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004 pregled (TIF) pregled

• PLoS ONE: promijenjena ekspresija hipoksijom faktora induciranog-1 a (HIF-1 a) i regulatornih gena u rak želuca tkiva
• PLoS ONE: cirkulirajućih stanica tumora (CTCs) Otkrivena pomoću RT-PCR i njegova prognostička uloga u rak želuca: meta-analiza objavljenih književnost