PLoS ONE: interleukine 17A Bevordert maagkanker Invasiviteit via NF-KB Mediated Matrix metalloproteïnasen 2 en 9 Expression

Samenvatting

17A Interleukine (IL-17A), een pro-inflammatoir cytokine, betrokken bij pathologie van ontstekingsziekten en tumor micro-omgeving. Het doel van deze studie is het effect van IL-17A op de invasiviteit van maagkanker (GC) onderzocht. In de studie vonden we dat IL-17A de migratie en invasie van GC spiercel. Verder werden na behandeling met IL-17A, uitdrukkingen en activiteiten van matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) en MMP-9 werden opgereguleerd, terwijl de uitingen van TIMP-1 en TIMP-2 werd neerwaarts gereguleerd. Bovendien waren de kern /totale fracties van p65 en p50 dramatisch verhoogd door IL-17A. Voorbehandeling met helenalin een kernfactor-KB (NF-KB) remmer, werd bleek het bevorderende effect van IL-17A op de invasie vermogen van GC cellen en opregulatie van MMP-2 en MMP-9 schaffen. Concluderend onze bevindingen blijkt dat IL-17A de invasie van GC spiercel door het activeren van NF-KB-route, en vervolgens de expressie van MMP-2 en MMP-9 opwaarts reguleren. Deze resultaten kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe diagnostische merkers en therapeutische doelwitten van GC

Visum:. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) interleukine 17A Bevordert maagkanker Invasiviteit via NF -κB Mediated Matrix metalloproteïnasen 2 en 9 Expression. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10.1371 /journal.pone.0096678

Editor: Nikos K. KARAMANOS, Universiteit van Patras, Griekenland

Ontvangen: 26 november 2013; Aanvaard: 11 april 2014; Gepubliceerd: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Het project werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81070536) en Jeugd Wetenschappelijke fondsen van het centrale ziekenhuis van Taian (2011ZRQNO35). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Als een van de top oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, GC is verantwoordelijk voor meer dan 700.000 doden per jaar [1]. Het is de tweede meest voorkomende kanker en de derde belangrijke doodsoorzaak bij kankerpatiënten in China [2]. De krachtige invasie en metastase vermogen van GC is een van de belangrijke factoren die leiden tot slechte prognose [3]. Daarom is het belangrijk om de onderliggende mechanismen bloot te leggen, om nieuwe moleculaire therapeutische doelwitten die invasie mogelijkheden van GC cel reguleren identificeren en dus voor de ontwikkeling bevorderen van behandelingen voor GC.

IL-17A is het stichtend lid van de IL -17 familie die varieert van IL-17A aan IL-17F [4] - [8]. IL-17 familie spelen een actieve rol in verschillende ziekten zoals auto-immuunziekten, ontstekingsziekten en maligne aandoeningen. Persistente ontsteking wordt geacht te zijn gecorreleerd met een verhoogd risico van GC [9]. Eerste stappen in maagkanker betrekken Helicobacter pylori
(H. pylori) infectie leiden tot chronische actieve en atrofische gastritis met productie van proinflammatoire mediatoren [10] - [13], zoals IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 en IL-8. De rol van IL-17A in kanker was inconsistent volgens eerdere rapporten. Enig bewijs blijkt dat IL-17A tumorgroei kunnen bevorderen door het stimuleren van angiogenese en het invasieve vermogen van tumorcellen [14]. Daarentegen andere studies suggereerden dat IL-17A toonde een beschermend effect tegen chronische lymfocytische leukemie ontwikkeling door bevordering immuunsysteem gemedieerde tumor afstoting [15]. Bovendien IL-17A versterkte de cytotoxische effecten van NK cellen tegen tumorcellen door het verhogen van de expressie van cytotoxische moleculen [16]. Tot nu toe is er minder rapport over de rol van IL-17A in de invasie van GC.

In de onderhavige studie hebben we gevonden dat IL-17A GC celmotiliteit kunnen toenemen met opwaarts reguleren van MMP-2 en MMP -9 via het activeren van NF-KB transcript factoren.

Materialen en methoden

Cell Culture

Human GC cellijn AGS werd gekocht bij ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) en aangehouden in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l penicilline en 100 mg /l streptomycine. Menselijke GC cellijnen BGC-823 en SGC-7901 werden verkregen van Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China) en gekweekt in RPMI-1640 medium dat 10% runderserum, penicilline (100 U /ml) en streptomycine (100 ug /mL). Alle cellen werden gekweekt bij 37 ° C, 5% CO _{2 atmosfeer.}

Wondgenezing Assay

GC-cellen werden gekweekt als monolagen confluent in een 6-wells plaat en gewonden door het verwijderen van een 1 mm strook over het goed met een pipet tip toen ze gehandeld op grond van de plaat oppervlak. De gewonden monolagen werden vervolgens tweemaal met PBS gewassen om niet-hechtende cellen te verwijderen voordat 1 ml medium met of zonder IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) werden toegevoegd. Na 12 uur incubatie werden verschillende concentratie groepen gefotografeerd door omgekeerde microfoto.

In vitro
Invasion Assay

De In vitro
invasie assay werd uitgevoerd met behulp van Bio-Coat Matrigel invasie assay systeem (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) zoals eerder beschreven [17]. Na behandeld met of zonder IL-17A (50 ng /ml) werden GC cellen uitgezet in 200 ul serumvrij medium en in de bovenkamers van 2 x 10 ^{5 cellen en normale groeimedium geplaatst onder kamers . Vierentwintig uur later werden de cellen op het bovenste oppervlak van het membraan verwijderd met katoenen wattenstaafjes, terwijl cellen aan de onderzijde van het filter werd gefixeerd en gekleurd en gemeten. Het percentage invasieve percentage werd uitgedrukt als een percentage van de controle.}

Western vlekanalyse

Hele cellysaten van GC cellen werden geoogst met cellysis buffer. Nucleaire lysaten van gekweekte cellen werden geoogst met NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Western blotting analyses werden uitgevoerd volgens het standaardprotocol met behulp van antilichamen tegen MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 en β-actine (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-KB p50, p65 /RelA, c-Rel, RelB en histon H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

zymografie

De cellen werden behandeld met verschillende concentraties IL-17A bij 37 ° C gedurende 24 uur, en monsters van geconditioneerde medium verzameld. Voldoende hoeveelheden van de monsters (aangepast via vitale aantal cellen) werden gescheiden met 0,1% gelatine-8% SDS-PAGE elektroforese. Na elektroforese werden de gels tweemaal gewassen in 2,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en vervolgens geïncubeerd in reactiebuffer (10 mM CaCl _{2, 40 mM Tris-HCl en 0,01% NaN 3, pH 8,0) bij 37 ° C gedurende 12 uur. Coomassie brilliant blue R-250 gel vlek werd vervolgens gebruikt om de gel te kleuren. De intensiteiten van banden op de gelen werden berekend onder gebruikmaking van een beeldanalysesysteem (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Statistische analyse

Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelden ± SD. De statistische analyse werd uitgevoerd met het SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) statistische verschillen te evalueren. Student's t
-test werd gebruikt voor vergelijkingen tussen twee groepen en one-way of twee-weg variantie-analyse werd gebruikt om statistische verschillen tussen de groepen onder verschillende omstandigheden te analyseren. A p
waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Alle statistische tests waren met twee kanten.

Resultaten

IL-17A Verhoogt celmotiliteit in GC Cells

A-scratch wond test werd uitgevoerd om het effect van IL-17A te bepalen over de migratie in AGS, BGC-823, en SGC-7901-cellen. De uitbreiding van de celmigratie werd gekwantificeerd door het schatten van het percentage van herkolonisatie van het wondoppervlak na 24 uur. In de controlegroep, de beweging is niet duidelijk. In aanwezigheid van IL-17A, werd deze beweging significant gestimuleerd na 12 uur incubatie (figuur 1A). Kwantificering analyse gaf aan dat het verschil was significant (figuur 1B). Bovendien, de invasie assay toonde dat het invasieve vermogen van IL-17A behandelde cellen significant sterker dan controle ouderlijke cellen in alle drie geteste cellijnen (Figuur 1C en 1D). Deze gegevens toonden aan dat IL-17A GC celmigratie en invasiviteit zou kunnen vergroten. Verder hebben we waargenomen dat IL-17A heeft geen significant effect op de proliferatie van BGC-823, SGC-7901 en AGS cellen (figuur S1), wat suggereert dat het bevorderende effect van IL-17A migratie en invasiviteit niet worden gestoord door cel proliferatie.

Effect van IL-17A op opregulatie van MMP-2 en MMP-9 en negatieve regulatie van TIMP-1 en TIMP-2 in Cells GC

Omdat overexpressie van MMPs kan kanker metastase bevorderen [18], [19] vervolgens onderzochten we het effect van IL-17A op MMP expressie in GC cellijnen. Zoals getoond in Figuur 2 en Figuur S2 zijn de uitingen van MMP-2 en MMP-9 vergeleken met behulp van Western blotting tussen IL-17A behandelde en onbehandelde cellen. Het resultaat toonde dat MMP-2 en MMP-9 werden opgereguleerd in IL-17A behandelde cellen (AGS en BGC-823) (figuur 2A en 2B). Tegelijkertijd de termen van TIMP-1 en TIMP-2 werd downgereguleerd (figuur 2A en 2B). Gelatine zymografie werd uitgevoerd om de activiteit van MMP-2 en MMP-9 beoordelen GC cellen behandeld met of zonder IL-17A. De resultaten toonden aan dat IL-17A verhoogde de activiteit van MMP-2 en MMP-9 in GC cellen (AGS en BGC-823) (figuur 2C en 2D). Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen bij SGC-7901-cellen (Figuur S2). Deze resultaten suggereerden dat de pro-metastase effect van IL-17A van GC kan zijn via regulering MMP /TIMP balans en bracht ons ertoe het werkingsmechanisme verder te onderzoeken.

IL-17A reguleert MMP-2 en MMP 9 Uitdrukkingen activeren via NF-KB weg

NF-KB is gerapporteerd als een stroomafwaarts doelwit van IL-17A signaling pathway in vele cellen [17], [20], [21], dat in staat is het opwaarts reguleren MMP-2 en MMP-9 uitdrukkingen [14], [17]. En IL-17A werd ook gerapporteerd dat de expressie van MMP's te vergroten door het activeren van NF-kB route in vele cellen [14], [17]. Daarom we vervolgens nagegaan of IL-17A opgereguleerd MMP-2 en MMP-9 uitdrukkingen GC cellen door activering van NF-KB. Zoals getoond in figuur 3, werden de expressie en translocatie van NF-KB subeenheden in kern geanalyseerd door Western blotting. We observeerden dat het niveau van p65 en p50 in kernen dramatisch is verhoogd in AGS cellen na IL-17A behandeling, terwijl het niveau van totale p65 en p50 heeft geen verandering (figuur 3A-D). Bovendien werd het nucleaire /totale fractie van deze moleculen verhoogd na IL-17A behandeling (figuur 3E). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in BGC-823 cellijn (Figuur S3A-E), wat aangeeft dat IL-17A geactiveerde NF-KB in GC cellijnen.

Wanneer verder helenalin (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), een NF-KB-remmer, werd AGS of BGC-823 cellen toegevoegd medium voor IL-17A behandeling, de expressie van MMP-2 en MMP-9 werd significant verlaagd (Figuur 4C-D, figuur S4C-D). Het resultaat toonde aan dat IL-17A geïnduceerde MMP-2 en MMP-9 expressie in GC cel via NF-KB activering. Dienovereenkomstig zou IL-17A geïnduceerde GC cel invasiviteit ook geblokkeerd door helenalin In vitro
(Figuur 4A-B, Figuur S4A-B). Vandaar dat deze bevindingen suggereren dat IL-17A activeert NF-kB route vervolgens de expressie van MMP's en dit gevolgen heeft migratie en invasiviteit van cellen GC

Discussie

GC. Is een van de meest dodelijke kwaadaardige ziekten in de wereld vanwege de hoge recidiefpercentage na curatieve therapieën [3], [22]. GC is nauw gecorreleerd met chronische ontstekingsziekten, waarbij veel inflammatoire cytokines infiltreren. IL-17A is een van de belangrijke inflammatoire cytokines in de ontwikkeling van vele ontstekingsziekten en wordt ook vaak aangetroffen in tumor micro [23] - [26]. Eerdere studie suggereerde dat de expressieniveaus van IL-17 in de tumor een onafhankelijke prognostische indicator adenocarcinoom patiënten [27] kan zijn. Vergelijking van overleving tussen patiënten met hoge en lage niveaus van IL-17 bleek dat patiënten met hoge niveaus van IL-17 hadden een 5-jaars overleving van 47% vergeleken met 84% bij patiënten met lage niveaus [28]. De moleculaire mechanismen voor dergelijke correlatie, die kunnen bijdragen ons meer inzicht in de rol van IL-17 in de ontwikkeling en groei van GC, moeten nog worden opgehelderd.

In de onderhavige studie hebben we gevonden dat IL- 17A bevorderde de invasie van GC cellen. Metastase is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte onder GC patiënten. Afbraak van de ECM van bloed of lymfevaten is essentieel voor metastase, omdat verlies van de ECM maakt kankercellen aan het bloed of lymfestelsel binnendringen en zich verspreiden naar andere weefsels en organen [29]. MMP's, met name MMP-2 en MMP-9, zijn verantwoordelijk voor het afbreken van de ECM [19], [29]. IL-17A is vermeld dat de invasie van kankercellen bevorderen via opwaarts reguleren van de expressie van MMP-2 en MMP-9 [17], [26]. Algemeen wordt aangenomen dat MMP activiteiten worden geremd door TIMP uitgebreide ECM afbraak [29] te voorkomen. Om het mechanisme van werking van IL-17A verduidelijken we onderzocht of het bevorderende effect van IL-17A op invasie is door regulatie van de uitingen van MMP-2, MMP-9, TIMP-1 en TIMP-2. Onze resultaten toonden aan dat IL-17A verhoogde de expressies en activiteiten van MMP-2 en MMP-9 en downgereguleerd uitingen van TIMP-1 en TIMP-2, die verder uit dat de IL-17A bevorderd celmigratie in de scratch wondgenezing assay. Daarom kan de pro-metastase effect van IL-17A van GC zijn via regulering MMP /TIMP balans.

NF-KB is gerapporteerd als een stroomafwaarts doelwit van IL-17A signaling pathway in vele cellen [17] , [20], [21], die in staat is het opwaarts reguleren MMP-2 en MMP-9 uitdrukkingen [14], [17]. En IL-17A werd ook gerapporteerd dat de expressie van MMP's te vergroten door het activeren van NF-kB route in vele cellen [14], [17]. Daarom onderzochten we of de opregulatie van MMP-2 en MMP-9 geïnduceerd door IL-17A is door middel van het activeren van NF-KB route. De resultaten toonden IL-17A bevorderd nucleaire translocatie van de p65 en p50 subeenheden van GC cellen opgereguleerd en vervolgens de expressie van MMP-2 en MMP-9. Dit effect kan effectief worden geblokkeerd door NF-KB-remmer, wat suggereert dat de activering van NF-KB is het potentieel mechanisme voor MMP-2 en MMP-9 opwaarts reguleren door IL-17A.

Samenvattend zijn onze bevindingen suggereerden dat IL-17A kon de migratie en invasiviteit van GC cellen te bevorderen door het activeren van NF-kB route, die vervolgens uitingen van MMP-2 en MMP-9 opgereguleerd en afbreuk migratie en invasiviteit van cellen GC. Verdere karakterisering van het effect van IL-17A op GC invasie en metastase kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe diagnostische merkers en therapeutische doelwitten.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Het effect van IL-17A op de proliferatie van BGC-823, SGC-7901 en AGS cellen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s001
(TIF)
Figuur S2.
IL-17A bevordert uitingen van MMP-2 en MMP-9 en onderdrukt de uitingen van TIMP-1 en TIMP-2 in SGC-7901 cellen. (A) Uitingen van MMPs in SGC-7901 cellen werden vergeleken door western blotting tussen cellen behandeld met en zonder IL-17A (50 ng /ml) gedurende 24 uur. (B) Kwantificering van de eiwit niveaus van MMP-2 en MMP-9. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten in triplo uitgevoerd. . * p Restaurant < 0,05, in vergelijking met de controlegroep
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF)
Figuur S3.
IL-17A activeert NF-KB in BGC-823 cellen. (A) Western blot analyse werd gebruikt om het totale p50, p65, p52, c-Rel en RelB expressie detecteren BGC 823-cellen behandeld met IL-17A (50 ng /ml) op aangegeven tijdstippen. (B) Kwantificering van het eiwit niveaus van de totale p50, p65, p52, c-Rel en RelB. (C) Western blot analyse werd gebruikt om nucleaire p50, p65, p52, c-Rel en RelB expressie detecteren BGC 823-cellen behandeld met IL-17A (50 ng /ml) op aangegeven tijdstippen. (D) Het kwantificeren van het eiwit niveau van nucleaire p50, p65, p52, c-Rel en RelB. (E) De relatieve verhouding van kernenergie aan de totale fractie van p50, p65, p52, c-Rel en RelB. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten in triplo uitgevoerd. . * p Restaurant < 0,05, in vergelijking met de controlegroep
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
figuur S4.
Effecten van helenalin en IL-17A op celinvasie en uitingen van MMP-2 en MMP-9 in BGC-823 cellen. (A) 1 x 10 6 BGC-823 cellen werden voorbehandeld met helenalin (5 uM) en vervolgens geïncubeerd in aanwezigheid of afwezigheid van IL-17A (50 ng /ml) gedurende 24 uur. Cellulaire invasiviteit werd gemeten met de transwell invasie assay. (B) Het percentage invasie percentage werd uitgedrukt als een percentage van de controle. (C, D) Het proteïne niveaus van MMP-2 en MMP-9 werden gedetecteerd door western blotting, als BGC-823 cellen werden behandeld met helenalin en /of IL-17A. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten in triplo uitgevoerd. * p Restaurant < 0,05, in vergelijking met de controlegroep
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF)

• PLoS: veranderde expressie van hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α) en de regulerende genen bij maagkanker Tissues
• PLoS ONE: circulerende tumorcellen (CTC's) gedetecteerd door RT-PCR en de prognostische rol bij maagkanker: een meta-analyse van gepubliceerde Literature