PLoS ONE: Interleukin 17A Fremmer Gastric Cancer Invasivitet via NF-kB mediert matriksmetalloproteinaser 2 og 9 Expression

Abstract

Interleukin 17A (IL-17A), som en pro-inflammatorisk cytokin, er involvert i patologi av inflammatoriske sykdommer og svulstens mikromiljø. Målet med denne studien er å undersøke effekten av IL-17A på invasivitet av magekreft (GC). I studien fant vi at IL-17A kan fremme migrasjon og invasjon av GC-celler. Videre, etter behandling med IL-17A, uttrykkene og aktivitetene av matriks-metalloproteinase-2 (MMP-2) og MMP-9 ble oppregulert, mens uttrykket av TIMP-1 og TIMP-2 ble nedregulert. Videre atom /samlede fraksjoner av p65 og p50 ble dramatisk forhøyet ved IL-17A. Forbehandling med helenalin, en nukleær faktor-kB (NF-kB) inhibitor, ble vist seg å avskaffe den fremmende virkning av IL-17A på invasjonen evnen til GC-celler og oppregulering av MMP-2 og MMP-9. Som konklusjon, våre funn viste at IL-17A kunne fremme invasjonen av GC-celler ved å aktivere NF-kB vei, og deretter oppregulering av ekspresjon av MMP-2 og MMP-9. Disse resultatene kan føre til identifisering av nye diagnostiske markører og terapeutiske mål av GC

Citation. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) Interleukin 17A Fremmer Gastric Cancer Invasivitet via NF -κB mediert matriksmetalloproteinaser 2 og 9 uttrykk. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678

Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas

mottatt: 26 november 2013; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 06.06.2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Prosjektet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr 81070536) og Ungdoms Vitenskapelige fond i sentral~~POS=TRUNC i Tai (2011ZRQNO35). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Som en av de beste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, er GC ansvarlig for over 700 000 dødsfall per år [1]. Det er den nest vanligste kreftformen og den tredje største dødsårsaken blant kreftpasienter i Kina [2]. Den potente invasjon og metastasering evne til GC er en av de viktige faktorene som fører til dårlig prognose [3]. Derfor er det viktig å avdekke den underliggende mekanismer for å identifisere nye molekylære terapeutiske mål som regulerer invasjons evnene til GC celle, og således for å utvikle behandlinger for å fremme GC.

IL-17A er den grunnleggende medlem av IL -17 familie som strekker seg fra IL-17A til IL-17F [4] - [8]. IL-17 familiemedlemmer spille en aktiv rolle i ulike sykdommer som autoimmune sykdommer, inflammatoriske sykdommer, og ondartede sykdommer. Vedvarende betennelse har vært ansett å være korrelert med økt risiko for GC [9]. Tidlige fremgangsmåten i magekreft involvere Helicobacter pylori
(H. pylori) infeksjon som fører til kronisk aktiv og atrofisk gastritt med produksjon av proinflammatoriske mediatorer [10] - [13], slik som IL-1 b, TNFa, IFNy, IL-6 og IL-8. Imidlertid er rollen til IL-17A i kreft var inkonsekvent i henhold til tidligere rapporter. Noen bevis avslørte at IL-17A kan fremme tumorvekst ved å stimulere angiogenese og invasiv kapasitet av tumorceller [14]. I kontrast til andre studier antydet at IL-17A viser en beskyttende effekt mot kronisk lymfatisk leukemi utvikling ved å fremme immunsystem-mediert avvisning tumor [15]. Videre er IL-17A forsterket den cytotoksiske effekten av NK-celler mot tumorceller ved å øke ekspresjonen av cytotoksiske molekyler [16]. Opp til nå, er det mindre rapport om rollen til IL-17A i invasjonen av GC.

I denne studien fant vi at IL-17A kan øke GC cellemotilitet ved oppregulering MMP-2 og MMP -9 via aktivering av NF-kB transkripsjonsfaktorer.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig GC cellelinje AGS ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l penicillin og 100 mg /l streptomycin. Menneske GC cellelinjer BGC-823 og SGC-7901 ble hentet fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrket i RPMI-1640 medium som inneholder 10% bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mikrogram /ml). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO _{2 luft atmosfære.}

sårtilheling analysen

GC-celler ble dyrket som konfluent monolag i en seks-brønns plate og ble såret ved å fjerne en 1 mm strimmel på tvers av brønnen med en pipettespiss når de festes til plateoverflaten. De sårede monolag ble så vasket to ganger med PBS for å fjerne ikke-adherente celler før 1 ml medium med eller uten IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) ble tilsatt. Etter 12 timer inkubasjon ble ulike konsentrasjons grupper fotografert av inverterte mikrografer.

In vitro
Invasion analysen

in vitro
invasjonen analysen ble utført ved hjelp av Bio-Coat Matrigel invasjon analysesystem (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) som beskrevet tidligere [17]. Etter behandling med eller uten IL-17A (50 ng /ml), ble GC-celler sådd ut i 200 ul serumfritt medium og plassert i de øvre kamrene i 2 x 10 ^{5-celler og normale vekstmedium ble plassert i under kammere . Tjuefire timer senere ble cellene på den øvre overflaten av membranen fjernes med bomullspinner, mens cellene på undersiden av filteret ble fiksert, farget og målt. Prosentandelen av invasive hastigheten ble uttrykt som prosent av kontroll.}

Western blotting-analyse

helcellelysater fra GC-celler ble høstet med cellelyseringsbuffer. Atomlysatene fra dyrkede celler ble høstet med NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Western blotting analyser ble utført med standard protokollen ved hjelp av antistoffer mot MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, P52 og β-aktin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-kB-p50, p65 /rela, c-Rel, relB, og Histone H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California).

Zymografi

Celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av IL-17A ved 37 ° C i 24 timer, og prøver av kondisjonert medium ble oppsamlet. Passende volumer av prøvene (justert med vital celle nummer) ble separert ved 0,1% gelatin-8% SDS-PAGE-elektroforese. Etter elektroforese, ble gelene vasket to ganger i 2,5% Triton X-100 ved romtemperatur i 30 minutter og deretter inkubert i reaksjonsbuffer (10 mM CaCl _{2, 40 mM Tris-HCl og 0,01% NaN 3, pH 8,0) ved 37 ° C i 12 timer. Coomassie brilliant blue R-250 gel flekk ble deretter brukt til å sette flekker på gelen. De intensiteter av band i gels ble beregnet ved hjelp av et bilde analysesystem (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California).}

Statistical Analysis

Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Den statistiske analysen ble utført ved anvendelse av SPSS 16,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) for å evaluere statistiske forskjeller. Elevens t
-test ble brukt for sammenligninger mellom to grupper og enveis eller toveis variansanalyse ble brukt til å analysere statistiske forskjeller mellom gruppene under forskjellige forhold. En p
verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Alle statistiske tester var tosidig.

Resultater

IL-17A Øker cellemotilitet i GC Cells

En ripe-sår analysen ble utført for å bestemme effekten av IL-17A på migrasjon i AGS, BGC-823, og SGC-7901 celler. Utvidelsen av cellemigrering ble kvantifisert ved å beregne prosentandelen av kolonisering av såret overflaten etter 24 timer. I kontrollgruppen, bevegelsen var ikke innlysende. I nærvær av IL-17A, ble denne bevegelse betydelig fremmet etter 12 timers inkubasjon (figur 1A). Kvantifisering analyse indikerte at forskjellen var signifikant (figur 1B). Videre invasjonen analysen viste at det invasive evnen til IL-17A behandlede celler var betydelig sterkere enn kontroll parentale celler i alle de tre testede cellelinjer (figur 1C og 1D). Disse dataene viste at IL-17A kan forbedre GC celle migrasjon og invasivitet. Videre observerte vi også at IL-17A har ingen signifikant effekt på spredning av BGC-823, SGC-7901 og AGS celler (Figur S1), noe som tyder på at den fremmende effekt av IL-17A på migrasjon og invasivitet ikke blir forstyrret av cellen spredning.

Effekt av IL-17A på oppregulering av MMP-2 og MMP-9 og nedregulering av TIMP-1 og TIMP-2 i GC Cells

Siden overekspresjon av MMP kan fremme kreft metastase [18], [19], vi neste undersøkte effekten av IL-17A på MMP ekspresjon i GC-cellelinjer. Som vist i figur 2 og figur S2, ble uttrykk for MMP-2 og MMP-9 i forhold ved hjelp av Western blotting mellom IL-17A behandlede og ubehandlede celler. Resultatet viste at MMP-2 og MMP-9 ble oppregulert i IL-17A behandlede celler (AGS og BGC-823) (figur 2A og 2B). På samme tid ble de uttrykk for TIMP-1 og TIMP-2 nedregulert (figur 2A og 2B). Gelatin zymografi ble også utført for å vurdere aktiviteten av MMP-2 og MMP-9 i GC-celler behandlet med eller uten IL-17A. Resultatene viste at IL-17A forsterket aktiviteten av MMP-2 og MMP-9 i GC-celler (AGS og BGC-823) (figur 2C og 2D). Lignende resultater har blitt observert i SGC-7901 celler (Figur S2). Disse resultatene antydet at pro-metastase effekten av IL-17A på GC kan være gjennom å regulere MMP /TIMP balanse og bedt oss om å utforske videre virkningsmekanismen.

IL-17A oppregulerer MMP-2 og MMP- 9 Expressions via Aktivere NF-kB pathway

NF-kB er rapportert som et nedstrøms mål for IL-17A signalveien i mange celler [17], [20], [21], som er i stand til å oppregulere MMP-2 og MMP-9 uttrykkene [14], [17]. Og IL-17A ble også rapportert å øke ekspresjonen av MMP'er via aktivering av NF-kB banen i mange celler [14], [17]. Derfor vi neste sjekket om IL-17A oppregulert MMP-2 og MMP-9 uttrykk i GC cellene gjennom aktivering av NF-kB. Som vist i figur 3, ble ekspresjon og translokasjon av NF-kB-subenhetene i kjernen analysert ved Western blotting. Vi har observert at nivået av p65 og p50 i kjerner ble dramatisk forhøyet i AGS celler etter IL-17A behandling, mens nivået på p65 og p50 har ingen endring (Figur 3A-D). I tillegg ble det nukleære /samlede andel av disse molekyler økt på IL-17A behandling (figur 3E). Lignende resultater ble observert i BGC-823-cellelinjen (figur S3A-E), noe som indikerer at IL-17A aktivert NF-kB i GC-cellelinjer.

Videre, når helenalin (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), et NF-kB-inhibitor, ble tilsatt til AGS eller BGC-823 celler medium før IL-17A behandling, uttrykket nivåer av MMP-2 og MMP-9 ble signifikant redusert (figur 4C-D, figur S4C-D). Resultatet viste at IL-17A-indusert MMP-2 og MMP-9-ekspresjon i GC cellen via NF-kB-aktivering. Følgelig kunne IL-17A indusert GC celle invasivitet også blitt blokkert av helenalin in vitro plakater (Figur 4A-B, Figur S4A-B). Derfor er disse funnene tyder på at IL-17A aktiverer NF-kB vei, deretter regulerer ekspresjonen av MMP'er, og derved påvirker migrering og invasivitet av GC-celler.

diskusjon

GC er en av de de fleste fatale ondartede sykdommer i verden på grunn av sin høye tilbakefall etter kurativ behandling [3], [22]. GC er nært korrelert med kroniske betennelsessykdommer, hvor mange av inflammatoriske cytokiner infiltrere. IL-17A er en av de viktige inflammatoriske cytokiner i utviklingen av mange inflammatoriske sykdommer, og er også ofte detektert i svulstens mikro [23] - [26]. Forrige studien antydet at uttrykket nivåer av IL-17 i svulsten kan være en uavhengig prognostisk indikator i adenokarsinom i ventrikkelen [27]. Sammenligning av overlevelse mellom pasienter med høye og lave nivåer av IL-17 fant at pasienter med høye nivåer av IL-17 hadde en 5-års overlevelse på 47% sammenlignet med 84% hos pasienter med lave nivåer [28]. Men de molekylære mekanismene for slik sammenheng, som kan hjelpe oss å bedre forstå rollen som IL-17 i utviklingen og fremdriften av GC, er fortsatt ikke klarlagt.

I denne studien fant vi at IL- 17A fremmet invasjonen av GC-celler. Metastase er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall blant GC pasienter. Nedbrytning av ECM av blod eller lymfekar er kritisk for metastasering, fordi tap av ECM tillater kreftceller å invadere blod eller lymfesystemet og spre seg til andre vev og organer [29]. MMP, særlig MMP-2 og MMP-9, er ansvarlig for nedbrytning av ECM [19], [29]. IL-17A har blitt rapportert å fremme invasjon av kreftceller via oppregulering av ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 [17], [26]. Det er generelt akseptert at MMP-aktivitet inhiberes av TIMPs for å forhindre omfattende ECM degradering [29]. For å klargjøre virkningsmekanismen av IL-17A, undersøkte vi hvorvidt den fremmende virkning av IL-17A på celle invasjon er gjennom regulering av de uttrykk for MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2. Våre resultater viste at IL-17A forhøyet uttrykk og aktivitetene av MMP-2 og MMP-9, og downregulated uttrykk for TIMP-1 og TIMP-2, noe som ytterligere forklart at IL-17A promotert celle migrasjon i bunnen av sårheling analyse. Derfor kan det hende at pro-metastase effekten av IL-17A på GC være gjennom å regulere MMP /TIMP balanse.

NF-kB er rapportert som et nedstrøms mål for IL-17A signalveien i mange celler [17] , [20], [21], som er i stand til å oppregulere MMP-2 og MMP-9 uttrykkene [14], [17]. Og IL-17A ble også rapportert å øke ekspresjonen av MMP'er via aktivering av NF-kB banen i mange celler [14], [17]. Så vi undersøkt hvorvidt den oppregulering av MMP-2 og MMP-9 indusert ved hjelp av IL-17A er gjennom aktivering av NF-kB pathway. Resultatene viste IL-17A fremmet nukleær translokasjon av P65 og P50 subenheter med GC-celler og deretter oppregulert ekspresjon av MMP-2 og MMP-9. Denne effekten kan være effektivt blokkert av NF-kB-inhibitor, hvilket antyder at aktiveringen av NF-kB er en mulig mekanisme for å oppregulere MMP-2 og MMP-9 med IL-17A.

Som konklusjon, våre funn antydet at IL-17A var i stand til å fremme migrering og invasivitet av GC-celler ved å aktivere NF-kB vei, som senere oppregulert uttrykk for MMP-2 og MMP-9 og derved påvirkes migrering og invasivitet av GC-celler. Ytterligere karakterisering av effekten av IL-17A på GC invasjon og metastasering kan føre til identifisering av nye diagnostiske markører og terapeutiske mål.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekten av IL-17A på spredning av BGC-823, SGC-7901 og AGS celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
IL-17A fremmer uttrykk for MMP-2 og MMP-9 og undertrykker uttrykk for TIMP-1 og TIMP-2 i SGC-7901 celler. (A) Uttrykk for MMP'er i SGC-7901-celler ble sammenlignet ved western-blotting mellom celler behandlet med og uten IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. (B) Kvantifisering av protein nivåene av MMP-2 og MMP-9. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. . * p
< 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
IL-17A aktiverer NF-kB i BGC-823 celler. (A) Western blot-analyse ble brukt for å påvise generelle p50, p65, P52, c-Rel og relB-ekspresjon i BGC-823-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angitte tidspunkter. (B) Kvantifisering av proteinnivåer generelle p50, p65, P52, c-Rel og relB. (C) Western blot-analyse ble brukt for å detektere kjerne p50, p65, P52, c-Rel og relB-ekspresjon i BGC-823-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angitte tidspunkter. (D) Kvantifisering av protein nivåer av atom p50, p65, P52, c-Rel og relB. (E) Den relative forholdet mellom atom til total fraksjon av p50, p65, P52, c-Rel og relB. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. . * p
< 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Effekter av helenalin og IL-17A på celle invasjon og uttrykk for MMP-2 og MMP-9 i BGC-823 celler. (A) 1 x 10 6 BGC-823-celler ble forbehandlet med helenalin (5 uM) og deretter inkubert i nærvær eller fravær av IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. Cellulær invasivitet ble målt ved anvendelse av transwell invasjon analysen. (B) Den prosentvise invasjonen hastigheten ble uttrykt som prosent av kontroll. (C, D) Protein nivåene av MMP-2 og MMP-9 ble påvist ved western blotting, når BGC-823-celler ble behandlet med helenalin og /eller IL-17A. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. * p
< 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004 plakater (TIF)

• PLoS ONE: Altered Expression of Hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) og Regulatory Gener i Gastric Cancer Tissues
• PLoS ONE: Sirkulasjonstumorceller (CTCs) oppdaget av RT-PCR og dens prognostisk rolle i Gastric Cancer: A Meta-Analysis of Publisert Literature