Ploche ONE: interleukín 17A podporuje rakovina žalúdka invazivitě prostredníctvom NF-kB sprostredkovanej Matrix metaloproteinázy 2 a 9 Expression

Abstraktné

Interleukín 17A (IL-17A), ako pre-zápalový cytokín, sa podieľa na patológii zápalových ochorení a mikroprostredie nádoru. Cieľom tejto štúdie je skúmať účinok IL-17A na invazivitě rakoviny žalúdka (GC). V tejto štúdii sme zistili, že IL-17A by mohol podporovať migráciu a inváziu buniek GC. Okrem toho, po spracuje s IL-17A, výrazy a aktivity matrix metaloproteinázy 2 (MMP-2) a MMP-9 bola up-regulované, zatiaľ čo výrazy TIMP-1 a TIMP-2 boli downregulated. Okrem toho jadrové /celkovej frakcie P65 a p50 boli výrazne zvýšené IL-17A. Predliečení helenalin, nukleárna inhibítora faktora-kB (NF-kB), bolo preukázané, zrušiť podporujúci účinok IL-17A na invázne schopnosti GC buniek a up-reguláciu MMP-2 a MMP-9. Záverom možno povedať, naše výsledky ukázali, že IL-17A by mohol podporiť inváziu GC buniek aktiváciou NF-kB dráhu a následne upregulating expresiu MMP-2 a MMP-9. Tieto výsledky môžu viesť k identifikácii nových diagnostických markerov a terapeutických cieľov GC

Citácia :. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) interleukín 17A podporuje rakovina žalúdka invazivitě cez NF -κB sprostredkované Matrix metaloproteinázy 2 a 9 výraz. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678

Editor: Nikos K. Karamanos, University of Patras, Grécko

prijatá: 26.novembra 2013; Prijaté: 11.04.2014; Uverejnené: 06.06.2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Projekt bola podporovaná národná prírodná Science Foundation Číny (No. 81070536) a mládež vedeckých fondov Ústredná nemocnice v Taian (2011ZRQNO35). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

ako jeden z najväčších príčin úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete, GC je zodpovedný za viac ako 700.000 úmrtí ročne [1]. Ide o druhú najčastejšou rakovinou a treťou najčastejšou príčinou úmrtia pacientov s nádorovým ochorením v Číne [2]. Silná invázie a metastázy schopnosť GC je jedným z dôležitých faktorov, ktoré vedú k zlej prognóze [3]. Preto je dôležité odhaliť základné mechanizmy, identifikovať nové molekulárnej terapeutických cieľov, ktoré regulujú inváziu schopnosti GC bunky, a tým aj k rozvoju postupujúcej liečby GC.

IL-17A je zakladajúcim členom IL -17 rodina, ktorá sa pohybuje v rozmedzí od IL-17A k IL-17F [4] - [8]. IL-17 členov rodiny zohrávajú aktívnu úlohu v rôznych ochorení, ako je autoimunitné ochorenie, zápalové ochorenia a nádorových ochorení. Pretrvávajúce zápal bola považovaná za koreluje so zvýšeným rizikom GC [9]. Čoskoro kroky žalúdočné karcinogenéze zahŕňať Helicobacter pylori
(H. pylori), čo vedie k chronickej aktívnej a atrofickú gastritídu s výrobou mediátorov [10] - [13], ako je napríklad IL-1b, TNFa, IFNy, IL-6 a IL-8. Avšak úloha IL-17A rakoviny bolo v rozpore podľa predchádzajúcich správ. Niektoré dôkazy bolo zistené, že IL-17A môže podporovať rast nádorov tým, že stimuluje angiogenézu a invazívne schopnosť nádorových buniek [14]. Na rozdiel od toho ďalšie štúdie ukázali, že IL-17A ukázali ochranný účinok proti vývoji chronickej lymfocytárnej leukémie tým, že podporuje imunitnú reakciu nádoru systém sprostredkovaný [15]. Okrem toho, IL-17A zvyšuje cytotoxické účinky NK buniek proti nádorové bunky tým, rozširovať expresiu cytotoxických molekúl [16]. Až do súčasnosti, je tu menší správa o úlohe IL-17A v invázii do GC.

V tejto štúdii sme zistili, že IL-17A by mohla zvýšiť GC pohyblivosť buniek podľa upregulating MMP-2 a MMP -9 cez aktiváciu NF-kB transkriptov faktory.

materiály a metódy

Cell Culture

Ľudská bunková línia GC AGS bol získaný od ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) a udržiavané v DMEM doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 u /l penicilínu a 100 mg /l streptomycínu. GC bunkové línie ľudských BGC-823 a SGC-7901 boli získané z Čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína), a kultivované v médiu RPMI-1640 s obsahom 10% hovädzieho séra, penicilínom (100 U /ml) a streptomycínom (100 ug /ml). Všetky bunky boli kultivované pri 37 ° C, 5% CO _{2 atmosfére vzduchu.}

hojenie rán Assay

GC bunky boli pestované ako monovrstvy v konfluentní 6-jamkové doštičky a bolo zranených odstránením 1 mm opasok cez jamky sa špičkou pipety, keď priliehajú k povrchu dosky. Zraneným monovrstvy boli potom premyté dvakrát PBS na odstránenie non-adherentních buniek do 1 ml média s alebo bez IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) bol pridaný. Po 12 hodinách inkubácie rôzne koncentrácie skupiny boli vyfotografovaná prevrátenými micrographs.

In vitro
Invasion Test

in vitro
invázie test bol vykonaný s použitím bio-Coat Matrigel invázie testovací systém (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), ako bolo opísané skôr [17]. Po spracuje s alebo bez IL-17A (50 ng /ml), GC bunky boli nasadené na 200 ul bezsérového média a umiestnené do horných komôr 2 x 10 ^{5 buniek a normálne rastové médium sa umiestni do spodných komôr , Dvadsaťštyri hodín neskôr sa bunky na hornej strane membrány sa odstránia pomocou vatovej tyčinky, zatiaľ čo bunky na spodnej strane filtra boli fixované, zafarbené a merané. Percento invazívnej miery bola vyjadrená ako percentá kontroly.}

Western Blotting Analýza

lyzáty celých buniek z GC buniek boli zbierané s mobilným lyzačného pufra. Nukleárna lyzáty z kultivovaných buniek boli zbierané s NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu. Western blot analýzy boli vykonané podľa štandardného postupu za použitia protilátok proti MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 a β-aktínu (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-kB-p50, P65 /relay, c-Rel, eľba, a Histon H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

zymografií

Bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami IL-17A pri teplote 37 ° C po dobu 24 hodín, a vzorky upraveného média boli zhromaždené. Vhodné objemy vzoriek (očistené vitálnym počtu buniek) boli oddelené od 0,1% želatíny, 8% SDS-PAGE elektroforézy. Po elektroforéze boli gély premyté dvakrát v 2,5% Triton X-100 pri izbovej teplote po dobu 30 minút a potom inkubované v reakčnom pufri (10 mM CaCl _{2, 40 mM Tris-HCl a 0,01% NaN 3, pH 8,0) pri teplote 37 ° C počas 12 hodín. Coomassie brilantná modrá gél škvrna R-250 bol potom použitý na farbenie gélu. Intenzity pruhy v géle boli vypočítané pomocou systému pre analýzu obrazu (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Štatistická analýza

Všetky dáta bola vyjadrená ako priemer ± SD. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softwaru SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) pre vyhodnotenie štatistické rozdiely. Študenta t
-test bol použitý pre porovnanie medzi dvoma skupinami a jednosmerné alebo obojsmerné analýzy variance bol použitý na analýzu štatistické rozdiely medzi skupinami v rôznych podmienkach. A p
hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Všetky štatistické testy boli obojstranné.

Výsledky

IL-17A zvyšuje pohyblivosť buniek v GC buniek

sa testu poškriabaniu vinutím, ktorá má určiť účinok IL-17A na migráciu v AGS, BGC-823 a SGC-7901 buniek. Rozšírenie migrácia buniek bola kvantifikovaná na základe odhadu percenta rekolonizaci z povrchu rany po 24 hodinách. V kontrolnej skupine, hnutie nebolo zrejmé. V prítomnosti IL-17A, tento pohyb bol významne podporený po 12 hodinách inkubácie (obrázok 1A). Analýza ukázala, že kvantitatívne rozdiel bol významný (obrázok 1B). Okrem toho, test invázie ukázala, že invazívne schopnosť IL-17A ošetrených buniek bola podstatne silnejšia, než riadiť rodičovských buniek vo všetkých troch testovaných bunkových línií (obr 1C a 1D). Tieto údaje ukázali, že IL-17A by mohla zlepšiť migráciu a invasiveness GC buniek. Ďalej sme tiež zistené, že IL-17A nemá žiadny významný vplyv na proliferáciu BGC-823, SGC-7901 a AGS buniek (obr S1), čo naznačuje, že pomoc účinok IL-17A o migrácii a invazívnosti nie je rušené bunkou proliferácia.

Vplyv IL-17A na upregulace MMP-2 a MMP-9 a zníženie expresie TIMP-1 a TIMP-2, GC buniek

Vzhľadom na to, že nadmerná expresia MMP môže podporovať nádorových metastáz [18], [19], Ďalej sme skúmali účinok IL-17A na expresiu MMP v bunkových líniách GC. Ako je znázornené na obrázkoch 2 a S2, výrazy MMP-2 a MMP-9 boli porovnané s použitím Western blotting medzi IL-17A ošetrených a neošetrených buniek. Výsledok ukázal, že MMP-2 a MMP-9 bola up-regulované v ošetrených buniek (AGS a BGC-823), IL-17A (obrázok 2A a 2B). V rovnakej dobe, výrazy TIMP-1 a TIMP-2 boli downregulated (obrázok 2A a 2B). Želatína zymografie bolo tiež vykonané pre hodnotenie aktivity MMP-2 a MMP-9 v GC buniek ošetrených s alebo bez IL-17A. Výsledky ukázali, že IL-17A zvýšenú aktivitu MMP-2 a MMP-9 v GC buniek (AGS a BGC-823) (Obrázok 2C a 2D). Podobné výsledky boli pozorované u SGC-7901 buniek (obr S2). Tieto výsledky naznačujú, že pre-metastázy účinok IL-17A na GC môže byť cez regulačný MMP /TIMP rovnováhu a vyzvaní, aby sme ďalej preskúmať jeho mechanizmus účinku.

IL-17A zvyšuje aktiváciu MMP-2 a MMP 9 Výrazy cez Aktivácia NF-kB Pathway

NF-kB bola označená ako downstream cieľa z IL-17A signálne dráhy v mnohých bunkách [17], [20], [21], ktorý je schopný upregulate MMP-2 a MMP-9 výrazy [14], [17]. A IL-17A tiež zaznamenané zvýšenie expresie MMP cez aktiváciu NF-kB dráhu v mnohých bunkách [14], [17]. Preto ďalšie kontroluje, či IL-17A up-regulované MMP-2 a MMP-9 výrazy v GC buniek prostredníctvom aktivácie NF-kB. Ako je znázornené na obrázku 3, expresie a translokácia NF-kB v jadre podjednotiek boli analyzované metódou Western blot. Pozorovali sme, že hladina P65 a p50 v jadrách bola dramaticky zvýšená u AGS bunkách po ošetrení IL-17A, zatiaľ čo úroveň celkovej P65 a p50 nemá žiadnu zmenu (Obrázok 3A-D). Okrem toho, nukleárna /celkový podiel týchto molekúl bola zvýšená na liečbu IL-17A (obr 3E). Podobné výsledky boli pozorované v BGC-823 bunkové línie (obr S3A-E), čo ukazuje, že IL-17A aktiváciu NF-kB v bunkových líniách GC.

Okrem toho, keď helenalin (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), inhibítor NF-kB, bol pridaný k AGS alebo BGC-823 buniek médium pred liečbou IL-17A, hladiny expresie MMP-2 a MMP-9 sa významne znížili (obr 4C-D, obr S4C-D). Výsledkom preukázané, že IL-17A indukované MMP-2 a MMP-9 expresiu v bunke GC cez aktiváciu NF-kB. V súlade s tým, IL-17A indukovanej GC bunkovej invázie by tiež mohla byť blokované helenalin in vitro
(obrázok 4A-B, obr S4A-B). Preto, tieto nálezy naznačujú, že IL-17A aktivuje NF-kB dráhu a následne reguluje expresiu MMP, a tým ovplyvňuje migráciu a invazivitu GC buniek.

Diskusia

GC je jedným z väčšina smrteľných nádorových ochorení na svete, pretože jeho vysokej miere recidívy po liečebných terapií [3], [22]. GC je v úzkej korelácii s chronických zápalových ochorení, v ktorých mnoho zápalových cytokínov preniknúť. IL-17A je jedným z dôležitých zápalových cytokínov v rozvoji mnohých zápalových ochorení, a je tiež často zistená v mikroprostredie nádoru [23] - [26]. Predchádzajúce štúdie naznačujú, že hladiny expresie IL-17 v nádoru môže byť nezávislým prognostickým indikátorom v adenokarcinóme žalúdka u pacientov [27]. Porovnanie prežívanie pacientov s vysokými a nízkymi hladinami IL-17 zistili, že pacienti s vysokými hladinami IL-17 bola miera prežitia 5 rokov o 47% v porovnaní s 84% ​​u pacientov s nízkymi hladinami [28]. Avšak molekulárne mechanizmy pre takúto koreláciu, ktoré nám môžu pomôcť lepšie pochopiť úlohu IL-17 vo vývoji a pokroku GC, je potrebné ešte objasniť.

V tejto štúdii sme zistili, že IL 17A podporoval inváziu GC buniek. Metastáza je jednou z hlavných príčin úmrtí na nádorové ochorenia u pacientov, ktorí GC. Degradácii ECM krvných alebo lymfatických ciev je rozhodujúci pre metastáz, pretože strata ECM umožňuje rakovinové bunky napadnúť krv alebo lymfatický systém a šíriť do ďalších tkanív a orgánov [29]. MMP, najmä MMP-2 a MMP-9, sú zodpovedné za degradáciu ECM [19], [29]. IL-17A bola označená na podporu inváziu nádorových buniek pomocou upregulating expresiu MMP-2 a MMP-9 [17], [26]. Je všeobecne známe, že MMP aktivity sú inhibované TIMP, aby sa zabránilo rozsiahle degradácii ECM [29]. Objasniť mechanizmus pôsobenia IL-17A, sme skúmali, či je pomoc účinok IL-17A na invázie buniek je prostredníctvom regulácie z prejavov MMP-2, MMP-9, TIMP-1 a TIMP-2. Naše výsledky ukazujú, že IL-17A zvýšenej výrazy a aktivity MMP-2 a MMP-9 a downregulated výrazy TIMP-1 a TIMP-2, ktorý je ďalej vysvetlené, že IL-17A podporoval migráciu buniek v poškriabaniu hojenie rany test. Z tohto dôvodu sa pre-metastázy účinok IL-17A na GC môže byť cez regulačný MMP /TIMP rovnováhy.

NF-kB bola označená ako downstream cieľa z IL-17A signálne dráhy v mnohých bunkách [17] , [20], [21], ktorý je schopný upregulate MMP-2 a MMP-9 výrazy [14], [17]. A IL-17A tiež zaznamenané zvýšenie expresie MMP cez aktiváciu NF-kB dráhu v mnohých bunkách [14], [17]. Takže sme skúmali, či je zvýšenie expresie MMP-2 a MMP-9 vyvolané IL-17A je cez aktiváciu NF-kB dráhu. Výsledky ukázali, IL-17A podporoval nukleárnej translokácii z P65 a p50 podjednotiek GC buniek a následne up-regulovaná expresia MMP-2 a MMP-9. Tento účinok by mohol byť účinne blokovaná inhibítorom NF-kB, čo naznačuje, že aktivácia NF-kB je potenciálny mechanizmus pre upregulate MMP-2 a MMP-9 IL-17A.

Na záver, navrhol naše zistenia že IL-17A bol schopný podporovať migráciu a invazivitu GC buniek aktiváciou NF-kB dráhu, ktorá následne up-regulovaná výrazy MMP-2 a MMP-9 a tým ovplyvnený migrácie a invazivitu GC buniek. Ďalšie charakterizácie účinku IL-17A na GC invázie a metastázy môže viesť k identifikácii nových diagnostických markerov a terapeutických cieľov.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Účinok IL-17A na proliferáciu BGC-823, SGC-7901 a AGS bunky
DOI: 10,1371. /journal.pone.0096678.s001
(TIF)
Obrázok S2.
IL-17A podporuje vyjadrenia MMP-2 a MMP-9 a potláča prejavy TIMP-1 a TIMP-2 v SGC-7901 buniek. (A) Výrazy MMP v SGC-7901 bunky boli porovnané pomocou western blotting medzi buniek ošetrených s alebo bez IL-17A (50 ng /ml) po dobu 24 hodín. (B) Kvantifikácia proteínových hladín MMP-2 a MMP-9. Hodnoty predstavujú prostriedky ± SD z troch nezávislých experimentov vykonávaných v triplikátech. . * p
menšie ako 0,05, v porovnaní s kontrolnou skupinou
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF)
obr S3.
IL-17A aktivuje NF-kB v BGC-823 buniek. (A), Western blot analýza bola použitá na detekciu celkovej p50, P65, p52, c-Rel a výraz eľba v BGC-823 buniek ošetrených IL-17A (50 ng /ml) v uvedených časových bodoch. (B) Kvantifikácia hladín proteínových celkovej p50, P65, p52, c-Rel a eľba. (C) Western blot analýza bola použitá na detekciu jadrového p50, P65, p52, c-Rel a eľba výraz v BGC-823 buniek ošetrených IL-17A (50 ng /ml) v uvedených časových bodoch. (D) Kvantifikácia hladín proteínových jadrovej P50, P65, P52, c-Rel a eľba. (E) Relatívny podiel jadrovej energie na celkovej zlomok P50, P65, P52, c-Rel a eľba. Hodnoty predstavujú prostriedky ± SD z troch nezávislých experimentov vykonávaných v triplikátech. . * p
menšie ako 0,05, v porovnaní s kontrolnou skupinou
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
obr S4.
Účinky helenalin a IL-17A na bunkovej invázie a prejavov MMP-2 a MMP-9 v BGC-823 buniek. (A) 1 x 10 6 BGC-823 bunky boli vopred ošetrené helenalin (5 uM) a potom inkubované v prítomnosti alebo neprítomnosti IL-17A (50 ng /ml) po dobu 24 hodín. Bunková invázia bola meraná s použitím testu Transwell invázie. (B) Percento rýchlosť Invázia bola vyjadrená ako percento kontroly. (C, D) Úrovne proteínové MMP-2 a MMP-9 boli detekované pomocou Western blotting, kedy sa BGC-823 buniek ošetrených helenalin a /alebo IL-17A. Hodnoty predstavujú prostriedky ± SD z troch nezávislých experimentov vykonávaných v triplikátech. *
p < 0,05, v porovnaní s kontrolnou skupinou
doi :. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF)

• Ploche ONE: pozmenenej expresie hypoxiou indukovateľných faktora-1α (HIF-1α) a jeho regulačných génov v karcinómu žalúdka Tissues
• PLoS ONE: cirkulujúce nádorové bunky (CTCs) detekované pomocou RT-PCR a jej prognostický úloha v rakoviny žalúdka: Meta-Analysis of Uverejnené Literature