PLoS ONE: Casticin potencira TRAIL apoptozi želudac stanica raka kroz endoplazmatska mrežica Stress

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Casticin je jedan od glavnih aktivnih sastojaka dobivenih iz fructus Viticis
te je izvijestio da izvrši protiv kancerogenog djelovanja na različitim stanicama raka, ali točan mehanizam u pozadini ove aktivnosti ostaje nejasno. pregled

Materijali i metode

Apoptotic aktivnosti casticin (1.0 umol /l) i TRAIL (25, 50 ng /ml), sam ili u kombinaciji u želučanom staničnim linijama raka BGC-823, SGC-7901 i MGC-803 bile su određene korištenjem stanične apoptoze ELISA detekcije kit, protočna citometrija ( FCM) s propidij jodida (PI) bojanjem i djelovanja kaspaze-3, -8 i -9 ELISA i odcjepljenjem polyADP-riboza polimeraza (PARP) proteina pomoću western blot analize. Smrt receptori (DR) razine ekspresije su procijenjene pomoću FCM analizu i Western blot. 2 ', 7'-diklorfluorescein-diacetat (DCFH-DA) korištena je kao sonda za mjerenje povećanje reaktivnih kisikovih razine (ROS) u stanicama. Više intervencije, kao što siRNA transfekciju i farmakoloških inhibitori su korišteni za istraživanje mehanizama tih radnji. Pregled

Rezultati

Subtoxic koncentracije casticin značajno pojačati citotoksičnost TRAIL-inducirana i apoptozu u BGC-823, SGC-7901 i MGC-803 stanica. Casticin dramatično regulira prema gore ekspresiju DR5 receptora, ali nije imao učinak na DR4 ili mamac receptora. Brisanje DR5 po siRNA značajno smanjio apoptozu potaknutu od strane ko-primjena staza i casticin. Utišavanje gena od CCAAT /pojačivač vezanja proteina homologne proteina (CHOP) i prethodne obrade sa salubrinal, An endoplazmatska mrežica (ER) inhibitor stres, prigušuje ekspresiju casticin izazvanu DR5 receptom, i apoptozu i ROS proizvodnju. Casticin regulirani razine ekspresije proteina preživljavanja stanica cFLIP, Bcl-2, XIAP i survivina. Osim toga, casticin također izazvanu iskaza DR5 proteina u drugim želučanih stanica raka (SGC-7901 i MGC-803). Pregled

Zaključak /Značaj pregled

Casticin poboljšava TRAIL-inducirana apoptoza kroz silazni proteina preživljavanja stanica i u povećanju DR5 receptora kroz djelovanje na ROS-ER stres-CHOP putu pregled

Izvor:. Zhou Y, Tian L, Long L, Quan M, Liu F, Cao J (2013) Casticin potencira TRAIL apoptozi želudac stanica raka kroz endoplazmatska mrežica stresa. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10,1371 /journal.pone.0058855 pregled

Urednik: Kaustubh Datta, Sveučilište Nebraska Medical Center, Sjedinjenih Američkih Država Netlogu

Primljeno: 11 lipnja 2012; Prihvaćeno: 8 veljače 2013; Objavljeno: 11. ožujak 2013 pregled

Copyright: © 2013 Zhou i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Projekta NSFC (broj 30760248), Projekt za znanstvena istraživanja provinciji Hunan uprava zavod za tradicionalne kineske medicine (broj 2010081), Projekt za znanstvena istraživanja Hunan Province, Odjel za obrazovanje (broj 10C0975), Major Projekt predmeta znanstvenog istraživanja provinciji Hunan Odjela za obrazovanje (broj 09A054) i projekta za znanstvena istraživanja Changsha Gradskog zavoda za znanost i tehnologiju (broj K1104060-31). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

fructus Viticis
( Manjingzi pregled je kineski naziv) odnosno plod Vitex trifolia L.
(obitelj Verbenaceae pregled) to je tradicionalne kineske medicine koristi kao protuupalno sredstvo. Casticin je jedan od aktivnih sastojaka koji su izvedeni iz fructus Viticis
[1]. Mnoge studije pokazale su da casticin pokazuje anti-kancerogeno djelovanje u dojkama [2], cerviksa [3], prostate [4], pluća i debelog crijeva [5], [6], kao i karcinoma želuca [7] in vitro pregled. Također je izvijestio da casticin inhibira rast stanica leukemije ljudskih mijcloičnc [8] i uzrokuje smrt stanice leukemije koje induciranje ili apoptoze ili diobenog katastrofu [9]. Pregled

Nedavno prethodni rad od našem laboratoriju pokazuju da je učinak na casticin apoptozu ljudskih stanica hepatocelularnog karcinoma je uključen u DR5 put koji je neovisan o statusu p53 [10]. Zabilježeno je da se CCAAT /pojačivač vezujući protein homologan protein (CHOP) također poznat kao zaustavljanje rasta i gen oštećenja DNA 153 (GADD153) izravno regulira ekspresiju DR5 putem veznog mjesta CHOP u 5-bočnoj regiji gena DR5 s [11], [12]. Mi i ostali, su izvijestili da neki lijekovi, kao što je 5, 7-dimetil-dimethoxyflavone i celekoksib, induciraju ekspresiju DR5 kroz CHOP ovisna transaktivaciju DR5 gena [13] - [15]. Osim toga, nekoliko je studija pokazalo blizak odnos između endoplazmatska mrežica (ER) stresa i DR5 izražavanja. ER stres induciran kada nepotpuno svijeni glikoproteini nakupljaju se u ER lumen [16]. Čini se da je ovaj odgovor može aktivirati određene apoptoze kako bi se uklonili teško oštećene stanice, u kojima protein folding nedostaci se ne mogu riješiti [17], [18]. Različiti ER stres induktori poput MG132 [12], tunikamicin [19] i thapsigargin [20], dosljedno su pokazali da induciraju ekspresiju DR5 na staničnim površinama. Iako su molekularni mehanizmi za DR5 proteinsku ekspresiju pomoću ER stresa induktora može se razlikovati s podražajima i tipova stanica, ER stres-inducirana faktor transkripcije, nasjeckajte, pod uvjetom vezu između ER stresa i DR5. Međutim, da li casticin inducira ekspresiju DR5 u želučanim stanicama raka, a ako je tako, priroda, molekularni mehanizam uključen je nepoznat. Pregled

Nedavna studija je pokazala da učinkovito faktor tumorske nekroze-α vezane apoptoza inducira ligand ( TRAIL) -based kombinatorno liječenje može se postići preko nadreguliranja DR4 i DR5 izražavanje i ciljanje izravno s tumorskim stanicama mitohondrija poticanje apoptoze njihove inducira svojstva [21]. Sposobnost mitohondrijima da posreduje apoptoza čvrsto regulirana od strane članova Bcl-2 superfamilije [22]. Suzbijanju anti-apoptotički ekspresije proteina sa suprotne RNA ili siRNA, pokazalo se da senzibilizacija stanica karcinoma TRAIL [23]. Kao rezultat, sredstva koja potiskuju takvih anti-apoptotičkim proteinima kao survivin, stanični FADD-poput interleukin-1β konvertirajućeg inhibicije enzima protein (cFLIP), Bcl-2, i X-vezani inhibitor apoptoze proteina (XIAP) može potencijalno osjetljivim raka stanice za efekte apoptoze od TRAIL [23], [24]. pregled

u ovom istraživanju, dakle, usredotočili smo se na istraživanje da li casticin potencira TRAIL-inducirana stanica raka apoptozu, a ako je tako, kako casticin potencira to posljedica. Ustanovili smo da su casticin potencira TRAIL inducirane apoptoze regulirajući DR5 kroz ROS-ER stresa CHOP puta i snižavanje ekspresiju proteina preživljavanja stanica Bcl-2, XIAP, cFLIP i survivina želuca stanice raka. pregled

Rezultati pregled

Subtoxic koncentracije casticin selektivno povećava citotoksičnost TRAIL inducirana u želučanim stanicama raka pregled

citotoksičnost casticin i TRAIL, sam ili u kombinaciji, je ispitan u humanim linije raka želuca BGC- 823, SGC-7901 i MGC-803, kao što je određena MTT pokusom. Casticin i TRAIL samog uzrokovalo citotoksičnost želučanih stanica raka, na način ovisan o koncentraciji (Slike 1A i B). Blagi citotoksičnost (< 20%) primijećeno je pri nižim koncentracijama casticin (1,0 umol /l, slika 1A). Liječenje želučanih stanica raka kod 25-50 ng /ml TRAIL 24 sata induciranih ograničene citotoksičnosti (< 20%). Međutim, ko-liječenje želučanih stanica raka s casticin (1,0 umol /l) i trag (25 ng /ml ili 50 ng /ml) značajno povećava citotoksičnih efekata u usporedbi s tretmanom casticin ili TRAIL samog (Slika 1C).

obzirom da smo otkrili da je kombinirani tretman s casticin i TRAIL snažno inducirana citotoksičnost u stanicama karcinoma želuca, što sljedeći ispitali učinak tretmana na besmrtne humane sluznice stanična linija epitelnih stanica želučane GES-1. Zanimljivo, kombinacija casticin i TRAIL ne induciraju citotoksičnost u GES-1 stanice (Slika 1D) dužnici Rezultati pokazuju da subtoxic koncentracije casticin selektivno senzibilizirani ljudskih stanica raka želuca na stazi induciranoj citotoksičnost. Pregled

koncentracije Subtoxic od casticin senzibilizirati želučane stanice raka za TRAIL-inducirana apoptoza Netlogu

da bi istražili da li apoptoza je uključen u inhibiciju rasta stanica sljedeće zajedničko liječenje s casticin i TRAIL, prvo smo ispitali apoptoze koristeći analiza protočnom citometrijom detektirati povećanje hipodiploidnih stanici populacije. Rezultati su pokazali da je stopa apoptoza je 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% i 37,1 ± 4,9% (srednja vrijednost ± SD, N pregled = 3) za casticin (1 umol /l), TRAIL (50 ng /ml) i casticin plus TRAIL, odnosno (slika 2A). Pod-G1 populacija BGC-823 stanica bila je značajno povišena u 12 sati, i izdužen 24 sata nakon prethodne obrade sa 1 umol /l casticin te 50 ng /ml TRAIL (Slika 2B). Potom smo utvrdili razinu histona /fragment DNA od želučanih staničnim linijama karcinoma BGC-823, SGC-7901 i MGC-803 koji koriste stanične apoptoze ELISA za otkrivanje kit. Slika 2C pokazuje da kombinirano liječenje casticin i TRAIL sinergijski izazvana fragmentaciju histona /DNA. Razine histona /DNA fragment BGC-823 povišene nakon 12 sata i 24 sata nakon izdužen zajedničko liječenje s casticin (1 umol /l) i trag (50 ng /ml, Slika 2D). Pregled

sljedeći ispituje da li kaspaza zapravo aktivirana tijekom indukcije apoptičkoj smrti stanice kombiniranim tretmanom s casticin i staze u stanicama raka želuca. Liječenje gastic stanica karcinoma s 1 umol /L casticin samo 24 sata ne inducira nikakvo djelovanje kaspaze-3, -8 i -9. Kao odgovor na trag (50 ng /ml), aktivnosti kaspaze-3, -8 i -9 nisu mijenjali. Međutim, kombinirani tretman casticin i TRAIL inducira aktivaciju kaspaze-3 i -8 i lagano aktivirane kaspaze-9 (Slika 2 E, F i G). Pregled

također ispituje koja kaspaze je posebno aktiviran u odgovor na casticin i TRAIL liječenja pomoću inhibitora kaspaze, uključujući i inhibitora pan-kaspaze zVAD-FMK, kaspaze-3 inhibitora zDEVD-FMK, kaspaze-8 inhibitora zIETD-FMK i kaspaza-9 inhibitora zLEHD-FMK. Kao što je prikazano na Slici 2E, zVAD-FMK, zDEVD-FMK i zIETD-FMK značajno je smanjio razine aktivnosti kaspaze-3 inducirane kombiniranog liječenja casticin i TRAIL, ali zLEHD-FMK je lagani učinak. zVAD-FMK i zIETD-FMK mogu istovremeno potpuno blokiranje aktivacije kaspaze-8, a zDEVD-FMK djelomično blokiran aktivaciju kaspaze-8; Međutim, zLEHD-FMK je malo utjecati na aktivaciju stanje kaspaze-8 (Slika 2F). Sukladno tome, otkrili smo da kaspaza-9 lagano se aktivira u stanicama tretiranim casticin i TRAIL, ali ne u stanicama tretiranim casticin i staza u prisutnosti z-IETD-FMK, zVAD-FMK i zLEHD-FMK (Slika 2G). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da casticin dodatkom TRAIL inducira aktivaciju kaspaze-8 ispred kaspaze-9 aktivacije [10]. Pregled

Konačno istraživali da li bi povećalo casticin TRAIL induciranu cijepanja PARP i otkrili da casticin poboljšana TRAIL-inducirana povećanje cijepanja PARP u BGC-823 i SGC-7901 stanica (Slika 2 H). Ovi rezultati ukazuju da je jako subtoxic koncentracija casticin poboljšava TRAIL-inducirana apoptoza želučanih stanica raka. Pregled

Casticin inducira ekspresiju DR5 u želučanim stanicama raka pregled

Apoptoza hepatocelularnih stanicama karcinoma induciranih casticin bio uključen u DR5 ranijim koracima [10]. Stoga, pomiješa se BGC-823 stanica sa casticin 24 sata, a zatim se koristi Western blot analizom ispitati stanice za ekspresiju TRAIL receptora. Casticin povećana DR5 ekspresiju na način koji je ovisan o koncentraciji, ali nije imalo učinka na ekspresiju DR4 niti DcR1 ili DcR2 indukcije (slika 3A). Indukcija DR5 izražavanja casticin se dogodila u 6 sati, a nalazio se na 24 sata (Slika 3b). Ovi rezultati ukazuju na to da DR5 regulaciju je mehanizam kandidat kroz koji casticin pojačava efekte apoptoze od staza u BGC-823 stanicama. Pregled

Kako bi se utvrdilo je li DR na površini stanice je bio uključen u indukciju apoptoze casticin, površini stanice ekspresija DR5 i DR4 opaženo je upotrebom tekućom citometrijom. Nakon izlaganja stanica prema casticin (1,0 umol /l), razina DR5 na staničnoj površini povećala (Slika 3C). Međutim, casticin nije utjecala na razinu DR4 izražavanja (slika 3D). Zajedno, ti rezultati pokazuju da casticin regulira povišenje ekspresije DR5 na staničnoj površini. Pregled

Bilo Doreguliranje DR5 po casticin specifičan za BGC-823 stanicama, ili također i u drugim staničnim linijama raka želuca, također je istražen. Casticin inducirana ekspresija DR5 u raka želuca SGC-7901 i MGC-803 staničnih linija, ali nije imao očite posljedice na njegovu ekspresiju u imortalizaciji želučane sluznice GES-1 stanične linije (Slika 3e). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da je uzlazni DR5 strane casticin nije specifičan za određeni tip želučane stanice raka. Pregled

DR5 indukcija po casticin je potreban za poboljšanje TRAIL-inducirana apoptoza u BGC-823 stanicama

da bi se odredilo ulogu DR5 receptora u unaprjeđenju TRAIL-inducirana apoptoza strane casticin, koristili smo siRNA specifične za DR5 da potiskuju svoj izraz. Transformacija stanice s siRNA za DR5, ali ne i sa kontrolnim siRNA smanjen casticin induciranu DR5 izraz. Pregled

Kako bi ispitati da li DR5 regulaciju uključuje casticin-poboljšane TRAIL-inducirana želuca staničnoj apoptozi, analizu na protočnom citometru je korišten ispitati da li potiskivanje DR5 ekspresiju siRNA mogu smanjiti učinak casticin na stazi inducirana apoptoza. Slika 4B pokazuje da je učinak na casticin TRAIL apoptozi se učinkovito smanjena u stanicama koje su transfektirane s DR5 siRNA, dok stanice transficirane s kontrolnim siRNA nisu promijenjene. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da indukcija DR5 je kritičan za senzibilizaciju tumorskih stanica na učinke casticin na TRAIL apoptozi. Pregled

Casticin izazvanu DR5 regulaciju posredovana indukcija CHOP u BGC-823 stanicama pregled

CHOP posredovano je pokazano doreguliranje DR5 [11] - [15]; dakle, pored istražio kako ovaj faktor transkripcije mogli biti uključeni u casticin izazvanog DR5 regulacije. Slika 5A pokazuje da casticin inducirana CHOP izraz, koji se dogodio usporedno s porastom DR5 izražavanja. Pregled

Kako bi se ispitala uloga CHOP u casticin izazvanu pojačanja djelovanja DR, bio je korišten za utišavanje gena od CHOP po siRNA. TRANSFICIRANJE s CHOP siRNA značajno je smanjen casticin induciranoj DR5 regulaciju na gore (slika 5B), dok casticin regulira prema gore ekspresiju DR5 u non-transfektirane i kontrole transfektirane (izokrenut RNA) stanice. Pregled

Sljedeći koristi Analiza protočnom citometrijom s ispitati da li potiskivanje CHOP po siRNA prigušuje osjetljivost kože učinke casticin na stazi inducirana apoptoza. TRANSFICIRANJE s CHOP siRNA značajno smanjena efekti (od 37,1 ± 5,3% na 13,5 ± 1,3%, srednja vrijednost ± SD, N pregled = 3) na casticin plus TRAIL-inducirana apoptoza (Slika 5c), dok je tretman s kontrolom siRNA nije imala učinka (Slika 5C). Ovi rezultati pokazuju da CHOP je uključen u DR5 ranijim koracima i doprinosi senzibiliziranja učinka casticin na stazi apoptozi u našem eksperimentalnom modelu. Pregled

Casticin inducirana endoplazmatska mrežica (ER) Stres u želučanim stanicama raka pregled

poznato je da ER inducira marker-proteina ER stres (kao što Grp78 i fosfo-eIF2α), koji regulira povišenje ekspresiju CHOP [12], [19], [20]. U ovom istraživanju, učinak casticin na ekspresiju ER stresom marker-proteina je ispitan. Naši rezultati pokazuju da casticin zaista izazivaju sve ove markere ER stresa u BGC-823 stanicama (Slika 6a). Da bi se odredilo da li ER stres uključen u potenciranju casticin na apoptozu koja je izazvana TRAIL, salubrinal, inhibitora ER stresa je korišten. Salubrinal (50 umol /l) značajno zaštićena BGC-823 stanice od apoptoze izazvane ko-primjenu casticin i TRAIL (Slika 6B). Pregled

također ispitati da li liječenje BGC-823 stanica s endoplazmatski retikulum (ER) stres induktor, tunikamicin [25], može podići DR5 razina proteina i povećati TRAIL-umiranju stanica procesom apoptoze. Otkrili smo da tunikamicin (3,0 umol /L) vremenski ovisno povećana razina proteina u DR5 p-eIF2α, Grp78 i usitniti, u BGC-823 stanicama (Slika 6c). Cotreatment s tunikamicin (3,0 umol /L) i trag (50 ng /ml) značajno povećava postotak stanica u sub-G1 fazu, u usporedbi s tunikamicin ili TRAIL samog (Slika 6D). Ovi rezultati podupiru hipotezu da ER stres sudjeluje u pojačavanja učinka casticin na apoptoze potaknute trag. Pregled

Casticin izazvanog DR5 regulaciju i apoptoze potenciranje su ROS-ovisni u BGC-823 stanicama

nedavno smo pokazali da je 5, 7-dimethoxyflavone selektivno povećava TRAIL-inducirana apoptoza by ROS stimulirana ER-stres pokreće CHOP-posredovane DR5 povećanje ekspresije u hepatocelularnih stanicama karcinoma [15]. tako smo istraživali da li casticin potiče ROS proizvodnju. 2 '7'-diklorfluorescein-diacetat (DFCH-DA) korištena kao sonda za mjerenje bilo povećanje razine ROS u stanicama. Eksperimenti Vremenski tijek pokazala je da su nivoi ROS su početno povećana na

1 h, dosegla maksimum na 3 sata, te je trajao do 24 sata nakon tretmana s 1,0 umola /l casticin (Slika 7A). Casticin izazvana ROS proizvodnje u koncentracijskom ovisan način (slika 7b). Pregled

Kako dešifrirati odnos između ROS generacije i DR5 indukcije CHOP-ovisna, ispitivano je da li ROS regulira casticin-inducirane Trail receptore i usitniti u prisustvu i odsutnost N pregled -acetylcysteine ​​(NAC), što je sredstvo za uklanjanje slobodnih kisikovih radikala. Našli smo da prethodna obrada stanica s NAC smanjio casticin induciranu doreguliranje DR5 i CHOP ekspresije (slika 7c). pregled

Nadalje, istraživali smo da li ROS igra ulogu u casticin induciranu TRAIL pojačavanju. Kao što je prikazano na slici 7D, casticin značajno poboljšana TRAIL-inducirana apoptoza u BGC-823 stanica, a pred tretman stanica s NAC znatno smanjen casticin-inducirane apoptoze poboljšanje stanične smrti od 52,4 ± 3,3% na 8,2 ± 0,8% (srednja vrijednost ± SD, n = 3) upućuje na to da ROS igra ključnu ulogu u upravljanju učinaka casticin u TRAIL-inducirana apoptoza. pregled

casticin downregulates ekspresiju različitih proteina preživljavanja stanica u BGC-823 stanicama pregled

objavljeno je da su brojni antiapoptotski proteini, kao što survivin, cFLIP, XIAP, Bcl-2 i Bcl-XL može regulirati TRAIL-inducirana apoptoza [25], [26]. U ovom istraživanju, istraživali smo da li se neke bjelančevine, identificirane preživljavanja stanica bili su uključeni u pojačavanja učinka casticin na apoptoze potaknute trag. BGC-823 stanice su bile izložene različitim koncentracijama casticin 24 h, a zatim ispitani Bcl-XL, Bcl-2, survivina, XIAP, cFLIP, cIAP-1 (stanične inhibitora apoptoze proteina 1) i TRAF1 (TNF receptora povezanih s faktor 1) izraz. Casticin inhibirana Bcl-XL, Bcl-2, survivina, cFLIP i XIAP izraz (slika 8a). Učinci casticin na ekspresiju Bcl-XL, Bcl-2, survivina, XIAP i cFLIP bile dramatične, dok je smanjena regulacija cIAP-1 nije jako izražen. Ovi rezultati sugeriraju da podreguliranje proteina preživljavanja stanica je jedan od mehanizama za vožnju Pojačavajući učinak casticin na apoptozu induciranu TRAIL, pregled

sljedeći ispituje je li casticin mogu modulirati ekspresiju pro-apoptotičkim proteinima. otkrili smo da casticin dramatično povišeni ekspresiju Bax na koncentracijski ovisan način (slika 8B). Casticin također povećao cijepanja ponude na način ovisan o koncentraciji, kako je prikazano na smanjenje ekspresije proteina ponudu (slika 8b). Ovi rezultati ukazuju na to da casticin mogu istodobno aktivirati urođenu mitohondrija posredovani put i nepravi DR-induciranu put što se vidi iz krnje pro-apoptoze proteina ponudu. Pregled

Rasprava pregled

U ovom upitu, istraživali smo sposobnost casticin, a polymethoxyflavone dobiven iz fructus Viticis pregled, modulirati TRAIL signalizaciju u želučanih stanica raka, a naši rezultati ukazuju na to da casticin potencira TRAIL-inducirana apoptoza u rak želuca BGC-823, SGC-7901 i MGC-803 stanica po (1) inducira DR5 izraza i (2) downregulatin proteina preživljavanja stanica povezanih s otpornosti tumorskih stanica na stazi. Casticin Doreguliranje DR5 Čini se da je posredovana aktivacijom ROS-ER stresom CHOP puta (Slika 9). Pregled

mi smo pokazali da casticin inducirano DR5 ekspresiju u stanicama raka želuca. Ovi rezultati su u skladu s onima u našem prethodnom radu [10], izvijestili smo da apoptoze učinak casticin u stanicama ljudskog hepatocelularnog karcinoma je uključen u DR5 ranijim koracima, ali oni nisu rješavanje pitanja o tome da li casticin može poboljšati TRAIL-inducirana apoptoza ili mehanizam senzibilizacije. Ovdje, pokazali smo da DR5 regulaciju je kritična za senzibilizaciju stanica na TRAIL, kao utišavanja gena za receptor (DR5) oslabljenim TRAIL apoptozi. Dakle, DR5 up-regulacija može senzibilizirati stanice na TRAIL-inducirana apoptoza [27]. Brojni mehanizmi su opisana za indukciju DR, uključujući ROS generacije, indukcija p53 i NF-kB, DDIT3 (DNA oštećenja induciranog transkripta 3), i peroksizam proliferacijski aktiviranih receptora-y i MAPK aktivacije [27], [28] , U ovom istraživanju, otkrili smo da casticin inducirana CHOP i da utišavanje gena od CHOP po siRNA blokira učinak casticin na izazivanje globalnih i na TRAIL-inducirana apoptoza. Naši rezultati su slični onima u drugim studijama koje pokazuju da CHOP veže na DR5 promotor i regulira povišenje taj izraz receptora [12], [29]. Pregled

Poznato je da CHOP je tipičan ER stresa regulirano protein koji sudjeluje u ER izazvanog stresom apoptoze [11]. Naš nalaz CHOP indukcije casticin sugerira da casticin mogu potaknuti ER stresa i povećati razinu ekspresije Grp78 i eIF2α koji su dodatni proteini akumulirane ili povećane tijekom ER stresom [17]. Prema tome, čini se vjerojatnim da casticin izaziva ER stres. Salubrinal je selektivni inhibitor ER stresom inducirane apoptoze [30]. Prisutnost salubrinal očito zaštićene želučane stanice raka iz casticin plus TRAIL-inducirana apoptoza. Dakle, čini se da casticin inducira apoptozu pojačanje koje uključuju mehanizme ER stresa. Pregled

Otkrili smo da je možda najvažniji uzvodno signal vezan za casticin modulaciju TRAIL receptora ROS. Naši rezultati pokazuju nedvosmisleno da casticin izazvanu proizvodnju ROS, i da rashlađivanje ROS od strane antioksidans N
-acetylcysteine ​​oslabljena učinak casticin na indukciju nasjeckajte i DR5. Otkrili smo da je gašenje ROS i oslabljena casticin potencira TRAIL-inducirana apoptoza. Naši rezultati su u skladu s onima navedenim u prethodnim studijama sulforafan, zerumbone i celastrol za DR5 indukcije. Rezultati sadašnjih i ranijih studija snažno ukazuju na to da ROS igra važnu ulogu u modulaciji TRAIL receptor DR5 [31], [32]. Naši rezultati su u skladu s onima iz prethodnog rada, izvijestili smo da casticin uzrokovalo nakupljanje sub-G1 stanica i povećana proizvodnja ROS u HeLa CaSki i staničnim linijama SiHa, ali ne i na PBMC [33]. No, pokazali smo da casticin smanjuje sadržaj GSH ( P < 0,05 pregled), ali ne utječu na razinu intracelularne ROS u PLC /PRF /5 i Hep G2 stanicama [10]. Uvjerljivo objašnjenje za sukob prividne podataka je da postoje razlike u načinu kojim se regulira djelovanje u različite vrste stanica. Pregled

Također smo identificirali da je drugi mehanizam senzibilizacije uključuje regulaciju protiv apoptoze proteina. Casticin regulirani ekspresije elevels bcl-2, Bcl-XL, XIAP i survivina, svi koji su bili povezani s otpornosti tumorskih stanica na stazi [34], [35]. Doista, smanjena regulacija XIAP, Bcl-2, Bcl-XL i ekspresije Pokazano senzibilizirati tumorske stanice na TRAIL [36], [37]. Wang et al. Pregled (2005) [8] su pokazali da casticin smanjen Bcl-2 razine ekspresije i regulirani omjer Bcl-2 /Bax ekspresije u stanicama K562. Naši rezultati su u skladu s prethodnim istraživanjima koja pokazuju da ekstrakt etanola od sušenog zrelih plodova prstasta konopljika pregled smanjuje razinu bcl-2, Bcl-XL i ponudu proteina, a povećana u razina Bax proteina [7]. U izvješću od Chen i sur.
(2011) nedavno je pokazao da Bax bio regulira prema gore, dok je razina ekspresije Bcl-XL i XIAP su regulirani od strane casticin [33]. Pregled

Kobayakawa et al. izvijestili da casticin značajno inhibira rast KB stanica, ali ne inhibira proliferaciju stanica A431, koji je sličan u normalnim stanicama 3T3 Swiss albino i TIG-103 [38]. U ovom istraživanju, pokazali smo da casticin specifično inducirana apoptoza u ljudskim stanicama raka želuca, ali ne i u GES-1 stanice, iako nije utvrđen mehanizam selektivnog indukcije apoptoze. Naši rezultati ukazuju na to da casticin može biti specifično sredstvo protiv tumora uz nisku toksičnost. Pregled

Ukratko, naši rezultati pokazuju da casticin doprinosi osjetljivosti tumorskih stanica na stazi pomoću višestrukih mehanizama. Casticin početku potiče stvaranje ROS i aktivira ER stres zatim inducira DR5 doreguliranje kroz aktivaciju CHOP što posljedično povećava TRAIL inducirana aktivacija DR5 inducirane i mitohondrije posredovane apoptoze putovima. Istovremeno, casticin olakšava TRAIL-inducirana smrt apoptoze stanica po inhibicije ekspresije anti-apoptoze proteina i aktivaciju pro-apoptoze proteina. Buduća istraživanja trebaju biti usmjerene u potpunosti ostvariti potencijal kombinacije casticin i TRAIL terapije za liječenje pacijenata s rakom želuca. Dakle, dodatne studije o djelovanju casticin u životinjskim modelima će biti potrebna. Pregled

Materijali i metode pregled

Reagensi pregled

Casticin (čistoće ≥ 98%), kupljene od Chengdu Biopurify phytochemicals Ltd (Chengdu, Kina) prisutan u vidu žutih kristala (molekularna težina, 374,3). Casticin se otopi u dimetil-sulfoksidu (DMSO) kako bi se 10 mmol otopine /l stoka i razrijeđen u mediju za kulturu stanica do željene koncentracije neposredno prije upotrebe. Sljedeći reagensi nabavljeni su od Hunan Clonetimes Biotech Co. Ltd. (Changsha, Kina): Topivi rekombinantni humani staza (Pepro Tech) Cell Apoptosis ELISA detekcije Kit (Roche), 2 ', 7'-diklorfluorescein-diacetat (DCFH-DA; Molecular Probes Inc), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-acetilcistein (NAC, Sigma), tunikamicin (Sigma), propidij jodid (PI; Sigma), kaspaze 3 Aktivnost Detection Kit (Millipore), Caspase 8. Colorimetric Assay Kit aktivnost 25 (Millipore), kaspaze 9 Colorimetric Assay Kit aktivnost (Millipore), antitijela protiv DR5 (ProSci Inc). Antitijela protiv DR4, PARP, Bcl-2, Bax, ponuda, survivina, nasjeckajte, Grp78 i ATF4 dobiveni su iz Santa Cruz Biotechnology. Anti-XIAP antitijelo je kupljen od Cell Signaling Technology, Danvers, SAD. inhibitori kaspaze, kao što su zVADfmk, zDEVD-FMK, zIETD-FMK i zLEHD-FMK su kupljeni od tvrtke R &D Systems (Minneapolis, MN) pregled

Kultura stanica pregled

BGC-823, SGC. -7901 i MGC-803 ljudske stanice raka želuca su dobiveni iz Kine Centra za Type Culture Collection (CCTCC; Wuhan, Kina) i GES-1 stanice iz Instituta za onkologiju na Sveučilištu u Pekingu. Stanice su održavane u Dulbecco modificiranom Eagle mediju (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penicilina i 100 U /ml streptomicina u vlažnoj atmosferi s 5% CO _{2 na 37 ° C. Stanice su tretirane s različitim koncentracijama casticin ili TRAIL ili oba za MTT testom. Casticin (1,0 umol /l) i TRAIL (25, 50 ng /ml), sami ili u kombinaciji su naneseni na BGC-823 stanica koje se koriste za detekciju apoptozu. Pregled}

MTT test pregled

Stanice su posađene na ploči s 96 jažica u gustoći od 0.5104 stanica /jažica i inkubirane 24 h, nakon čega slijedi tretiranje s različitim koncentracijama casticin i staza za 24 sati ili tretirani s casticin 12 sati i zatim obradom s traga na još 24 sata. MTT Kolorimetrijske analize provedena je kao što je ranije opisano [10]. IC _{50 vrijednosti pri kojoj je 50% inhibicije rasta stanica u odnosu na dimetil sulfoksid (DMSO) kontrola, je izračunata nelinearnom regresijskom analizom korištenjem GraphPad Prism softvera (San Diego, CA).}

Flow citometrijom pomoću PI bojanja

Stanice su nasađene u gustoći od 4 × 10 ^{6 stanica /ml u tikvice za kulturu po 100 ml za 24 sata, tada se tretira s medijem koji sadrži različite koncentracije casticin ili TRAIL ili obje zajedno u navedenim vremenima. Apoptoze stanica je detektiran pomoću protočne citometrije. (FCM American BD tvrtke, FACS 420) pregled}

histona /DNA fragment ELISA pregled

apoptoze stanica ELISA detekcije kit koristi za otkrivanje apoptoze u stanicama tretiranim casticin prema protokolu proizvođača. Ukratko, stanice su posađene na ploču s 96 jažica u gustoći od 1 x 10 ^{4 stanica /jažica tijekom 24 sata, te je medij koji sadrži različite koncentracije casticin dodan koliko je potrebno. Nakon 24 h, u citoplazmi kontrolne i liječene skupine, prebačen je u pločicu s 96 jažica od peridiumed streptavidina, inkubira s histon protutijela i peroksidazom obilježen mišjeg anti-humanog DNA tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi. Apsorbancija na 405 nm mjerena je s EXL-800 tip imunoenzimski aparaturi. Pregled}

Analiza kaspaze-3, -8 i -9 aktivnosti

Aktivnosti kaspaze-3, -8 i -9 su analizirani korištenjem 3 kaspaze Aktivnost prepoznavanja Kit, kaspaza 8 Kolorimetrijska aktivnosti pribora za ispitivanje 25 i caspase 9 Kolorimetrijska aktivnosti pribora za ispitivanje, respektivno. Ukratko, stanični lizati su pripravljeni nakon odgovarajućeg tretmana s eksperimentalnim sredstvima. Ispitivanja su izvedena u ploči s 96 jažica inkubacijom 20 ug staničnih lizata u 100 ul reakcijskog pufera (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 10% glicerola) koji sadrži 5 uM kaspaze-3 supstrata Ac-DEVD- p pregled nA, caspase-8 supstrata Ac-IETD- p pregled nA ili caspase-9 supstrata Ac-LEHD- p pregled, NA. Lizati su inkubirani na 37 ° C tijekom 2 sata.

• PLoS ONE: Faza II Studija Ocjenjivanje 2 rasporede doziranja za oralnu Foretinib (GSK1363089), cMET /VEGFR2 Inhibitor, u bolesnika s metastatskim rakom želuca
• PLoS ONE: pridruživanju između smanjenju Plazma adiponektina razine i rizik od bakterijske infekcije nakon rak želuca kirurgija