Ploche ONE: Casticin zosilňuje TRAIL-indukovanú apoptózu nádorových buniek žalúdka cez ergastoplazma Stress

abstraktné

Pozadie

Casticin je jedným z hlavných aktívnych zložiek získaných z Fructus Viticis
a bolo hlásené, že vyvíjať anti-karcinogénne aktivitu na rôznych nádorových bunkách, ale presný mechanizmus tejto činnosti zostáva nejasný.

materiály a metódy

proapoptotický činnosti casticin (1,0 umol /l) a TRAIL (25, 50 ng /ml) samostatne alebo v kombinácii v nádorových bunkových línií žalúdočné BGC-823, SGC-7901 a MGC-803 boli detekované použitím bunkovej apoptózy súpravy pre detekciu ELISA, prietoková cytometria ( FCM) s propidium jodidom (PI) farbením a aktivity kaspázy-3, -8 a -9 pomocou ELISA a štiepením polyADP-ribóza polymerázy (PARP) proteínu za použitia analýzy western blot. Smrť receptory (DR), hladiny expresie boli hodnotené za použitia analýzy FCM a Western blotting. 2 ', 7'-dichlór-diacetát (DCFH-DA) bol použitý ako sonda na meranie zlepšenia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) v krvi v bunkách. Niekoľko zásahov, ako je napríklad siRNA transfekcia a farmakologické inhibítory boli použité k objavovaniu mechanizmov týchto akcií.

Výsledky

subtoxických koncentrácia casticin podstatne zvyšovaný cytotoxicitu a apoptózu TRAIL-indukovanej BGC-823, SGC-7901 a MGC-803 buniek. Casticin dramaticky upregulován expresiu receptora Dr5, ale nemal žiadny vplyv na DR4 alebo chybných receptorov. Vypustenie Dr5 pomocou siRNA významne znížil apoptózu indukovanú ko-aplikáciu TRAIL a casticin. Umlčanie génu väzby CCAAT /enhancer proteínu homologického proteínu (CHOP) a predchádzajúcej liečbe salubrinal, inhibítor ER (ER) stres, oslabený výraz casticin vyvolané Dr5 receptor, a apoptózu a produkciu ROS. Casticin downregulated expresných hladín prežitie proteínov bunkového cFLIP, bcl-2, XIAP, a od survivinu. Okrem toho casticin tiež indukovaná výrazy Dr5 proteínu v iných žalúdočných rakovinových bunkách (SGC-7901 a MGC-803).

Záver /Význam

Casticin zvyšuje TRAIL-indukovanú apoptózu cez downregulation prežitie bunkové proteíny a up-reguláciu receptorov Dr5 prostredníctvom akcií na ROS-ER stres-CHOP dráhy

Citácia :. Zhou Y, Tian L, Long L, M Quan, Liu F, J Cao (2013) Casticin zosilňuje TRAIL-indukovanú apoptózu nádorových buniek žalúdka cez retikula stresu. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10,1371 /journal.pone.0058855

Editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Spojené štáty |

prijatá: 11.06.2012; Prijaté: 08.02.2013; Publikované: 11.03.2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená projektu NSFC (číslo 30760248), projektu vedecký výskum Hunan provincii správa Bureau of tradičnej čínskej medicíny (číslo 2010081), projektu vedeckého výskumu v provincii Hunan, ministerstvo školstva (číslo 10C0975), Major projekt Položka pre vedecký výskum v provincii Chu-nan ministerstva školstva (počet 09A054) a projekt vedecký výskum Changsha City Bureau of Science and Technology (číslo K1104060-31). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Fructus Viticis
( Manjingzi
je čínsky názov), a síce plody Vitex trifoliata L.
(rodina Verbenaceae
) že je tradičnej čínskej medicíny používa ako protizápalový prostriedok. Casticin je jedna z aktívnych zložiek získaných z Fructus Viticis
[1]. Mnohé štúdie preukázali, že casticin vykazuje anti-karcinogénne aktivitu v prsníku [2], krčka maternice [3], prostaty [4], pľúc a hrubého čreva [5], [6], rovnako ako u karcinómu žalúdka [7] in vitro
. Bolo tiež zistené, že casticin inhibuje rast ľudských leukemických buniek myeloidnej [8] a vyvoláva smrť leukemických buniek indukciou apoptózy buď alebo mitotického katastrofy [9].

V súčasnej dobe predchádzajúcej práce z naše laboratórium je uvedené, že účinok na casticin apoptózy ľudských buniek hepatocelulárneho karcinómu sa podieľa na Dr5 dráhe nezávislé na stave p53 [10]. Bolo doložené, že väzba CCAAT /enhancer proteín homológny proteín (CHOP), tiež známy ako zastavenie rastu a DNA génu poškodenie 153 (GADD153), sa priamo upravuje Dr5 expresie prostredníctvom väzbového miesta CHOP v 5-lemujúce oblasti génu Dr5 [11], [12]. My, a iní, uvádzajú, že niektoré lieky, ako je 5, 7-dimetyl-dimethoxyflavone a celecoxib, indukujú expresiu Dr5 pomocou CHOP závislej transaktivace génu Dr5 [13] - [15]. Okrem toho niekoľko štúdií preukázalo úzky vzťah medzi retikula (ER) stres a prejavu Dr5. ER stres je vyvolaná po rozložení proteíny sa hromadí v lumen ER [16]. Zdá sa, že táto reakcia môže aktivovať konkrétne apoptotické cesty na odstránenie ťažko poškodené bunky, v ktorých defekty bielkovín skladacie nemožno vyriešiť [17], [18]. Rôzne ER stres induktory, ako je napríklad MG132 [12], tunicamycin [19] a thapsigargin [20], dôsledne indukuje expresia Dr5 na povrchu buniek. Aj keď molekulárne mechanizmy pre Dr5 expresie proteínu ER stres induktormi môže líšiť v závislosti na podnety a typy buniek, ER stresom indukovatelný transkripčný faktor, CHOP, poskytuje spojenie medzi ER stres a Dr5. Avšak, či casticin indukuje expresiu Dr5 vo buniek karcinómu žalúdka, a ak áno, povaha molekulárneho mechanizmu zapojený nie je známy.

Nedávna štúdia preukázala, že účinná tumor nekrotizujúci faktor-α-indukujúceho apoptózu súvisiaceho s ligand ( TRAIL) založené kombinovaná terapia môže byť dosiahnuté upregulating DR4 a Dr5 expresie, a priamo cielenie nádorových buniek mitochondrií majú stimulovať apoptózu indukujúce vlastnosti [21]. Schopnosť sprostredkovať mitochondrií apoptózu je prísne regulovaná členmi superrodiny Bcl-2 [22]. Potlačenie anti proapoptotický expresie proteínu, s antisencie RNA alebo siRNA, bolo preukázané, že citlivosť rakovinových buniek na TRAIL [23]. V dôsledku toho, činidlá, ktorá znižuje expresiu také anti-apoptotické proteíny, ako survivin, bunkové FADD, ako je rakovina interleukín-1β konvertujúci enzým inhibičný proteín (cFLIP), Bcl-2, a X-spojený inhibítor apoptózy proteínu (XIAP) môže potenciálne citlivosť bunky na apoptotické účinky TRAIL [23], [24].

V tejto štúdii, preto sme sa zamerali na skúmanie, či casticin zosilňuje TRAIL-indukovanú apoptózu nádorových buniek, a ak áno, ako casticin zosilňuje toto účinok. Zistili sme, že casticin potencuje apoptózu TRAIL-indukovanej upregulating Dr5 prostredníctvom ROS-ER stres-CHOP dráhy a downregulating expresiu proteínov bunkového prežitia Bcl-2, XIAP, cFLIP a survivin v rakovinových bunkách žalúdka.

Výsledky

subtoxických koncentrácia casticin selektívne zosilňuje TRAIL-indukovanú cytotoxicitu v žalúdočných rakovinových bunkách

cytotoxicita casticin a TRAIL, samostatne alebo v kombinácii, bola skúmaná v ľudských nádorových líniách žalúdočných BGC- 823, SGC-7901 a MGC-803, ako bolo určené testom MTT. Casticin a TRAIL samy o sebe spôsobili cytotoxicitu buniek karcinómu žalúdka, v závislosti od koncentrácie (obr 1A a B). Mierne cytotoxicity (menej ako 20%) sa pozorovala pri nižšej koncentrácii casticin (1,0 umol /l, obrázok 1A). Liečba buniek karcinómu žalúdka 25-50 ng /ml TRAIL po dobu 24 hodín vyvolanej obmedzenej cytotoxicitu (menej ako 20%). Avšak, čo-liečenie vredu nádorových buniek s casticin (1,0 pmol /l) a TRAIL (25 ng /ml alebo 50 ng /ml) výrazne zvýšená cytotoxické účinky v porovnaní s liečbou casticin alebo TRAIL samotným (obrázok 1C).

, pretože sme zistili, že kombinovaná liečba casticin a TRAIL silne indukované cytotoxicity buniek karcinómu žalúdka, Ďalej sme skúmali účinok liečby na imortalizovaných sliznice epitelové bunkové línie ľudského žalúdka GES-1. Je zaujímavé, že kombinácia casticin a TRAIL neindukuje cytotoxicity v GES 1-buniek (Obrázok 1d) .Tieto výsledky ukazujú, že koncentrácia subtoxických casticin selektívne citlivé ľudské rakoviny žalúdka bunky k TRAIL-indukovanú cytotoxicitu.

koncentrácia subtoxických z casticin citlivosť žalúdočné rakovinové bunky na TRAIL-indukovanej apoptózy

Ak chcete zistiť, či je apoptóza sa podieľa na inhibíciu bunkového rastu po súčasnom liečbe casticin a TRAIL, najprv skúmal apoptózu pomocou analýzy prietokovej cytometrie k detekcii zvýšenie hypodiploidních bunke populácií. Výsledky ukázali, že miera apoptózy bola 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% a 37,1 ± 4,9% (priemer ± SD, n
= 3) pre casticin (1 pmol /l), TRAIL (50 ng /ml) a casticin a TRAIL, v danom poradí (obrázok 2A). Populácia sub-G1 z BGC-823 buniek bola významne zvýšená na 12 hodín, a dosiahla vrchol 24 hodín po predchádzajúcej 1 umol /l casticin nasleduje 50 ng /ml TRAIL (obrázok 2B). Ďalším sme stanovili hladiny fragmentu histónov /DNA rakovinových bunkových línií žalúdočné BGC-823, SGC-7901 a MGC-803 s využitím apoptózu ELISA kit detekcie. Obrázok 2C ukazuje, že kombinovaná liečba casticin a TRAIL synergicky indukované fragmentácii histónov /DNA. Úrovne fragment Histon /DNA z BGC-823 boli zvýšené po 12 h a 24 h po dosiahla vrchol súčasného podávania casticin (1 pmol /l) a TRAIL (50 ng /ml, obrázok 2D).

ďalším skúmalo, či boli skutočne kaspázy aktivované pri indukcii apoptotické bunkovej smrti u kombinovanej liečby s casticin a chodník v rakovinových bunkách žalúdka. Liečba gastic rakovinových buniek samotným počas 24 hodín 1 pmol /l casticin nevyvolal žiadnu aktivitu kaspázy-3, -8 a -9. V reakcii na TRAIL (50 ng /ml), aktivity kaspázy-3, -8 a -9 sa nezmenila. Avšak kombinovaná liečba casticin a TRAIL indukuje aktiváciu kaspázy-3 a -8 a mierne aktivovanej kaspázy-9 (obrázok 2 E, F a G).

Tiež sme zistiť, ktorý kaspázy bol špecificky aktivované reakcia na casticin a TRAIL liečbu pomocou inhibítorov kaspázy, vrátane inhibítora pán-kaspasy zvady-FMK, sa kaspázy-3 inhibítora zDEVD-FMK, sa kaspázy-8 inhibítora zIETD-FMK a kaspázy-9 inhibítora zLEHD-FMK. Ako je znázornené na obrázku 2E, zvady-fmk, zDEVD-fmk a zIETD-fmk významne znížila úroveň aktivity kaspázy-3 vyvolaného kombinovanú liečbu casticin a TRAIL, ale zLEHD-fmk mal mierny účinok. zvady-fmk a zIETD-fmk môže súčasne úplne zablokovať aktiváciu kaspázy-8, a zDEVD-fmk čiastočne blokovaný aktiváciu kaspázy-8; Avšak, zLEHD-FMK mal malý vplyv na stav aktivácie kaspázy-8 (Obr 2F). Zodpovedajúcim spôsobom, zistili sme, že kaspázy-9 bol ľahko aktivovaný v bunkách ošetrených casticin a TRAIL, ale nie v bunkách ošetrených casticin a TRAIL za prítomnosti z- IETD-fmk, zvady-fmk a zLEHD-fmk (obrázok 2G). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že casticin s prídavkom TRAIL indukuje aktiváciu kaspázy-8 pred kaspázy-9 aktivácia [10].

Nakoniec sme skúmali, či by mohla zlepšiť casticin TRAIL-indukovanej štiepenie PARP a zistili, že zvýšená casticin TRAIL-indukovanej zvýšenie štiepenia PARP v BGC-823 a SGC-7901 buniek (obr 2H). Tieto výsledky jasne ukazujú, že koncentrácia subtoxických casticin zvyšuje TRAIL-indukovanú apoptózu buniek karcinómu žalúdka.

Casticin indukuje expresiu Dr5 v žalúdočných rakovinových bunkách

Apoptóza hepatocelulárneho karcinómu buniek indukovaných casticin bol zapojený do Dr5 up reguláciu [10]. Z tohto dôvodu sme liečili BGC-823 buniek casticin po dobu 24 hodín a potom bola použitá analýza Western blot skúmať buniek pre expresiu TRAIL receptora. Casticin zvýšenej Dr5 expresie v závislosti od koncentrácie, ale nemala žiadny efekt na expresiu ani DR4 DcR1 a DcR2 indukcia (Obrázok 3A). Indukcia expresie Dr5 casticin došlo v 6 hodín a dosiahol vrchol v 24 hodín (obrázok 3B). Tieto zistenia naznačujú, že up-regulácia Dr5 je kandidátom mechanizmus, prostredníctvom ktorého casticin zvyšuje apoptotické účinky TRAIL v BGC-823 buniek.

Ak chcete zistiť, či je DR na bunkovom povrchu bol zapojený do indukcie apoptózy casticin, bunková povrchová expresia Dr5 a DR4 bol pozorovaný pomocou prietokovej cytometrie. Po vystavení buniek na casticin (1,0 umol /l), je úroveň Dr5 na povrchu buniek bola zvýšená (obrázok 3C). Avšak, casticin neovplyvnila hladinu expresie DR4 (obrázok 3D). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že casticin zvyšuje reguláciu expresie Dr5 na povrchu buniek.

, či zvýšenie expresie Dr5 podľa casticin je špecifický pre BGC-823 buniek, alebo tiež sa vyskytuje v iných žalúdočných rakovinové bunkové línie, bola tiež skúmaná. Casticin vyvolaná Dr5 expresie v karcinómu žalúdka SGC-7901 a MGC-803 bunkových línií, ale nemal zjavné účinky na jeho vyjadrenia v imortalizační žalúdočnej sliznice GES-1 bunkovej línie (obr 3E). Spoločne tieto zistenia naznačujú, že up-regulácia Dr5 tým casticin nie je špecifické pre určitý typ žalúdočnej nádorové bunky.

je vyžadované Dr5 indukcia casticin pre zlepšovanie TRAIL-indukovanej apoptózy v BGC-823 buniek

pre stanovenie úlohy Dr5 receptorov v posilnení TRAIL-indukovanej apoptózy casticin sme použili siRNA špecifické pre Dr5 na znižuje expresiu jeho expresiu. Prenos buniek pomocou siRNA pre Dr5, ale nie s kontrolnou siRNA znížená casticin vyvolanú Dr5 expresie.

Ak chcete skontrolovať, či Dr5 up-regulácia zahŕňa casticin-rozšírené TRAIL-indukovanej žalúdočné apoptózu, prietoková cytometrická analýza bola použitá na skúmať, či potlačenie Dr5 expresia siRNA by zníženie účinku casticin na TRAIL-indukovanú apoptosu. Obrázok 4B ukazuje, že účinok casticin na TRAIL-indukovanú apoptosu bol účinne znížila v bunkách transfekciou siRNA Dr5, zatiaľ čo bunky transfekované kontrolné siRNA neboli ovplyvnené. Dohromady tieto výsledky naznačujú, že indukcia Dr5 je rozhodujúci pre senzitizáciu nádorových buniek k účinkom casticin na TRAIL-indukovanú apoptosu.

Casticin vyvolané Dr5 up-regulácia je sprostredkovaná indukcia CHOP v BGC-823 buniek

CHOP-sprostredkované zvýšenie expresie Dr5 bolo preukázané, [11] - [15]; Preto sme skúmali ďalšie, ako by sa tento transkripčný faktor podieľa na casticin vyvolané Dr5 up-reguláciu. Obrázok 5A ukazuje, že casticin indukovanú expresiu CHOP, ku ktorému došlo v paralelne k nárastu expresie Dr5.

Pre testovanie úlohy CHOP v casticin vyvolané zvýšením expresie DR, bol použitý gén umlčanie CHOP o siRNA. Transfekcia s CHOP siRNA významne potlačené casticin vyvolanú Dr5 upregulaci (obrázok 5B), zatiaľ čo casticin stimulovaná expresie Dr5 v non-transfekovány a kontrolné transfekované (miešaná RNA) bunky.

Ďalej sme použiť analýzy prietokovej cytometrie na preskúma, či potlačenie CHOP podľa siRNA oslabený senzibilizačné účinky casticin na TRAIL-indukovanej apoptózy. Transfekcia siRNA CHOP významne znižuje účinky (z 37,1 ± 5,3% na 13,5 ± 1,3%, priemer ± SD, n
= 3) na casticin navyše TRAIL-indukovanej apoptóze (5C), zatiaľ čo liečba s kontrolou siRNA nemala žiaden účinok (obrázok 5C). Tieto výsledky ukazujú, že CHOP sa podieľa na Dr5 up-reguláciu a prispieva k senzibilizačné účinky casticin na TRAIL-indukovanej apoptózy v našom experimentálnom modeli.

Casticin indukovanej ER (ER) napätie vo buniek karcinómu žalúdka

je známe, že ER vyvoláva ER stres proteínové markery (napríklad GRP78 a fosfo-eIF2α), ktorý zvyšuje reguláciu expresiu CHOP [12], [19], [20]. V tejto štúdii sa skúmal vplyv casticin na expresiu ER stresových markerových proteínov. Naše výsledky ukazujú, že casticin skutočne vyvolávať všetkých týchto markerov ER stres v BGC-823 bunkách (obrázok 6A). Na určenie, či ER stres sa podieľa na potenciáciu casticin na apoptózu indukovanú TRAIL, salubrinal, inhibítor ER stres, bol použitý. Salubrinal (50 pmol /l) významne chránené BGC-823 bunky pred apoptózou indukovanú ko-aplikáciu casticin a TRAIL (obrázok 6B).

Tiež sme testovali, či liečenie BGC-823 bunkách s endoplasmatickém retikule (ER) napätie induktora, tunicamycin [25], by mohli zvýšiť hladiny Dr5 proteínu a zlepšiť TRAIL-indukovanú proapoptotický smrť buniek. Zistili sme, že tunicamycin (3,0 pmol /l) v závislosti na čase zvýšenej hladiny proteínu Dr5, p-eIF2α, GRP78 a CHOP, v BGC-823 bunkách (Obrázok 6c). Cotreatment s tunikamycinu (3,0 pmol /l) a TRAIL (50 ng /ml), výrazne zvýšilo percento buniek v sub-G1 fáze, v porovnaní s tunikamycinu alebo TRAIL samotným (obrázok 6D). Tieto výsledky podporujú hypotézu, že ER stres podieľa na zosilňujúci účinok casticin na apoptózu indukovanú TRAIL.

Casticin indukované Dr5 up-regulácia apoptózy a zosilnenia sú ROS závislý na BGC-823 buniek

nedávno sme ukázali, že 5, 7-dimethoxyflavone selektívne zvyšuje TRAIL-indukovanú apoptózu ROS stimulovanej ER-stres spúšťanie CHOP sprostredkované Dr5 Upregulace u hepatocelulárneho karcinómu buniek [15]. Preto sme skúmali, či casticin indukuje produkciu ROS. 2 '7'-dichlór-diacetát (DFCH-DA) bol použitý ako sonda na meranie akékoľvek zvýšenie hladiny ROS v bunkách. Čas pokusy o predmete sa zistilo, že hladiny ROS boli najprv zvýšená na

1 h, dosiahol vrchol v 3 hodín a pretrváva po dobu až 24 hodín po liečbe 1,0 umol /l casticin (Obrázok 7A). Casticin indukovanej produkcie ROS v koncentračnom závislým spôsobom (obrázok 7B).

Ak chcete dešifrovať vzťah medzi výrobou ROS a CHOP závislé Dr5 indukcii, sme skúmali, či ROS reguluje casticin indukovanej TRAIL receptory a preháňajú v prítomnosti a absencia N
-acetylcysteine ​​(NAC), ktorý je scavenger voľných kyslíkových radikálov. Zistili sme, že predchádzajúce ošetrenie buniek s NAC znížilo upregulaci casticin indukovanej Dr5 a CHOP expresie (obrázok 7C).

Okrem toho sa preskúmalo, či ROS hrá úlohu v casticin indukovanú TRAIL potenciácie. Ako je znázornené na obrázku 7D, casticin významne zvýšená TRAIL-indukovanú apoptózu v BGC-823 buniek, a predbežné ošetrenie buniek s NAC výrazne znížená casticin indukovanej apoptotické zvýšenie bunkovej smrti z 52,4 ± 3,3% na 8,2 ± 0,8% (priemer ± SD, n = 3), čo ukazuje, že ROS hrá rozhodujúcu úlohu v sprostredkovaní účinkov casticin v TRAIL-indukovanú apoptosu.

casticin downreguluje expresiu rôznych proteínov bunkovej prežitie v BGC-823 buniek

bolo zistené, že množstvo anti-apoptotické proteíny, ako je survivin, cFLIP, XIAP, Bcl-2 a Bcl-xL môže regulovať TRAIL-indukovanú apoptózu [25], [26]. V tejto štúdii sme skúmali, či určité identifikovanej proteíny bunkového prežitia boli zapojené do zosilňujúci účinok casticin na apoptóze indukovanej TRAIL. BGC-823 bunky boli vystavené rôznym koncentráciám casticin po dobu 24 hodín a potom sa vyšetrí na Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (bunkovej inhibítor apoptózy proteín 1) a TRAF1 (TNF receptor-asociované faktor 1) výraz. Casticin inhibuje Bcl-XL, Bcl-2, survivin, cFLIP a XIAP výraz (obrázok 8A). Účinky casticin na expresiu Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP a cFLIP boli dramatické, zatiaľ čo zníženie expresie z CIAP-1 nebola výrazná. Tieto výsledky naznačujú, že zníženie expresie proteínov prežívanie buniek je jedným z mechanizmov, poháňajúci zosilňujúci účinok na casticin apoptózy indukovanú TRAIL.

Ďalej sme skúmali, či by mohli casticin modulovať expresiu pre-apoptotických proteínov. Zistili sme, že casticin dramaticky up-regulovaná expresia Bax v závislosti od koncentrácie spôsobom (obrázok 8B). Casticin tiež zvýšil štiepenie ponuku v závislosti od koncentrácie, ako ukazuje pokles expresie proteínu Bid (obrázok 8B). Tieto nálezy naznačujú, že casticin môže súčasne aktivovať vnútorné mitochondriálneho sprostredkovanú dráhu a vonkajšie DR-indukovanú cestu, ako o tom svedčí skráteného pre-apoptotického proteínu Bid.

Diskusia

V tomto prešetrovaní, skúmali sme schopnosť casticin, centrum polymethoxyflavone odvodené od Fructus Viticis
modulovať TRAIL signalizáciu v rakovinových bunkách žalúdka, a naše zistenia naznačujú, že casticin zosilňuje apoptózu TRAIL-indukovanej rakoviny žalúdka BGC-823, SGC-7901 a MGC-803 buniek (1) vyvolávajúce Dr5 expresie a (2) downregulatin prežitie bunkové proteíny spojené s rezistenciou nádorových buniek na TRAIL. Casticin upregulace Dr5 sa zdá byť sprostredkovaný aktiváciou ROS-ER stres-CHOP dráhy (Obrázok 9).

sme ukázali, že indukované casticin Dr5 expresie v nádorových bunkách žalúdka. Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami z našej predchádzajúcej práci [10], sme popísali, že proapoptotický účinok casticin v ľudských hepatocelulárneho karcinómu buniek sa podieľa na Dr5 up-reguláciu, ale nemali riešiť otázku, či casticin môže zvýšiť TRAIL-indukovanú apoptózu alebo mechanizmus senzibilizácie. Tu sme ukázali, že up-regulácia Dr5 je rozhodujúci pre senzitizáciu buniek na TRAIL, ako je umlčanie génu receptora (Dr5) oslabené apoptóze indukovanej TRAIL. Tak, Dr5 up-regulácia môže citlivosť buniek na TRAIL-indukovanú apoptosu [27]. Početné mechanizmy boli popísané pre indukciu DR, vrátane ROS generácie, p53 indukcia, a NF-kB, DDIT3 (DNA poškodenie indukovatelný transkriptov 3), peroxizómov receptora-y a MAPK aktivácia proliferátorom aktivovaného [27], [28] , V tejto štúdii sme zistili, že casticin indukované CHOP a že umlčanie génu rezanky pomocou siRNA blokoval účinok casticin na indukciu DRS a na TRAIL-indukovanú apoptosu. Naše výsledky sú podobné ako u iných štúdií, ktoré ukázali, že CHOP sa viaže na promótor Dr5 a zvyšuje aktiváciu tejto expresiu receptora [12], [29].

Je dobre známe, že CHOP je typický ER stres regulované proteín zapojený do ER stresom indukovanej apoptózy [11]. Naše zistenia CHOP indukciu casticin naznačuje, že casticin môžu vyvolať ER stres a zvýšenie úrovne expresie GRP78 a eIF2α, ktoré sú doplnkové proteíny nahromadené alebo vzrástli v priebehu ER stresu [17]. Preto sa zdá pravdepodobné, že indukuje casticin ER stres. Salubrinal je selektívny inhibítor ER stresom indukovanej apoptózy [30]. Prítomnosť salubrinal zrejme chránenej buniek karcinómu žalúdka z casticin navyše TRAIL-indukovanú apoptózu. Zdá sa teda, že casticin indukuje apoptózu zosilnenie zapojením ER stres mechanizmov.

Zistili sme, že snáď najdôležitejšie proti prúdu signál spojený s casticin moduláciu TRAIL receptorov je ROS. Naše výsledky ukazujú jednoznačne, že casticin indukovanú produkciu ROS, a že zhášanie ROS antioxidantu N
-acetylcysteine ​​tlmí účinok casticin na indukciu CHOP a Dr5. Zistili sme, že kalenie ROS tiež oslabený casticin zosilnenie TRAIL-indukovanej apoptózy. Naše zistenia sú v súlade s uvádzanými v predchádzajúcich štúdiách používajúcich sulforaphane, zerumbone a Celastrol pre Dr5 indukciu. Výsledky súčasných aj bývalých štúdií jasne ukazujú, že ROS hrá významnú úlohu v modulácii TRAIL receptor Dr5 [31], [32]. Naše výsledky sú v súlade s údajmi z predchádzajúcej práce, hlásil, že sme casticin spôsobilo nahromadenie sub-G1 bunky a zvýšená produkcia ROS v Hela, Caska a bunkových línií siha, ale nie v PBMCs [33]. Ale sme ukázali, že casticin znížený obsah GSH ( P < 0,05
), ale neovplyvnil hladinu intracelulárneho ROS v PLC /PRF /5 a Hep G2 bunky [10]. Prijateľné vysvetlenie pre zjavné konfliktu dát, je to, že existujú rozdiely v modality, ktoré regulujú činnosť v rôznych typoch buniek.

Tiež sme zistili, že druhý mechanizmus senzibility zahŕňa reguláciu antiapoptotických proteínov. Casticin downregulated expresné elevels Bcl-2, Bcl-XL, XIAP a survivinu, z ktorých všetky boli spojené s rezistenciou nádorových buniek na TRAIL [34], [35]. Vskutku, zníženie expresie XIAP, Bcl-2 a expresiu Bcl-XL bolo preukázané, že citlivosť nádorových buniek na TRAIL [36], [37]. Wang et al.
(2005) [8] ukázal, že casticin znížila Bcl-2 hladín expresie a downregulated pomer Bcl-2 /Bax expresie v bunkách K562. Naše výsledky sú tiež v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktorá preukázala, že etanolový extrakt zo sušenej zrelé plody Vitex agnus castus-
znížila úroveň Bcl-2, Bcl-xL a Bid proteín, a zvýšenie v hladina proteínu Bax [7]. Správa z Chen et al.
(2011) nedávno ukázala, že Bax bola up-regulovaná, zatiaľ čo hladiny expresie Bcl-XL a XIAP boli downregulated podľa casticin [33].

Kobayakawa et al. uvádzajú, že casticin výrazne inhibuje rast buniek KB, ale neinhibuje proliferáciu buniek A431, ktorý je podobný normálne bunkové línie 3T3 Swiss Albino a TIG-103 [38]. V tejto štúdii sme ukázali, že casticin špecificky indukované apoptózy u ľudských buniek karcinómu žalúdka, ale nie v bunkách GES-1, aj keď mechanizmus selektívne indukcie apoptózy nebola stanovená. Naše výsledky naznačujú, že casticin môže byť stanovená ako protinádorová látka s nízkou toxicitou.

V súhrne, naše výsledky ukazujú, že casticin prispieva k citlivosti nádorových buniek k Trail využitím niekoľkých mechanizmy. Casticin spočiatku podporuje tvorbu ROS a spúšťa ER stres potom indukuje Dr5 upregulaci aktiváciou CHOP, ktoré v dôsledku toho zvyšuje aktiváciu TRAIL-indukovanú Dr5-indukovanej a mitochondrie sprostredkované apoptózy dráh. Súčasne casticin uľahčuje TRAIL-indukovanú proapoptotický smrť buniek inhibíciou expresie anti-apoptózu proteínov a aktiváciu pre-apoptózy proteínov. Budúce výskumy by mali byť zamerané plne využiť potenciál kombinácie casticin a TRAIL terapie na liečbu pacientov s rakovinou žalúdka. Z tohto dôvodu bude potrebné ďalšie štúdie akciami casticin vo zvieracích modeloch.

Materiály a metódy

Chemikálie

Casticin (čistota ≥ 98%) bol zakúpený od Chengdu Biopurify fytochemikálie Ltd. (Chengdu, Čína), ktorý je obsiahnutý vo forme žltých kryštálov (molekulová hmotnosť 374,3). Casticin sa rozpustí v dimetyl-sulfoxidu (DMSO), aby sa 10 mmol /l zásobného roztoku a zriedi v médiu na požadovanú koncentráciu tesne pred použitím. Nasledujúce činidlá boli zakúpené od Hunan Clonetimes Biotech Co. Ltd. (Changsha, Čína): rozpustný rekombinantný ľudský TRAIL (korenie Tech), apoptózu ELISA Detection Kit (Roche), 2 ', 7'-dichlór-diacetát (DCFH-DA; molecular Probes Inc.), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-acetylcysteínu (NAC, Sigma), tunicamycin (Sigma), propidium jodid (Pl, Sigma), kaspasy 3 Aktivita Detection Kit (Millipore), Caspase 8 Colorimetric Assay Kit aktivity 25 (Millipore), kaspasy 9 Colorimetric aktivity Assay Kit (Millipore), protilátka proti Dr5 (ProSci Inc). Protilátky proti DR4, PARP, Bcl-2, Bax, Bid, survivin, kotleta, GRP78 a ATF4 boli získané od Santa Cruz Biotechnology. Anti-XIAP protilátka bola získaná od Cell Signaling Technology, Danvers, USA. inhibítory kaspázy, ako je zVADfmk, zDEVD-fmk, zIETD-fmk a zLEHD-fmk boli zakúpené od firmy R &D Systems (Minneapolis, MN)

Bunková kultúra

BGC-823, SGC. -7901 a MGC-803 ľudské rakovinové bunky žalúdka boli získané z Číny centra pre Type Culture Collection (CCTCC; Wuhan, Čína) a GES-1 buniek z inštitútu onkológie v Pekinskej univerzite. Bunky boli udržiavané v Eaglovho média Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penicilínu a 100 U /ml streptomycínu vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO _{2 pri teplote 37 ° C. Bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami casticin alebo TRAIL, alebo ako pre MTT test. Casticin (1,0 pmol /l) a TRAIL (25, 50 ng /ml) samostatne alebo v kombinácii boli aplikované na BGC-823 buniek používaných na detekciu apoptózy.}

MTT test

Bunky boli schovať v 96-jamkové doštičky pri hustote 0.5104 buniek /jamku a inkubované po dobu 24 hodín, a následnou reakciou s rôznymi koncentráciami casticin a TRAIL po dobu 24 hodín, alebo liečení casticin po dobu 12 hodín s následnou reakciou s TRAIL po ďalších 24 hodín. MTT kolorimetrická analýza bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [10]. IC _{50 hodnota, pri ktorej 50% inhibícia rastu buniek v porovnaní s kontrolou dimetyl sulfoxidu (DMSO), bola vypočítaná pomocou nelineárnej regresnej analýzy za použitia software GraphPad Prism (San Diego, CA).}

Flow cytometria s použitím PI farbenie

Bunky boli schovať v hustote 4 x 10 ^{6 buniek /ml v 100 ml kultivačných nádobách po dobu 24 hodín a potom sa spracuje s médiom obsahujúcim rôzne koncentrácie casticin alebo TRAIL, alebo obaja spoločne po uvedenej doby. Bunková apoptóza bola detekovaná s použitím prietokovej cytometrie. (FCM, American BD Company, FACS 420)}

Histon /DNA fragment ELISA

apoptózu buniek súprava pre detekciu ELISA bola použitá pre detekciu apoptózy v bunkách ošetrených casticin podľa protokolu výrobcu. V stručnosti, bunky boli schovať na 96-jamkové doštičky v hustote 1 x 10 ^{4 buniek /jamka po dobu 24 hodín a médium obsahujúce rôzne koncentrácie casticin pridané podľa potreby. Po 24 hodinách cytoplazmy kontrolných a ošetrovaných skupín bol prevedený do 96-jamkové doštičky peridiumed podľa streptavidínom inkubovali s biotinylizované protilátkou Histon a peroxidáze značené myšou anti-ľudskej DNA po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Absorbancia pri 405 nm bola meraná EXL-800 typu Enzyme-linked ImmunoSorbent zariadenia.}

Analýza kaspázy-3, -8 a -9 činnosti

Činnosť kaspázy-3, -8 a -9 boli hodnotené pomocou kaspasy 3 Activity Detection Kit, kaspázy 8 Kolorimetrická aktivity Testovacia súprava 25 a kaspasy 9 Kolorimetrická aktivity Testovacia súprava, resp. Stručne povedané, fragmenty buniek boli pripravené po ich zaobchádzanie s experimentálnymi látkami. Tieto testy boli vykonané v 96-jamkových doštičkách inkubáciou 20 ug lyzátu buniek v 100 ul reakčného pufru (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 10% glycerol), obsahujúcim 5 uM z kaspasy 3 substrátu Ac-DEVD- p
nA sa kaspázy-8 substrátu Ac-IETD- p
nA alebo kaspázy-9 substrátu Ac-LEHD- p
NA.

• Ploche ONE: Fáza II štúdie hodnotiace 2 dávkovacej schéme orálneho Foretinib (GSK1363089), cMet /VEGFR2 inhibítora, u pacientov s metastatickým rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: pridružení medzi Zníženie Plasma adiponektínu úrovniach a riziko bakteriálnej infekcie po rakovinou žalúdka chirurgia