PLoS ONE: Casticin potentiates TRAIL: n indusoiman apoptoosin mahasyövän Cells kautta Endoplasmakalvosto Stressi

tiivistelmä

Background

Casticin on yksi tärkeimmistä aktiivista komponentteja saadaan Fructus Viticis
ja on raportoitu aiheuttavan antikarsinogeenisiä aktiivisuus erilaisia ​​syöpä soluissa, mutta tarkkaa mekanismia taustalla tätä toimintaa on edelleen epäselvä.

Materiaalit ja menetelmät

apoptoottinen toiminta casticin (1,0 umol /l) ja TRAIL (25, 50 ng /ml) yksinään tai yhdistelmänä mahalaukun syövän solulinjat BGC-823, SGC-7901 ja MGC-803 havaittiin käyttämällä solun apoptoosin ELISA detektioreagenssipakkaus, virtaussytometrialla (FCM) propidiumjodidilla (PI) värjäystä ja toimintaa kaspaasi-3, - 8 ja -9 ELISA ja lohkaisemalla polyADP-riboosi-polymeraasi (PARP) proteiinin western blot -analyysiä käyttämällä. Kuolemareseptorien (DR) ekspressiotasoja arvioitiin käyttämällä FCM analyysiä ja Western blotting. 2 ', 7'-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA), käytettiin koettimena mitata kasvua reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tasot soluissa. Useita toimenpiteitä, kuten siRNA transfektion ja farmakologisia inhibiittoreita käytettiin tutkimaan mekanismeja näiden toimien.

Tulokset

Subtoxic pitoisuudet casticin merkittävästi voimisti TRAIL aiheuttamaa sytotoksisuutta ja apoptoosin BGC-823, SGC-7901 ja MGC-803 soluja. Casticin dramaattisesti voimistunut DR5-reseptorin ilmentymisen mutta ei vaikuttanut DR4 tai houkutuslintuna reseptoreihin. Poisto DR5: tä siRNA vähensi indusoiman apoptoosin yhteistyössä soveltamista TRAIL ja casticin. Gene hiljentäminen CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin homologista proteiinia (CHOP) ja esikäsittelyn kanssa salubrinal, joka on Endoplasmakalvosto (ER) stressi estäjä, heikennettyjä casticin aiheuttama DR5-reseptorin ilmentyminen, ja apoptoosin ja ROS tuotanto. Casticin vaimentua ilmentymistasojen solun selviytymisen proteiinit cFLIP, Bcl-2, XIAP, ja surviviini. Lisäksi casticin myös indusoi ilmauksia DR5-proteiinin muiden mahalaukun syöpäsoluissa (SGC-7901 ja MGC-803).

Päätelmä /merkitys

Casticin tehostaa TRAIL: n indusoiman apoptoosin kautta downregulation solun selviytymisen proteiinien ja DR5 reseptorien kautta toimia ROS-ER stressi-CHOP-reitin.

Citation: Zhou Y, Tian L, Long L, Quan M, Liu F, Cao J (2013) Casticin voimistaa TRAIL: n indusoiman apoptoosin mahasyövän Cells kautta Endoplasmakalvosto Stress. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10,1371 /journal.pone.0058855

Editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 08 helmikuu 2013; Julkaistu: 11 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat projekti NSFC (numero 30760248), Project tieteellisen tutkimuksen Hunan hallinnon Bureau of Traditional Chinese Medicine (numero 2010081), Project tieteellisen tutkimuksen Hunan, Department of Education (numero 10C0975), Major hankeosion tieteellisen tutkimuksen Hunan Department of Education (numero 09A054) ja hankkeen tieteellisen tutkimuksen Changshan kaupunki Bureau of Science and Technology (numero K1104060-31). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Fructus Viticis
( Manjingzi
on kiinalainen nimi) eli hedelmä Vitex trifolia L.
(perhe Verbenaceae
) joka on perinteinen kiinalainen lääketiede käyttää anti-inflammatorisen aineen. Casticin on yksi aktiivisten komponenttien, jotka ovat peräisin Fructus Viticis
[1]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että casticin kykenee anti-karsinogeeninen rintojen [2], kohdunkaulan [3], eturauhas- [4], keuhko- ja paksusuolen syövän [5], [6], sekä mahasyövän [7] in vitro
. On myös raportoitu, että casticin estää niiden kasvun ihmisen myelooinen leukemia-solut [8], ja indusoi kuoleman leukemia solujen induktion joko apoptoosin tai mitoosi katastrofin [9].

Äskettäin edellinen työtä meidän lab osoitti, että vaikutus casticin apoptoosiin ihmisen maksasyövän solut on mukana DR5 reitin tilasta riippumaton p53: n [10]. On dokumentoitu, että CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin homologista proteiinia (CHOP), joka tunnetaan myös kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita geenin 153 (GADD153), suoraan säätelee DR5 niilmentymisen CHOP sitoutumiskohta 5-reunustavan alueen DR5-geenin [11], [12]. Me ja muut ovat raportoineet, että jotkin lääkkeet, kuten 5, 7-dimethoxyflavone ja dimetyyli-selekoksibi, indusoi DR5-ilmentymisen CHOP-riippuvaisen transaktivaation DR5-geenin [13] - [15]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet läheinen suhde Endoplasmakalvosto (ER) stressi ja DR5 ilme. ER stressin indusoituu taittamattomina proteiinit kerääntyvät ER ontelon [16]. Näyttää siltä, ​​että tämä vastaus voi aktivoida tiettyjä apoptoottisia reittejä poistamaan vakavasti vaurioitunut soluja, joissa proteiinia taitto vikoja ei voida ratkaista [17], [18]. Eri ER stressin indusoijat, kuten MG132 [12], tunikamysiinillä [19] ja thapsigargin [20], ovat toistuvasti osoitettu aiheuttavan DR5 ilmentymisen solujen pinnalla. Vaikka molekyylitason mekanismeja DR5 ilmentymistä ER stressin indusoijat saattavat vaihdella ärsykkeitä ja solutyyppejä, ER stressin indusoitavissa transkriptiotekijä, CHOP, on tarjonnut yhteys ER stressin ja DR5. Kuitenkin, onko casticin indusoi DR5-ilmentymisen mahasyövän soluissa, ja jos näin on, luonteesta molekyyli mekanismista ei tiedetä.

Tuore tutkimus on osoittanut, että tehokkaan tuumorinekroositekijä-α-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi ( TRAIL) -pohjaisen yhdistelmähoito voidaan saavuttaa säätelemällä DR4 ja DR5 ilmaisun, ja liittyy suoraan kasvainsolun mitokondrioita edistää niiden apoptoosin indusointiominaisuuksia [21]. Kyky mitokondrioita toimia välittäjänä apoptoosin säädeltyä jäsenet Bcl-2 superperheen [22]. Tukahduttaa anti-apoptoottisen proteiinin ekspressiota, jossa antisense-RNA: n tai siRNA: n, on osoitettu herkistää syöpäsolut TRAIL [23]. Tämän seurauksena, aineet, jotka säätelevät vaimentaen tällaiset anti-apoptoottiset proteiinit, kuten surviviinista, solu FADD-, kuten interleukiini-1β-konvertoivaa entsyymiä inhiboivaa proteiinia (cFLIP), Bcl-2 ja X-kromosomiin liittyvä apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP) voidaan mahdollisesti herkistää syöpä solujen apoptoottisen vaikutusten TRAIL [23], [24].

tässä tutkimuksessa, siksi olemme keskittyneet tutkii, onko casticin potentiates TRAIL aiheuttama syöpä solujen apoptoosin, ja jos on, miten casticin voimistaa tätä vaikutus. Olemme havainneet, että casticin voimistua TRAIL: n indusoiman apoptoosin säätelemällä DR5 kautta ROS-ER stressi-CHOP reitin ja vähen- tämisessä ilmentymistä solun eloonjäämisen proteiinien Bcl-2, XIAP, cFLIP, ja surviviinille mahalaukun syövän soluissa.

tulokset

Subtoxic pitoisuudet casticin selektiivisesti tehostaa TRAIL-indusoitua sytotoksisuutta mahasyövän soluissa

sytotoksisuus casticin ja TRAIL, yksin tai yhdistelmänä, tutkittiin ihmisen mahasyövän linjat BGC- 823, SGC-7901 ja MGC-803, määritettynä MTT-määritystä. Casticin ja TRAIL yksinään aiheuttanut sytotoksisuutta mahalaukun syöpäsolujen pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuviot 1A ja B). Lievä sytotoksisuus (< 20%) todettiin pienemmällä pitoisuutena casticin (1,0 umol /l, kuvio 1A). Mahahaavahoidon syöpäsolut 25-50 ng /ml TRAIL 24 tuntia indusoidun rajoitettu sytotoksisuus (< 20%). Kuitenkin co-mahahaavahoidon syöpäsolujen kanssa casticin (1,0 umol /l) ja TRAIL (25 ng /ml tai 50 ng /ml) lisääntyi merkittävästi sytotoksisia vaikutuksia verrattuna hoidon casticin tai TRAIL yksinään (kuvio 1 C).

Koska huomasimme, että yhdistetty hoito casticin ja TRAIL voimakkaasti aiheuttama sytotoksisuuden mahasyövässä soluissa, tutkimme seuraavaksi vaikutuksen kohtelu ikuisti ihmisen mahalaukun limakalvon epiteelisolujen linja GES-1. Mielenkiintoista on, että yhdistelmä casticin ja TRAIL ei aiheuttanut sytotoksisuutta GES-1-soluissa (kuvio 1 D) .Nämä tulokset osoittavat, että subtoxic pitoisuudet casticin selektiivisesti herkistynyt ihmisen mahasyövän solujen TRAIL-indusoidun sytotoksisuuden.

Subtoxic pitoisuuksia of casticin herkistävät mahalaukun syöpäsolujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin

sen tutkimiseksi, apoptoosin osallistuu solujen kasvua estävää yhteistyössä hoidon casticin ja TRAIL, ensin tutkittiin apoptoosin avulla virtaussytometrianalyysin havaitsemiseksi korotukset hypodiploid solussa populaatiot. Tuloksista ilmeni, että korko apoptoosin oli 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% ja 37,1 ± 4,9% (keskiarvo ± SD, n
= 3) ja casticin (1 umol /l), TRAIL (50 ng /ml) ja casticin plus TRAIL, vastaavasti (kuvio 2A). Sub-G1 väestön BGC-823-soluissa oli merkittävästi lisääntynyt 12 h, ja saavutti 24 h esikäsittelyn jälkeen 1 umol /l casticin seurasi 50 ng /ml TRAIL (kuvio 2B). Me seuraavaksi määritti histoni /DNA-fragmentti tasot mahasyövän solulinjojen BGC-823, SGC-7901 ja MGC-803 käyttämällä solun apoptoosin ELISA havaitseminen pakki. Kuvio 2C havainnollistaa, että yhdistelmähoito on casticin ja TRAIL synergistisesti aiheuttama histoni /DNA: n fragmentoituminen. Histoni /DNA-fragmentti tasot BGC-823 olivat koholla 12 h ja korkeimmillaan 24 h seuraavat yhteistyössä hoidon casticin (1 umol /l) ja TRAIL (50 ng /ml, kuvio 2D).

seuraava tutki caspases tosiasiassa aktivoituu induktion aikana apoptoottisen solukuoleman yhdistetyn hoidon casticin ja TRAIL mahalaukun syöpäsoluja. Hoito mahasyövälle solujen 1 umol /l casticin yksinään 24 tunnin ajan ei aiheuttanut kaspaasi-3, -8 ja -9. Vastauksena TRAIL (50 ng /ml), toiminta kaspaasi-3, -8 ja -9 ei muuttunut. Kuitenkin yhdistetty hoito casticin ja TRAIL indusoi kaspaasi-3 ja -8 ja hieman aktivoitu kaspaasi-9 (kuvio 2 E, F ja G).

myös tutkia, mitkä kaspaasi on erityisesti aktivoitu vastauksena casticin ja TRAIL hoitoon käytetään kaspaasi-inhibiittorit, kuten yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä zVAD-fmk kaspaasi-3-estäjän zDEVD-fmk kaspaasin 8 estäjä zIETD-fmk ja kaspaasi-9-estäjä zLEHD-fmk. Kuten on esitetty kuviossa 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk ja zIETD-fmk merkittävästi vähentynyt taso kaspaasi-3: lla indusoi yhdistetyllä hoitoon casticin ja TRAIL, mutta zLEHD-fmk oli lievä vaikutus. zVAD-fmk ja zIETD-fmk voi samanaikaisesti täysin estää kaspaasi-8 aktivaation, ja zDEVD-fmk osittain tukossa kaspaasi-8; kuitenkin, zLEHD-fmk oli vähän vaikutusta aktivaatiotilasta kaspaasi-8 (kuvio 2F). Vastaavasti, olemme huomanneet, että kaspaasi-9 hieman aktivoituu soluissa, joita käsiteltiin casticin ja TRAIL, mutta ei soluissa, joita käsiteltiin casticin ja TRAIL, kun läsnä on z-IETD-fmk, zVAD-fmk ja zLEHD-fmk (kuvio 2G). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että casticin lisäämällä TRAIL indusoi kaspaasi-8 aktivaatio ylävirtaan kaspaasi-9 aktivointi [10].

lopulta tutki, casticin voisivat tehostaa TRAIL-indusoitua PARP lohkominen ja havaitsi, että casticin tehostettu TRAIL aiheuttama kasvu PARP lohkaisu BGC-823 ja SGC-7901-soluissa (kuvio 2 H). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että subtoxic pitoisuus casticin parantaa TRAIL-indusoitua apoptoosia mahalaukun syöpäsoluja.

Casticin indusoi DR5 mahasyövän soluissa

Apoptosis maksasolusyövän indusoiman casticin oli mukana DR5 ylösajon [10]. Siksi me käsiteltiin BGC-823-solujen casticin 24 tuntia ja käytetään sitten western blot-analyysi tutkia solujen TRAIL-reseptorin ekspressiota. Casticin lisääntynyt DR5 ilmentymistä pitoisuudesta riippuvalla tavalla, mutta ei vaikuttanut DR4 ilmaisun eikä DcR1 tai DcR2 induktio (kuvio 3A). DR5- ilmentymisen casticin tapahtui 6 h ja saavutti 24 h (kuvio 3B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että DR5 säätelyä on ehdokas mekanismi, jonka kautta casticin tehostaa apoptoottista vaikutusta TRAIL BGC-823 soluja.

Voit selvittää, onko DR solun pinnalla oli mukana apoptoosin induktio casticin, solun pinnan DR5 ja DR4 havaittiin käyttämällä virtaussytometria. Sen jälkeen solu altistuminen casticin (1,0 umol /l), taso DR5 solun pinnalla nostettiin (kuvio 3C). Kuitenkin, casticin ei vaikuttanut tasoon DR4 ilmentymisen (kuvio 3D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että casticin makkaasti DR5 solun pinnalla.

Onko DR5 mukaan casticin on spesifinen BGC-823-solut tai esiintyy myös muilla mahasyövän solulinjoja, tutkittiin myös. Casticin aiheuttama DR5 ilmentymistä mahasyövässä SGC-7901 ja MGC-803 solulinjoissa, mutta ei ollut ilmeisiä vaikutuksia sen ilmentymistä immortalisaatioon mahan limakalvoa GES-1-solulinjassa (kuvio 3E). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että DR5 mukaan casticin ei ole spesifinen tietyntyyppiselle mahalaukun syöpäsolun.

DR5 induktion casticin vaaditaan parantamiseksi TRAIL aiheuttaman apoptoosin BGC-823-solujen

roolin määrittämiseksi DR5 reseptorien parantamiseksi TRAIL-indusoidun apoptoosin casticin, käytimme siRNA spesifisiä DR5 säädellä vähentä- västi sen ekspression. Solujen transfektio siRNA DR5 mutta ei ohjaus siRNA vähentää casticin aiheuttama DR5 ilmentymisen.

Sen tutkimiseksi, onko DR5 ilmentymisen lisääntyminen liittyy casticin-avusteinen TRAIL-indusoitua mahalaukun solujen apoptoosia, virtaussytometria-analyysiä käytettiin tutkimaan, onko suppressio DR5-ilmentymisen siRNA voisi vaikutuksia vaimentavat casticin on TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Kuvio 4B osoittaa, että vaikutus casticin on TRAIL: n indusoiman apoptoosin alentaa tehokkaasti soluissa, jotka on transfektoitu DR5 siRNA, kun taas solut, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA eivät muutu. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että DR5- on kriittinen herkistymistä kasvainsolujen vaikutuksia casticin in TRAIL-indusoitua apoptoosia.

Casticin aiheuttama DR5 säätelyä välittyy induktion CHOP BGC-823-soluja

CHOP-välitteisen DR5 on osoitettu [11] - [15]; Näin ollen, tutkimme seuraavaksi, miten tämä transkriptiotekijän saattaa olla mukana casticin aiheuttama DR5 säätelyä. Kuvio 5A osoittaa, että casticin indusoi CHOP ilmaisu, joka tapahtui rinnan kasvua DR5 ekspression.

testaamiseksi rooli CHOP casticin aiheuttama ylössäätely DR, geenien CHOP siRNA on käytetty. Transfektion CHOP siRNA suppressoi merkittävästi casticin aiheuttama DR5 säätelyä (kuvio 5B), kun taas casticin upregulated ilmentymistä DR5 ei-transfektoiduissa ja valvonta-transfektoitu (salattu RNA) solu.

seuraavaa käyttöä virtaussytometria-analyysiä tutkittava tukahduttamista CHOP siRNA vaimenee herkistävän vaikutuksia casticin on TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Transfektio CHOP siRNA merkittävästi vähentää vaikutuksia (vuodesta 37,1 ± 5,3%: sta 13,5 ± 1,3%, keskiarvo ± SD, n
= 3) casticin plus TRAIL: n indusoiman apoptoosin (kuvio 5C), kun taas käsittely ohjaus siRNA ei ollut vaikutusta (kuvio 5C). Nämä tulokset osoittavat, että CHOP osallistuu DR5 ylösajon ja edistää herkistävän vaikutuksen casticin on TRAIL: n indusoiman apoptoosin meidän kokeellisessa mallissa.

Casticin aiheuttama Endoplasmakalvosto (ER) stressi mahalaukun syöpäsoluissa

on tunnettua, että ER aiheuttaa ER stressiä markkeriproteiinien (kuten GRP78 ja fosfo-eIF2α), joka säätelee lisäävästi ilmentymistä CHOP [12], [19], [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa, vaikutus casticin ilmenemistä ER stressin markkeriproteiinien tutkittiin. Tuloksemme osoittavat, että casticin todellakin indusoi kaikkien näiden merkkiaineiden ER stressin BGC-823-soluja (kuva 6A). Sen määrittämiseksi, onko ER stressi on osallisena voimistaa casticin on indusoiman apoptoosin TRAIL, salubrinal, estäjä ER-stressi, käytettiin. Salubrinal (50 mikromol /l) merkitsevästi suojattu BGC-823 soluja aiheuttamaa apoptoosia yhteistyössä soveltamista casticin ja TRAIL (kuvio 6B).

Testasimme myös, muuttaako BGC-823-solujen kanssa Endoplasmakalvosto (ER) stressi indusoija, tunikamysiinille [25], voisi nostaa DR5 tasoilla ja parantamaan TRAIL aiheuttama apoptoottisen solukuoleman. Huomasimme, että tunikamysiinillä (3,0 umol /l) aikariippuvainen lisäsi proteiinin tasot DR5, p-eIF2α, GRP78 ja CHOP, in BGC-823-solut (kuvio 6C). Yhteiskäsittely tunikamysiinillä (3,0 umol /l) ja TRAIL (50 ng /ml) lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus osa-G1 vaiheeseen verrattuna tunikamysiinillä tai TRAIL yksinään (kuvio 6D). Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että ER-stressi osallistuu tehostava vaikutus casticin on indusoiman apoptoosin TRAIL.

Casticin aiheuttama DR5 säätelyä ja apoptoosin voimistumista ovat ROS-riippuvaisia ​​BGC-823-solujen

Olemme viime aikoina osoittaneet, että 5, 7-dimethoxyflavone selektiivisesti tehostaa TRAIL: n indusoiman apoptoosin ROS stimuloi ER-stressi käynnistävät CHOP-välitteisen DR5 säätelyyn ylöspäin maksasyövän soluihin [15]. Meillä on siis tutkittava, onko casticin indusoi ROS tuotanto. 2 '7'-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DFCH-DA) käytettiin koettimena mitata mahdollinen kasvu ROS tasoilla soluissa. Kokeet, paljasti, että tasot ROS lisättiin aluksi Ladbrokes.comissa

1 h, saavutti huippunsa 3 h ja kesti jopa 24 tuntia hoidon jälkeen 1,0 mikromol /l casticin (kuvio 7A). Casticin aiheuttamaa ROS tuotanto pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 7B).

tulkita suhdetta ROS sukupolvi ja CHOP-riippuvaisten DR5 induktio, me tutki ROS säätelee casticin aiheuttama TRAIL reseptoreihin ja CHOP läsnäollessa ja puuttuessa N
-acetylcysteine ​​(NAC), joka on scavenger hapen vapaita radikaaleja. Huomasimme, että solujen esikäsittely NAC vähensi casticin aiheuttama DR5 ja CHOP ilmaisu (kuvio 7C).

Seuraavaksi, tutkimme ROS näyttelee roolia casticin aiheuttama TRAIL voimistumisen. Kuten on esitetty kuviossa 7D, casticin merkittävästi parannettu TRAIL-indusoitua apoptoosia in BGC-823-solut ja solujen esikäsittely NAC merkittävästi alentunut casticin indusoimaa apoptoottista solukuolemaa parannuksen 52,4 ± 3,3%: sta 8,2 ± 0,8%, (keskiarvo ± SD, n = 3) viittaa siihen, että ROS on ratkaiseva rooli vaikutukset välittyvät casticin in TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

Casticin downregulates ilmentymistä erilaisten solun eloonjäämisen proteiinien BGC-823 solut

on raportoitu, että useat anti-apoptoottiset proteiinit, kuten surviviini, cFLIP, XIAP, Bcl-2 ja Bcl-x L voi säädellä TRAIL-indusoidun apoptoosin [25], [26]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet, ovatko tietyt tunnistetut solujen eloonjäämistä proteiinit olivat mukana tehostava vaikutus casticin on indusoiman apoptoosin TRAIL. BGC-823-solut altistettiin eri pitoisuuksia casticin 24 tuntia ja sitten tutkittiin Bcl-x L, Bcl-2, surviviini, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (solujen apoptoosi-inhibiittori-proteiinin 1) ja TRAF1 (TNF reseptoriin liittyvän kerroin 1) ilmaisua. Casticin inhiboi Bcl-xL: n, Bcl-2, surviviini, cFLIP ja XIAP ilmentymistä (kuvio 8A). Vaikutukset casticin ilmentymiseen Bcl-xL: n, Bcl-2, surviviini, XIAP ja cFLIP oli dramaattinen, kun taas downregulation CIAP-1 ei ole kovin voimakas. Nämä tulokset viittaavat siihen, että downregulation solun eloonjäämisen proteiinien on yksi niistä mekanismeista, ajo tehostava vaikutus casticin on indusoiman apoptoosin TRAIL.

seuraava tutkittava, onko casticin voisi ilmentymisen moduloimiseksi pro-apoptoottisten proteiinien. Huomasimme, että casticin dramaattisesti voimistunut ilmentyminen Bax pitoisuutena riippuvalla tavalla (kuvio 8B). Casticin myös lisääntynyt pilkkominen Bid konsentraatiosta riippuvalla tavalla, kuten on esitetty lasku ilmentymisen Bid-proteiinin (kuvio 8B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että casticin voi samanaikaisesti aktivoida luontainen mitokondrioiden välittämä reitti ja ulkoisten DR aiheuttama reitin osoituksena katkaistun pro- apoptoottisen proteiinin Bid.

Keskustelu

Tässä kyselyn, tutkimme kykyä casticin, joka on polymethoxyflavone johdettu Fructus Viticis
, moduloida TRAIL signalointia mahalaukun syöpäsoluissa, ja meidän havainnot viittaavat siihen, että casticin potentiates TRAIL aiheuttaman apoptoosin mahasyövässä BGC-823, SGC-7901 ja MGC-803-soluissa (1) asiakkuutta DR5 ilmaisun ja (2) downregulatin solun selviytymisen proteiinien liittyy tuumorisolujen vastustuskyky TRAIL. Casticin DR5 näyttää välittävän aktivaation kautta ROS-ER stressi-CHOP-reitin (kuvio 9).

Olemme osoittaneet, että casticin indusoi DR5 ilmentymistä mahan syöpäsoluja. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aiempien työn [10], raportoimme, että apoptoottinen vaikutus casticin ihmisen maksasyövän solut on mukana DR5 ylösajon mutta he eivät käsitellä kysymyksiä siitä casticin voi parantaa TRAIL: n indusoiman apoptoosin tai mekanismi herkistymistä. Tässä olemme osoittaneet, että DR5 upregulation on kriittinen herkistymistä solujen TRAIL, kuten geenien reseptorin (DR5) heikennettyä TRAIL-indusoitua apoptoosia. Siten DR5 ylössäätöä voi herkistää soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin [27]. Lukuisia mekanismeja on kuvattu induktion DR, kuten ROS: n syntyminen, p53 induktio, ja NF-KB: n, DDIT3 (DNA-vaurioita-indusoituva transkriptio 3), peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori-γ ja MAPK aktivointi [27], [28] . Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että casticin indusoi CHOP ja geenien CHOP siRNA estää vaikutus casticin induktioon DRS ja TRAIL-indusoitua apoptoosia. Meidän havainnot ovat samanlaisia ​​kuin muissa tutkimuksissa, jotka osoittivat, että CHOP sitoutuu DR5 promoottori ja ylössäätelee tämän reseptorin ilmentymisen [12], [29].

On hyvin tiedossa, että CHOP on tyypillinen ER stressiä säädelty proteiinia, joka liittyy ER stressin indusoiman apoptoosin [11]. Meidän havainto CHOP induktion casticin viittaa siihen, että casticin voivat laukaista ER stressiä ja lisätä ekspressiotasot GRP78 ja eIF2α, jotka täydentävät proteiinien kertynyt tai kasvoi ER stressin [17]. Siksi näyttää todennäköiseltä, että casticin aiheuttaa ER stressiä. Salubrinal on selektiivinen ER stressin indusoiman apoptoosin [30]. Läsnäolo salubrinal ilmeisesti suojattu mahan syöpäsolujen casticin sekä TRAIL-indusoitua apoptoosia. Siten näyttää siltä, ​​että casticin indusoi apoptoosia voimistumista ottamalla ER stressin mekanismeja.

Huomasimme, että ehkä tärkeintä ylävirran signaali liittyy casticin modulaatioon TRAIL-reseptorien on ROS. Tuloksemme osoittavat yksiselitteisesti, että casticin indusoi tuotanto ROS, ja että sammutus ROS että antioksidantti N
-acetylcysteine ​​heikennetty vaikutus casticin induktioon CHOP ja DR5. Huomasimme, että sammuttamaan ROS myös heikennettyjä casticin voimistumisen TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Meidän havainnot ovat yhtäpitäviä raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa käyttäen sulforaphane, zerumbone ja Celastrol DR5 induktioon. Tulokset läsnä ja aikaisempien tutkimusten vahvasti siihen, että ROS on merkittävä rooli moduloinnissa TRAIL reseptorin DR5 [31], [32]. Tuloksemme ovat yhtäpitäviä edellisen työn raportoimme että casticin aiheutti kertyminen sub-G1 soluihin ja lisääntynyt ROS tuotanto HeLa, CaSki- ja SiHa solulinjoissa, mutta ei PBMC [33]. Mutta osoitimme, että casticin vähensi GSH pitoisuus ( P < 0,05
), mutta ei vaikuttanut tasoon solunsisäisten ROS PLC /PRF /5 ja Hep G2 soluihin [10]. Todennäköinen selitys näennäinen tietojen konflikti on, että on eroja liikennemuotojen jotka säätelevät toimet eri solutyyppejä.

Havaitsimme myös, että muut mekanismi herkistymistä liittyy sääntely Antiapoptoottisten proteiineja. Casticin vaimentua ilmaisu elevels Bcl-2, Bcl-x L, XIAP ja surviviini, jotka kaikki on liitetty kasvainsolun vastustuskyky TRAIL [34], [35]. Itse asiassa, downregulation XIAP, Bcl-2 ja Bcl-x L ilmentymisen on osoitettu herkistää kasvainsolut TRAIL [36], [37]. Wang et al.
(2005) [8], osoitti, että casticin laski Bcl-2: n ilmentymisen tasoja ja vaimentua suhde Bcl-2 /Bax ilmentymistä K562-soluissa. Tuloksemme ovat myös yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittivat, että etanolin ote kuivattuja kypsiä hedelmiä siveydenpuu
laski tasolle Bcl-2, Bcl-x L ja Bid proteiinia, ja lisääntynyt taso Bax-proteiinin [7]. Raportissa Chen et al.
(2011) osoittivat äskettäin, että Bax oli voimistunut, kun taas ekspressiotasot Bcl-x L ja XIAP olivat vaimentua by casticin [33].

Kobayakawa et al. raportoitu, että casticin inhiboivat merkittävästi kasvua KB-solujen, mutta ei inhiboimaan A431-solujen, joka on samanlainen normaali solulinjojen 3T3 Swiss Albino ja TIG-103 [38]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että casticin erityisesti indusoitua apoptoosia ihmisen mahasyövän soluissa, mutta ei GES-1-soluissa, vaikka mekanismi selektiivisen apoptoosin induktio ei ole määritetty. Tuloksemme viittaavat siihen, että casticin voi olla erityinen kasvainten vastaisen aineen, joilla on alhainen toksisuus.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että casticin edistää herkkyyttä kasvainsolujen Trail käyttämällä useita mekanismeja. Casticin aluksi edistää ROS sukupolvi ja laukaisee ER stressiä sitten indusoi DR5 upregulation aktivoimalla CHOP jotka näin ollen tehostaa TRAIL aiheuttama aktivointi DR5: n indusoiman ja mitokondrioiden välittämän apoptoosin reittejä. Samanaikaisesti casticin helpottaa TRAIL aiheuttama apoptoottisen solukuoleman estämällä anti-apoptoosin proteiinin ilmentymisen ja aktivointi pro-apoptoosin proteiineja. Tulevaisuuden tutkimukset olisi pyrittävä toteuttamaan täysipainoisesti yhdistelmän casticin ja TRAIL hoitoa potilaille, joilla on mahalaukun syöpä. Siksi lisätutkimusten toimien casticin eläinmalleissa tarvitaan.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Casticin (puhtaus ≥ 98%) hankittiin Chengdu Biopurify phytochemicals Ltd (Chengdu, Kiina), läsnä keltaisina kiteinä (molekyylipaino, 374,3). Casticin liuotettiin dimetyylisulfoksidissa (DMSO), jotta 10 mmol /l kantaliuos ja laimennetaan soluviljelyväliaineessa on vaadittu pitoisuus välittömästi ennen käyttöä. Seuraavat reagenssit hankittiin Hunan Clonetimes Biotech Co Ltd (Changsha, Kiina): liukoinen rekombinantti ihmisen TRAIL (Pepro Tech), solukuoleman ELISA Detection Kit (Roche), 2 ', 7'-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA; Molecular Probes Inc), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-asetyylikysteiini (NAC; Sigma), tunikamysiini (Sigma), propidiumjodidi (PI, Sigma), kaspaasi 3 Activity Detection Kit (Millipore), Kaspaasi 8 Kolorimetrinen Activity Assay Kit 25 (Millipore), kaspaasi 9 kolorimetrinen Activity Assay Kit (Millipore), vasta-ainetta vastaan ​​DR5 (ProSci Inc). Vasta-aineita DR4, PARP, Bcl-2, Bax, Bid surviviiniperäiset, CHOP, GRP78 ja ATF4 saatiin Santa Cruz Biotechnology. Anti-XIAP-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology, Danvers, Yhdysvallat. Caspase estäjät, kuten zVADfmk, zDEVD-fmk zIETD-fmk ja zLEHD-fmk ostettiin R &D Systems (Minneapolis, MN).

Soluviljely

BGC-823, SGC -7901 ja MGC-803 ihmisen mahasyövän soluja saatiin Kiinasta keskuksen Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, Kiina) ja GES-1 soluja syöpäinstituutti Pekingin yliopistossa. Soluja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä: ssa kosteutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO _{2 37 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla casticin tai TRAIL tai molemmat MTT-määritys. Casticin (1,0 umol /l) ja TRAIL (25, 50 ng /ml) yksinään tai yhdistelmänä levitettiin BGC-823-soluja käytetään havaitsemaan apoptoosia.}

MTT-määritystä

Solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 0,5104 solua /kuoppa ja inkuboitiin 24 tuntia, minkä jälkeen seuraa käsittely eri pitoisuuksilla casticin ja TRAIL 24 h tai käsitelty casticin 12 h, minkä jälkeen käsitellään TRAIL vielä 24 tuntia. MTT kolorimetrinen analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [10]. IC _{50-arvo, jossa 50% solujen kasvun esto verrattuna dimetyylisulfoksidiin (DMSO) kontrolli, laskettiin epälineaarisella regressioanalyysillä käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston (San Diego, CA).}

Flow cytometry käyttäen PI-värjäystä

solut ympättiin tiheydellä 4 x 10 ^{6 solua /ml 100 ml: n viljelypulloissa 24 tuntia ja käsiteltiin sitten alustalla, joka sisälsi eri konsentraatioita casticin tai TRAIL tai molempia yhdessä että ilmoitettu kertaa. -Solujen apoptoosin havaittiin käyttäen virtaussytometrillä (FCM; American BD Company, FACS 420).}

histoni /DNA-fragmentti-ELISA

-solujen apoptoosin ELISA detektioreagenssipakkaus käytettiin havaitsemaan apoptoosia soluissa, joita käsiteltiin casticin mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 1 x 10 ^{4 solua /kuoppa 24 tunnin ajan, ja alustaa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia casticin lisätään tarvittaessa. 24 tunnin jälkeen sytoplasmassa ja kontrolliryhmiin siirrettiin 96-kuoppalevylle peridiumed että streptavidiini, inkuboitiin biotinyloidun histoni-vasta-ainetta ja peroksidaasilla merkittyä hiiren anti-ihmis-DNA: ssa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Absorbanssi 405 nm: ssä mitattiin ERI-800 tyypin Enzyme-Linked Immunosorbent laite.}

Analyysi kaspaasi-3, -8 ja -9 toimintaa

toiminta kaspaasi-3, -8 ja -9 arvioitiin käyttämällä kaspaasi 3 Activity Detection Kit, kaspaasi 8 Kolorimetrinen Activity Assay Kit 25 ja kaspaasi 9 Kolorimetrinen Activity Assay Kit, vastaavasti. Lyhyesti, solujen lysaatit valmistettiin jälkeen niiden hoidon kokeellista aineilla. Kokeet suoritettiin 96-kuoppalevyillä inkuboimalla 20 ug solulysaattien 100 ui reaktiopuskuria (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 10% glyserolia), joka sisälsi 5 uM ja kaspaasi-3: substraatti Ac-DEVD- p
NA, kaspaasi-8 substraatti Ac-IETD- p
NA tai kaspaasi-9 substraatti Ac-LEHD- p
NA. Lysaatit inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia.

• PLoS ONE: vaiheen II tutkimus, jossa arvioitiin 2 Annostusaikataulut Oral Foretinib (GSK1363089), cMET /VEGFR2 Inhibitor, metastasoituneen mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: Association between vähentäminen Plasma Adiponectin tasot ja vaara bakteeritartunta jälkeen mahasyövän Surgery