PLoS ONE: Casticin потенцирует TRAIL-индуцированный апоптоз клеток рака желудка через эндоплазматический ретикулум Stress

Абстрактный

Фон
<р> Casticin является одним из основных активных компонентов, полученных из Fructus Viticis
и было сообщено оказывать анти-канцерогенной активностью на различных раковых клеток, но точный механизм, лежащий в основе этой деятельности остается неясным.

материалы и методы
<р> Апоптотическая деятельность casticin (1,0 мкмоль /л) и TRAIL (25, 50 нг /мл) в отдельности или в комбинации в желудочном линиях раковых клеток BGC-823, СГК-7901 и MGC-803 были обнаружены с использованием набора для обнаружения ELISA с апоптоза клеток, проточной цитометрии ( ТСМ) с пропидийиодидом (PI) окрашивание и деятельности каспазы-3, -8 и -9 с помощью ELISA и расщепления polyADP-рибоза полимеразы (PARP) белка с использованием Вестерн-блоттинга. Рецепторы смерти (DR) уровни экспрессии были оценены с помощью анализа ТСМ и Вестерн-блоттинга. 2 ', 7'-дихлорфлуоресцеина диацетат (DCFH-DA), был использован в качестве зонда для измерения увеличение активных форм кислорода уровни (ROS) в клетках. Многочисленные мероприятия, такие как миРНК трансфекции и фармакологических ингибиторов были использованы для изучения механизмов этих действий.

Результаты
<р> субтоксические концентрации casticin значительно потенциирующие TRAIL-индуцированная цитотоксичность и апоптоз в КУП-823, SGC-7901 и клетки MGC-803. Casticin резко усиливает свою активность экспрессию рецептора DR5, но не имел никакого влияния на DR4 или рецепторов-ловушек. Удаление DR5 по миРНК значительно уменьшил апоптоз, индуцированный совместным применением TRAIL и casticin. Джин глушителей из CCAAT /энхансер связывание белка гомологичного белка (ЧОП) и предварительной обработки с salubrinal, ингибитор стресс эндоплазматической сети (ER), ослабляется экспрессию casticin индуцированных рецептора DR5 и апоптоз и производство ROS. Casticin подавляются уровни экспрессии белков выживания клеток cFLIP, BCL-2, XIAP и сурвивина. Кроме того, casticin также индуцируется выражения белка DR5 в других клеток рака желудка (SGC-7901 и MGC-803).

Заключение /Значение
<р> Casticin усиливает TRAIL-индуцированный апоптоз через понижающей белков выживания клеток и повышающую регуляцию рецепторов DR5 через действия на РОС-ER стресс-CHOP пути
<р> Цитирование:. Чжоу Y, Тянь-L, L Long, Quan M, F Лю, Цао J (2013) Casticin потенцирует TRAIL-индуцированный апоптоз клеток рака желудка через стресса эндоплазматического ретикулума. PLoS ONE 8 (3): e58855. DOI: 10.1371 /journal.pone.0058855
<р> Редактор: Kaustubh Датта, Университет штата Небраска медицинский центр, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступила: 11 июня 2012 года; Принято от: 8 февраля, 2013 года; Опубликовано: 11 марта 2013
<р> Copyright: © 2013 Чжоу и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке проекта NSFC (номер 30760248), проект научных исследований провинции Хунань администрации Бюро традиционной китайской медицины (номер 2010081), проект научных исследований провинции Хунань, Департамент образования (количество 10C0975), майор Проект Пункт научных исследований провинции Хунань Департамент образования (номер 09A054) и проект научных исследований Чанша городского бюро по науке и технике (номер K1104060-31). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

Fructus Viticis
( Manjingzi
это китайское название), а именно плоды Витэкс trifolia L.
(семейство Verbenaceae
) что является традиционной китайской медицине используется в качестве противовоспалительного средства. Casticin является одним из активных компонентов, полученных из Fructus Viticis
[1]. Многие исследования показали, что casticin оказывает анти-канцерогенной активностью при раке молочной железы [2], шейки матки [3], простаты [4], легких и рака толстой кишки [5], [6], а также при раке желудка [7] в пробирке
. Кроме того, было сообщено, что casticin ингибирует рост миелоидной лейкемии клеток человека [8] и вызывает гибель лейкозных клеток путем индукции апоптоза либо или митотической катастрофы [9].

В последнее время предыдущей работы с в нашей лаборатории показали, что эффект casticin на апоптоз клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека участвует в DR5 пути независимо от статуса p53 [10]. Документально доказано, что CCAAT /энхансер-связывающий белок, гомологичные белок (ЧОП), также известный как остановки роста и гена повреждений ДНК, 153 (GADD153), непосредственно регулирует экспрессию DR5 через сайт связывания CHOP в 5-фланкирующей области гена DR5 [11], [12]. Мы, и другие, сообщили, что некоторые лекарственные средства, такие, как 5, 7-диметоксифлавон и диметил-целекоксиб, индуцируют экспрессию DR5 через CHOP-зависимой трансактивации гена DR5 [13] - [15]. Кроме того, некоторые исследования показали тесную связь между эндоплазматической сети (ER) стресс и экспрессии DR5. ER стресс вызывается, когда развернутые белки накапливаются в ER просвет [16]. Кажется, что этот ответ может активировать конкретные пути апоптоза устранить сильно поврежденные клетки, в которых сворачивания белка дефекты не могут быть решены [17], [18]. Различные ER стресс индукторы, такие как MG132 [12], туникамицина [19] и тапсигаргин [20], последовательно индуцируют экспрессию DR5 на поверхности клеток. Хотя молекулярные механизмы экспрессии белка DR5 с помощью ER стресса индукторов может меняться в зависимости от стимулов и типов клеток, ЭР стресс-индуцируемый фактор транскрипции, измельчить, обеспечил связь между ER стресса и DR5. Тем не менее, является ли casticin индуцирует экспрессию DR5 в раковых клетках желудка и, если да, то характер молекулярного вовлеченного механизма неизвестна.
<Р> Недавнее исследование показало, что эффективный фактор некроза опухоли-α, связанных с апоптозиндуцирующая лиганд ( TRAIL) основе комбинированной терапии может быть достигнута путем повышающей регуляции экспрессии DR4 и DR5, и непосредственно нацеливание опухолевых клеток митохондрии, чтобы стимулировать их апоптозиндуцирующая свойства [21]. Способность митохондрий опосредовать апоптоз жестко регулируется членами надсемейства Bcl-2 [22]. Подавляя антиапоптозную экспрессию белка, с антисмысловой РНК или миРНК, было показано, повышать чувствительность раковых клеток к TRAIL [23]. В результате, агенты, которые подавляют такие анти-апоптотических белков в качестве сурвивин, клеточной FADD-как интерлейкин-1β-превращающего фермента ингибирующий белок (cFLIP), Bcl-2 и Х-хромосомой ингибитор апоптоза белка (XIAP) может потенциально повышать чувствительность рака клетки к апоптотических эффектам TRAIL [23], [24].
<р> В настоящем исследовании, поэтому мы сосредоточились на исследовании потенцирует ли casticin TRAIL-индуцированный апоптоз раковых клеток, и если да, то как casticin потенцирует это эффект. Мы обнаружили, что casticin потенциируется TRAIL-индуцированный апоптоз путем повышающей регуляции DR5 через РОС-ER стресс-CHOP пути и downregulating экспрессию белков выживания клеток BCL-2, XIAP, cFLIP и сурвивина в раковых клетках желудка.

Результаты

субтоксические концентрации casticin селективно усиливает TRAIL-индуцированной цитотоксичности в раковых клетках желудка
<р> цитотоксичность casticin и TRAIL, отдельно или в комбинации, исследовали в желудочном линиях рака человека BGC- 823, СГК-7901 и МГЦ-803, как определено с помощью анализа МТТ. Casticin и волоков в одиночку вызвали цитотоксичности клеток рака желудка, в зависимости от концентрации (1А и В). наблюдалось при более низкой концентрации casticin (1,0 мкмоль /л, рис 1А); Незначительные цитотоксичность (20% &л). Лечение клеток рака желудка с 25-50 нг /мл TRAIL в течение 24 ч, индуцируемых ограниченную цитотоксичность (&лт; 20%). Тем не менее, совместное лечение клеток рака желудка с casticin (1,0 мкмоль /л) и TRAIL (25 нг /мл или 50 нг /мл) заметно возросшую цитотоксические эффекты по сравнению с лечением с casticin или TRAIL в одиночку (рис 1C).

Так как мы обнаружили, что комбинированное лечение с casticin и TRAIL сильно индуцированной цитотоксичности в раковых клетках желудка, мы затем исследовали влияние лечения на увековеченный человека слизистую оболочку желудка эпителиальной клеточной линии GES-1. Интересно отметить, что сочетание casticin и TRAIL не индуцирует цитотоксичность ГЭС-1 клеток (рис 1D) .Эти результаты показывают, что субтоксические концентрации casticin селективно сенсибилизированные рака желудка клетки человека к TRAIL-индуцированной цитотоксичности.

концентрации субтоксические из casticin сенсибилизировать клеток рака желудка к TRAIL-индуцированного апоптоза
<р> чтобы исследовать, является ли апоптоз участвует в ингибировании роста клеток после совместного лечения с casticin и TRAIL, мы сначала исследовали апоптоз с помощью анализа проточной цитометрии для обнаружения увеличения в гиподиплоидных клетки популяции. Результаты показали, что скорость апоптоза была 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% и 37,1 ± 4,9% (среднее ± стандартное отклонение, <ет> п
= 3) для casticin (1 мкмоль /л), TRAIL (50 нг /мл) и casticin плюс TRAIL, соответственно (рис 2А). Суб-G1 популяция клеток КУП-823 была значительно увеличена на 12 ч, и достиг максимума через 24 ч после предварительной обработки с 1 мкмоль /л casticin затем 50 нг /мл TRAIL (Фигура 2В). Далее мы определили уровни фрагмента гистонов /ДНК желудка линий раковых клеток BGC-823, SGC-7901 и MGC-803 с использованием набора обнаружения ELISA апоптозом клеток. Рисунок 2C показывает, что комбинированное лечение casticin и TRAIL синергически индуцированной фрагментации гистона /ДНК. Уровни фрагмент гистон /ДНК BGC-823 были повышены через 12 ч и достиг максимума через 24 ч после совместного лечения с casticin (1 мкмоль /л) и TRAIL (50 нг /мл, рис 2D).
<Р> Мы следующий исследовали, были ли на самом деле активируется каспазы во время индукции апоптотической гибели клеток при комбинированном лечении с casticin и TRAIL в клетках рака желудка. Лечение желудочной раковых клеток только в течение 24 ч 1 мкмоль /л casticin не вызывает никакой активности каспазы-3, -8 и -9. В ответ на TRAIL (50 нг /мл), деятельность каспазы-3, -8 и -9 не изменилась. Тем не менее, комбинированное лечение casticin и TRAIL индуцирует активацию каспазы-3 и -8 и слегка активированного каспазы-9 (рис 2 E, F и G).
<Р> Мы также исследовали, который каспазы специфически активируется в ответ на casticin и лечение TRAIL с использованием ингибиторов каспазы, включая ингибитор пан-каспазы zVAD-финляндских марок, ингибитор каспазы-3 zDEVD-финляндских марок, ингибитор каспазы-8 zIETD-финляндских марок и каспазы-9 ингибитора zLEHD-финляндских марок. Как показано на рисунке 2Е, zVAD-финляндских марок, zDEVD-финляндских марок и zIETD-финляндских марок значительно снижает уровень активности каспазы-3, индуцированного комбинированного лечения casticin и TRAIL, но zLEHD-ФМК имел небольшой эффект. zVAD-ФМК и zIETD-ФМК могут одновременно полностью блокировать активацию каспазы-8, и zDEVD-ФМК частично блокировали активацию каспазы-8; Тем не менее, zLEHD-ФМК было мало влияет на состояние активации каспазы-8 (рис 2F). Соответственно, мы обнаружили, что каспазы-9 слегка активируется в клетках, обработанных casticin и TRAIL, но не в клетках, обработанных casticin и TRAIL в присутствии г-IETD-финляндских марок, zVAD-финляндских марок и zLEHD-финляндских марок (рис 2G). Итак, эти результаты свидетельствуют о том, что casticin с добавлением TRAIL индуцирует активацию каспазы-8 перед активацией каспазы-9 [10].
<Р> Наконец, мы исследовали, может ли casticin усилить TRAIL-индуцированное расщепление PARP и обнаружили, что casticin усиливается TRAIL-индуцированное увеличение PARP расщепления в BGC-823 и SGC-7901 клеток (рис 2H). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что субтоксические концентрация casticin усиливает TRAIL-индуцированный апоптоз клеток рака желудка.

Casticin индуцирует экспрессию DR5 в раковых клетках желудка
<р> Апоптоз клеток гепатоцеллюлярной карциномы, индуцированных casticin принимал участие в DR5 повышающей регуляцией [10]. Таким образом, мы обрабатывали клетки КУП-823 с casticin в течение 24 ч, а затем использовали вестерн-блот анализ, чтобы исследовать клетки для экспрессии рецептора TRAIL. Casticin повышенную экспрессию DR5 в зависимости от концентрации, но не оказывает влияния на экспрессию DR4, ни DcR1 или DcR2 индукции (рис 3А). Индукция экспрессии DR5 на casticin произошел в 6 ч и достиг максимума в 24 ч (рис 3б). Эти данные позволяют предположить, что DR5 повышающая регуляция является кандидатом механизм, через который casticin усиливает апоптотических эффекты TRAIL в клетках BGC-823.
<Р> Для того, чтобы определить, была ли задействована DR на клеточной поверхности в индукции апоптоза casticin, выражение клеточной поверхности DR5 и DR4 наблюдали с использованием проточной цитометрии. После экспозиции клеток до casticin (1,0 мкмоль /л), уровень DR5 на клеточной поверхности была увеличена (3С). Однако casticin не оказывает влияния на уровень экспрессии DR4 (рис 3D). В совокупности эти результаты указывают на то, что casticin повышает экспрессию DR5 на клеточной поверхности.
<Р> ли повышающая регуляция DR5 по casticin специфична для клеток КУП-823 или же имеет место и в других желудочных линиях раковых клеток, также была исследована. Casticin индуцированной экспрессии DR5 при раке желудка SGC-7901 и MGC-803 клеточных линий, но не имеют очевидные последствия для его экспрессии в увековечении слизистой оболочке желудка ГЭС-1 клеточной линии (рис 3Е). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что позитивная регуляция DR5 на casticin не является специфическим для конкретного типа клеток желудка.

DR5 индукция casticin требуется для повышения TRAIL-индуцированного апоптоза в BGC-823 клеток

для того, чтобы определить роль рецепторов DR5 в усилении TRAIL-индуцированного апоптоза casticin, мы использовали siРНК, специфичную DR5 для его экспрессии подавляют. Трансфекция клеток с миРНК для DR5, но не с миРНК управления снижается casticin-индуцированную экспрессию DR5.
<Р> Чтобы проверить, идет ли DR5 повышающей регуляцией casticin-Enhanced TRAIL-индуцированный апоптоз клеток желудка, анализа проточной цитометрии был использован для изучения вопроса подавление экспрессии DR5 с помощью миРНК может ослабить эффект casticin на TRAIL-индуцированного апоптоза. На фиг.4В показано, что эффект casticin на TRAIL-индуцированный апоптоз эффективно уменьшается в клетках, трансфецированных DR5 миРНК, в то время как клетки, трансфицированные с контрольными миРНК были не влияет. В совокупности эти результаты указывают на то, что индукция DR5 имеет решающее значение для сенсибилизации опухолевых клеток к воздействию casticin в TRAIL-индуцированного апоптоза.

Casticin индуцированных DR5 повышающей регуляцией опосредуется через индукцию CHOP в BGC-823 клетках
<р> ЧОП-опосредованной повышающая регуляция DR5 было показано [11] - [15]; Поэтому мы исследовали, как в следующем этот фактор транскрипции, могут быть вовлечены в casticin индуцированных DR5 повышающей регуляцией. Рисунок 5А показывает, что casticin индуцированную экспрессию Чоп, которое произошло параллельно с увеличением экспрессии DR5.
<Р> Чтобы проверить роль ЧОП в casticin-индуцированной повышающей регуляции ДР, был использован ген глушение СНОР с помощью миРНК. Трансфекция с ЧОП миРНК значительно подавлена ​​casticin-индуцированной DR5 повышающую регуляцию (рис 5б), в то время как casticin повышающей регуляции экспрессии DR5 в не трансфицируются и управления трансфицируются (закодированная РНК) клетки.
<Р> Далее мы использовали анализ проточной цитометрии для исследовать подавление CHOP путем миРНК ослабляется ли на сенсибилизирующие эффекты casticin на TRAIL-индуцированного апоптоза. Трансфекция с ЧОП миРНК значительно снижены эффекты (от 37,1 ± 5,3% до 13,5 ± 1,3%, среднее ± стандартное отклонение, <ет> п
= 3) на casticin плюс TRAIL-индуцированного апоптоза (рис 5в), в то время как лечение с контролем миРНК не имел никакого эффекта (5С). Эти результаты указывают на то, что ЧОП участвует в DR5 повышающей регуляцией и способствует сенсибилизирующего эффекта casticin на TRAIL-индуцированного апоптоза в нашей экспериментальной модели.

Casticin индуцированный эндоплазматический ретикулум (ER), стресс в клетках рака желудка
<р> известно, что ER индуцирует ER стресс белков-маркеров (например, GRP78 и фосфо-eIF2α), который повышает экспрессию CHOP [12], [19], [20]. В настоящем исследовании, влияние casticin на экспрессию ER стресс белков-маркеров исследовали. Наши результаты показывают, что casticin действительно вызывают все эти маркеры ER стресса в клетках BGC-823 (6А). Для того, чтобы определить, является ли ER стресс участвует в потенцирование casticin на апоптоза, индуцированного TRAIL, salubrinal, ингибитор ER стресса, был использован. Salubrinal (50 мкмоль /л) значительно защищенные BGC-823 клетки от апоптоза, индуцированного совместного применения casticin и TRAIL (фиг.6В).
<Р> Мы также проверили, действительно ли лечение BGC-823 клеток с эндоплазматический ретикулум (ER) стресс индуктором, туникамицина [25], может поднять уровни белка DR5 и усилить TRAIL-индуцированный апоптоз клеток. Мы обнаружили, что туникамицина (3,0 мкмоль /л) зависимости от времени повышал уровень протеина DR5, п-eIF2α, grp78 и измельчить, в КУП-823 клеток (рис 6в). Cotreatment с туникамицина (3,0 мкмоль /л) и TRAIL (50 нг /мл) значительно увеличивало процент клеток в суб-G1 фазе, по сравнению с туникамицина или TRAIL в одиночку (рис 6D). Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что ER стресс участвующий в Потенцирующий эффекте casticin на апоптозу, индуцированному TRAIL.

Casticin индуцированных DR5 повышающей регуляцией и апоптозом потенцирование являются РОС-зависимых клеток в КУП-823
<р> недавно мы показали, что 5, 7-диметоксифлавон селективно усиливает TRAIL-индуцированный апоптоз ROS вынужденное ER-стресс запуска CHOP-опосредованной DR5 повышающую регуляцию в гепатоцеллюлярной карциномы клеток [15]. Таким образом, мы исследовали, вызывает ли casticin производство ROS. 2 '7'-дихлорфлуоресцеина диацетатные (DFCH-DA), был использован в качестве зонда для измерения любого увеличения уровней ROS в клетках. Эксперименты показали, во времени уровня, что уровни ROS первоначально увеличились на
<р> 1 ч, достигла пика на 3 ч и сохраняется в течение до 24 ч после обработки 1,0 мкмоль /л casticin (рис 7А). Casticin индуцированную продукцию активных форм кислорода в зависимости от концентрации (рис 7б).
<Р> Чтобы расшифровать взаимосвязь между генерацией активных форм кислорода и измельчить-зависимой DR5 индукции, мы исследовали, регулирует ли РОС casticin-индуцированные TRAIL-рецепторы и измельчить в присутствии и отсутствие N
-acetylcysteine ​​(NAC), который представляет собой поглотитель свободных радикалов кислорода. Мы обнаружили, что предварительная обработка клеток с НСС уменьшила casticin индуцированной повышающую регуляцию DR5 и измельчить выражение (фиг.7С).
<Р> Далее, мы исследовали, играет ли РОС роль в casticin индуцированный TRAIL потенцирования. Как показано на рисунке 7г, casticin значительно усиливается TRAIL-индуцированный апоптоз в клетках КУП-823, и предварительная обработка клеток с NAC заметно снижается casticin-индуцированного апоптоза повышение гибели клеток с 52,4 ± 3,3% до 8,2 ± 0,8%, (среднее ± стандартное отклонение, п = 3) предполагая, что ROS играет критическую роль в опосредовании эффектов casticin в TRAIL-индуцированного апоптоза.

Casticin подавляет экспрессию различных белков выживания клеток в клетках BGC-823

сообщалось, что многочисленные антиапоптические белки, такие как сурвивин, cFLIP, XIAP, Bcl-2 и Bcl-X L может регулировать TRAIL-индуцированный апоптоз [25], [26]. В настоящем исследовании мы исследовали, были ли вовлечены некоторые идентифицированных белков выживания клеток в потенциирующий эффект casticin на апоптоза, индуцированного TRAIL. Клетки КУП-823 подвергались воздействию различных концентраций casticin в течение 24 ч, а затем исследовали на Bcl-XL, Bcl-2, сурвивина, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (клеточного ингибитора апоптоза протеина 1) и TRAF1 (TNF рецептор-ассоциированной фактор 1) выражение. Casticin ингибирует Bcl-XL, Bcl-2, сурвивина, выражение cFLIP и XIAP (рис 8а). Эффекты casticin на экспрессию Bcl-XL, Bcl-2, сурвивина, XIAP и cFLIP прутик в то время как понижающая регуляция CIAP-1 не был очень выражен. Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение экспрессии белков выживания клеток является одним из механизмов, движущих усиливающее эффект casticin на апоптоз, индуцированный TRAIL.
<Р> Затем мы исследовали, может ли casticin модулировать экспрессию про-апоптотических белков. Мы обнаружили, что резко casticin повышающей регуляции экспрессии Bax в зависимости от концентрации (фиг.8В). Casticin также увеличилось расщепление Bid в зависимости от концентрации, как показано снижением экспрессии белка Bid (8В). Эти данные позволяют предположить, что casticin может одновременно активировать внутреннюю митохондрии-опосредованной путь и примесный DR-индуцированный путь, о чем свидетельствует усеченного проапоптотического белка Bid.

Обсуждение
<р> В данном запросе, мы исследовали способность casticin, а polymethoxyflavone, полученный из Fructus Viticis
, для модуляции сигналов TRAIL в клетках рака желудка, и наши результаты показывают, что casticin потенцирует TRAIL-индуцированный апоптоз в раковых заболеваний желудка BGC-823, SGC-7901 и MGC-803 клетки (1), индуцирующего экспрессию DR5 и (2) downregulatin белков выживания клеток, связанных с устойчивостью опухолевых клеток к TRAIL. Casticin повышающая регуляция DR5, как представляется, опосредовано через активацию РОС-ER стресс-CHOP пути (рисунок 9).
<Р> Мы показали, что casticin индуцированной экспрессии DR5 в раковых клетках желудка. Эти результаты согласуются с результатами нашей предыдущей работы [10], мы сообщали, что апоптическая эффект casticin в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека участвует в DR5 повышающую регуляцию, но они не обращались вопрос о том, может ли casticin усилить TRAIL-индуцированный апоптоз или механизм сенсибилизации. Здесь, мы показали, что DR5, повышающая регуляция имеет решающее значение для сенсибилизации клеток к TRAIL, как ген глушителей рецептора (DR5) ослабленного TRAIL-индуцированный апоптоз. Таким образом, DR5 повышающая регуляция может повышать чувствительность клеток к TRAIL-индуцированного апоптоза [27]. Многочисленные механизмы были описаны для индукции ДР, в том числе генерации активных форм кислорода, индукции р53 и NF-kB, DDIT3 (повреждения ДНК-индуцируемых транскриптов 3), активатора пролиферации пероксисом рецептора-гамма и МАРК активации [27], [28] , В настоящем исследовании мы обнаружили, что casticin индуцированных ЧОП и что ген глушение СНОР по миРНК блокировали действие casticin на индукции DRs и на TRAIL-индуцированного апоптоза. Наши результаты схожи с результатами других исследований, которые показали, что ЧОП связывается с промотором DR5 и активирует этот экспрессию рецептора [12], [29].
<Р> Хорошо известно, что ЧОП является типичным ER стресс-регулируемый белок, вовлеченный в ER-стресс-индуцированного апоптоза [11]. Наше нахождение ЧОП индукции casticin позволяет предположить, что casticin может вызвать ER стресс и повысить уровни экспрессии GRP78 и eIF2α, которые являются дополнительные белки, накопленные или возросшие в ER стресса [17]. Таким образом, представляется вероятным, что casticin вызывает стресс ER. Salubrinal является селективным ингибитором ER-стресс-индуцированного апоптоза [30]. Присутствие salubrinal по-видимому, защищены желудочные раковые клетки от casticin плюс TRAIL-индуцированный апоптоз. Таким образом, представляется, что casticin индуцирует апоптоз потенцирование с привлечением механизмов ER стресса.
<Р> Мы обнаружили, что, возможно, самый важный сигнал восходящего потока связан с casticin модуляции TRAIL рецепторов РОС. Наши результаты показывают, что однозначно casticin индуцированную продукцию ROS и что гашение бескрановой антиоксиданта N
-acetylcysteine ​​ослабляется эффект casticin на индукцию измельчать и DR5. Мы обнаружили, что закалка ROS также ослабляется casticin потенцирование TRAIL-индуцированного апоптоза. Наши результаты согласуются с теми, сообщалось в предыдущих исследованиях с использованием сульфорафан, zerumbone и celastrol для DR5 индукции. Результаты нынешних и предыдущих исследований убедительно свидетельствуют о том, что АФК играет важную роль в модуляции TRAIL рецептора DR5 [31], [32]. Наши результаты согласуются с результатами предыдущей работы, мы сообщали, что casticin вызвало накопление суб-G1 клеток и увеличение производства активных форм кислорода в HeLa, CaSki и линий SiHa клеток, но не в МНПК [33]. Но мы показали, что casticin снижается содержание GSH ( P &л; 0,05
), но не влияет на уровень внутриклеточного ROS в PLC /PRF /5 и Hep G2 клеток [10]. Возможным объяснением очевидного конфликта данных является то, что существуют различия в модальности, которые регулируют действия в различных типах клеток.
<Р> Мы также определили, что другой механизм сенсибилизации включает в себя регулирование антиапоптотических белков. Casticin подавляются экспрессии elevels из Bcl-2, Bcl-XL, XIAP и сурвивина, все из которых были связаны с устойчивостью опухолевых клеток к TRAIL [34], [35]. Действительно, понижающая регуляция XIAP, Bcl-2 и экспрессии Bcl-Xl Было показано, что сенсибилизировать клетки опухоли к TRAIL [36], [37]. Ван и др.
(2005) [8] показали, что casticin пониженные уровни экспрессии Bcl-2 и подавляются соотношение экспрессии Bcl-2 /Bax в клетках К562. Наши результаты также согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали, что экстракт этанол высушенного спелых плодов Витекс священный
снизился уровень Bcl-2, Bcl-XL и Bid белка, и увеличение в уровень белка Bax [7]. Как сказано в сообщении Chen и др.
(2011) недавно показал, что Вах был повышающей регуляции, в то время как уровни экспрессии Bcl-XL и XIAP были подавляются с помощью casticin [33].
<Р> Кобаякава и др. сообщили, что casticin заметно ингибирует рост клеток KB, но не ингибирует пролиферацию клеток A431, который похож на нормальные клеточные линии 3Т3 швейцарской альбиносов, ТИГ-103 [38]. В настоящем исследовании мы показали, что casticin специфически индуцированный апоптоз в раковых клетках желудка человека, но не в клетках, ГЭС-1, хотя механизм селективной индукции апоптоза не была определена. Наши результаты показывают, что casticin может быть специфический противоопухолевый агент с низкой токсичностью.
<Р> Таким образом, полученные нами результаты показывают, что casticin способствует чувствительности опухолевых клеток к TRAIL путем использования нескольких механизмов. Casticin изначально способствует генерации активных форм кислорода и вызывает стресс ER затем вызывает DR5 активацию через активацию ЧОП, которые, следовательно, повышает TRAIL-индуцированной активации DR5-индуцированных и митохондрии-опосредованной путей апоптоза. Одновременно casticin облегчает TRAIL-индуцированной гибели клеток путем апоптоза путем ингибирования экспрессии белка антиапоптоз и активации про-апоптозных белков. Будущие исследования должны быть направлены в полной мере реализовать потенциал комбинации casticin и TRAIL терапии для лечения пациентов с раком желудка. Таким образом, потребуются дополнительные исследования действия casticin в животных моделях.

Материалы и методы

Реактивы
<р> Casticin (чистота ≥ 98%) был приобретен у Чэнду Biopurify Фитохимикаты ООО (Чэнду, Китай), присутствующий в виде желтых кристаллов (молекулярный вес, 374,3). Casticin растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), чтобы сделать 10 ммоль /л маточного раствора и разводили в клеточной культуральной среде до нужной концентрации непосредственно перед использованием. Следующие реагенты были приобретены у Хунань Clonetimes Biotech Co. Ltd. (Чанша, Китай): растворимый рекомбинантный человеческий TRAIL (Pepro Tech), апоптозом клеток обнаружения ELISA Kit (Roche), 2 ', 7'-дихлорфлуоресцеина диацетат (DCFH-DA; Molecular Probes Inc.), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-ацетилцистеин (NAC; Sigma), туникамицина (Sigma), йодид пропиди (PI; Sigma), каспазы 3 обнаружение активности Комплект (Millipore), каспазы 8 колометрической Анализ активности Kit 25 (Millipore), каспазы 9 колометрической Анализ активности Kit (Millipore), антитело против DR5 (ProSci Inc). Антитела против DR4, ППА, Bcl-2, Вах, Bid, сурвивину, измельчить, GRP78 и ATF4 были получены от Santa Cruz Biotechnology. Анти-XIAP антитело было приобретено у Cell Signaling Technology, Danvers, США. ингибиторы каспаз, такие как zVADfmk, zDEVD-финляндских марок, zIETD-финляндских марок и zLEHD-финских марок были приобретены у R &Amp; D Systems (Миннеаполис, Миннесота)

Культура клеток
<р> BGC-823, СГК. -7901 и MGC-803 человека желудочные раковые клетки были получены из Китая центра коллекции типовых культур (CCTCC; Ухань, Китай) и ГЭС-1 клеток из Института онкологии в Пекинском университете. Клетки поддерживали в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen), 100 ед /мл пенициллина и 100 ед /мл стрептомицина, во влажной атмосфере с 5% СО <суб> 2 при 37 ° С. Клетки обрабатывали различными концентрациями casticin или TRAIL или оба для МТТ. Casticin (1,0 мкмоль /л) и TRAIL (25, 50 нг /мл) в отдельности или в комбинации были применены к BGC-823 клетки, используемые для обнаружения апоптоза.

МТТ
<р> Клетки высевали в 96-луночный планшет при плотности 0.5104 клеток /лунку и инкубировали в течение 24 ч, с последующей обработкой с различными концентрациями casticin и волоков в течение 24 ч или обработанной casticin в течение 12 ч с последующей обработкой TRAIL в течение еще 24 ч. МТТ колориметрический анализ проводили, как описано ранее [10]. <Суб> 50 значение IC, при которой 50% ингибирования роста клеток по сравнению с (ДМСО), контроль диметилсульфоксид, рассчитывали путем нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (San Diego, CA).

Поток цитометрии с использованием PI окрашивания
<р> Клетки высевали при плотности 4 × 10 6 клеток /мл в культуральных флаконах 100 мл в течение 24 ч, а затем обрабатывали средой, содержащей различные концентрации casticin или TRAIL или оба вместе за указанные промежутки времени. Апоптоз клеток определяли с помощью проточной цитометрии. (ТСМ, американский BD компании, FACS 420)

гистонов фрагмент /ДНК ИФА
<р> Комплект обнаружения ELISA клеточного апоптоза использовали для обнаружения апоптоза в клетках, обработанных casticin в соответствии с протоколом производителя. В кратком изложении, клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 1 × 10 ^{4 клеток /лунку в течение 24 ч, а средой, содержащей различные концентрации casticin добавлены по мере необходимости. Через 24 ч, цитоплазма контрольной и получавшей соединение групп был переведен в 96-луночный планшет peridiumed с помощью стрептавидина, инкубировали с биотинилированным антителом, гистонов и пероксидаза-меченый мыши анти-ДНК человека в течение 2 ч при комнатной температуре. Поглощение при 405 нм измеряли с помощью EXL-800 типа иммуноферментного аппарата.}

Анализ каспазы-3, -8 и -9 деятельности
<р> Деятельность каспазы-3, -8 и -9 оценивали с использованием каспазы 3 Activity Detection Kit, каспазы 8 колометрической Анализ активности Kit 25 и каспазы 9 колометрической Анализ активности Kit, соответственно. Вкратце, клеточные лизаты получали после их соответствующей обработки с экспериментальными агентами. Анализы проводили в 96-луночных планшетов путем инкубации 20 мкг лизатов клеток в 100 мкл реакционного буфера (1% NP-40, 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 137 мМ NaCl, 10% глицерина), содержащего 5 мкМ из каспазы-3 подложки Ac-DEVD- р
Н.А., каспазы-8 субстрат Ac-IETD- р
NA или каспазы-9 субстрат Ac-LEHD- р
NA. Лизаты инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч.

• PLoS ONE: Фаза II исследования Оценка 2 схемы дозирования пероральной Foretinib (GSK1363089), CMET /VEGFR2 Ингибитор, у пациентов с…
• PLoS ONE: Ассоциация между сокращением плазмы адипонектина уровней и риск бактериальной инфекции после хирургии…