De abstracte
Achtergrond
Casticin is een van de belangrijkste actieve componenten afkomstig van Fructus Viticis Materialen en Werkwijzen Apoptotische activiteiten van casticin (1,0 umol /l) en TRAIL (25, 50 ng /ml) alleen of in combinatie in de maagkanker cellijnen BGC-823, SGC-7901 en MGC-803 werden gedetecteerd door het gebruik van een cel apoptose ELISA detectiekit, flowcytometrie ( FCM) met propidium jodide (PI) kleuring en activiteiten van caspase-3, -8 en -9 door ELISA en splitsing van polyADP-ribose polymerase (PARP) -eiwit behulp van western blot analyse. Doodreceptoren (DR) expressieniveaus werden geëvalueerd middels FCM-analyse en Western blotting. 2 ', 7'-dichloorfluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA) werd gebruikt als een probe om de toename van reactieve zuurstofverbindingen (ROS) niveaus in cellen te meten. Meerdere ingrepen, zoals siRNA transfectie en farmacologische remmers werden gebruikt om de mechanismen van deze acties te verkennen. nauwelijks giftige concentraties van casticin aanzienlijk versterkt-TRAIL geïnduceerde cytotoxiciteit en apoptose in BGC-823, SGC-7901 en MGC-803 cellen. Casticin dramatisch opgereguleerd DR5-receptor expressie, maar had geen effect op DR4 of decoy receptoren. Schrapping van DR5 door siRNA significante vermindering van het apoptose geïnduceerd door de co-toepassing van TRAIL en casticin. Gene silencing van de CCAAT /enhancer bindingseiwit homoloog eiwit (CHOP) en voorbehandeling met salubrinal, een endoplasmatisch reticulum (ER) stress-remmer, verzwakte casticin-geïnduceerde DR5 receptor expressie en apoptose en ROS productie. Casticin downregulated de expressieniveaus van de celoverleving eiwitten cFLIP, Bcl-2, XIAP en survivine. Daarnaast casticin ook veroorzaakte de uitingen van DR5-eiwit in andere maagkanker cellen (SGC-7901 en MGC-803). Casticin verbetert-TRAIL geïnduceerde apoptose via downregulatie van overleving van de cel eiwitten en de regulatie van DR5-receptoren door middel van acties op de ROS-ER stress-CHOP pathway Visum:. Zhou Y, Tian L, Long L, M Quan, Liu F, Cao J (2013) Casticin versterkt TRAIL-geïnduceerde apoptose van maagkanker cellen via endoplasmatisch reticulum stress. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10.1371 /journal.pone.0058855 Editor: Kaustubh Datta, Universiteit van Nebraska Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika Ontvangen: 11 juni 2012; Aanvaard: 8 februari 2013; Gepubliceerd: 11 maart 2013 Copyright: © 2013 Zhou et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Project van NSFC (nummer 30760248), het Project van Wetenschappelijk Onderzoek van de provincie Hunan de Administratie-Bureau van de Traditionele Chinese Geneeskunde (nummer 2.010.081), het Project van Wetenschappelijk Onderzoek van de provincie Hunan, ministerie van Onderwijs (nummer 10C0975), Major project punt van Wetenschappelijk Onderzoek van de provincie Hunan het ministerie van Onderwijs (nummer 09A054) en het project van het Wetenschappelijk Onderzoek van Changsha City Bureau van Wetenschap en Technologie (nummer K1104060-31). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Fructus Viticis Onlangs eerder werk van ons laboratorium aangetoond dat het effect van casticin op apoptose van menselijke hepatocellulaire carcinoomcellen betrokken is bij de route DR5 onafhankelijk van de status van p53 [10]. Er is gedocumenteerd dat de CCAAT /versterker bindend eiwit homoloog eiwit (CHOP), ook bekend als groeistop en DNA schade gen 153 (GADD153) direct reguleert DR5-expressie door een CHOP bindingsplaats in de 5-flankerende gebied van het DR5-gen [11], [12]. Wij en anderen hebben gerapporteerd dat sommige geneesmiddelen, zoals 5, 7-dimethyl-dimethoxyflavone en celecoxib induceren DR5 tot expressie CHOP-afhankelijke transactivatie van het DR5-gen [13] - [15]. Bovendien hebben verschillende studies aangetoond een nauwe relatie tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) stress en DR5 expressie. ER stress geïnduceerd niet gevouwen eiwitten accumuleren in het ER lumen [16]. Het lijkt erop dat deze reactie specifieke apoptoseroutes kan activeren om zwaar beschadigde cellen, waarbij eiwitvouwing gebreken niet kan worden opgelost te elimineren [17], [18]. Verschillende ER stress inductoren, zoals MG132 [12], tunicamycine [19] en thapsigargin [20], consequent aangetoond dat DR5-expressie te induceren op celoppervlakken. Hoewel de moleculaire mechanismen voor DR5-eiwit expressie door ER stress inductoren kan variëren met stimuli en celtypen, de ER stress-induceerbare transcriptiefactor, CHOP, heeft een verband tussen ER stress en DR5 verstrekt. Echter, of casticin induceert DR5-expressie in maagkanker cellen en zo ja, de aard van het moleculaire mechanisme dat is onbekend. Een recente studie heeft aangetoond dat effectieve tumor necrosis factor-α-gerelateerde apoptose inducerende ligand ( TRAIL) gebaseerde combinatietherapie kan worden bereikt door het opwaarts reguleren van DR4 en DR5-expressie en direct gericht tumorcel mitochondriën hun apoptose inducerende eigenschappen [21] stimuleren. Het vermogen van mitochondriën te bemiddelen apoptose wordt strak gereguleerd door leden van de Bcl-2 superfamilie [22]. Onderdrukken anti-apoptotische eiwit expressie met antisense RNA of siRNA is aangetoond dat kankercellen sensibiliseren TRAIL [23]. Daardoor middelen die dergelijke anti-apoptotische eiwitten neerwaarts reguleren zoals survivine, cellulaire FADD-achtige interleukine-1β-omzettend enzym remmend eiwit (cFLIP), Bcl-2, en X-gebonden remmer van apoptose-eiwit (XIAP) kan eventueel sensibiliseren kanker cellen met de apoptotische effecten van TRAIL [23], [24]. In de huidige studie, daarom hebben we ons gericht op het onderzoeken van de vraag of casticin versterkt-TRAIL geïnduceerde kankercel apoptose, en zo ja, hoe casticin versterkt deze effect. We vonden dat casticin versterkt middels TRAIL geïnduceerde apoptose door opwaarts reguleren van DR5 door ROS-ER stress-CHOP route en door het neerwaarts reguleren van de expressie van de celoverleving eiwitten Bcl-2, XIAP, cFLIP en survivine bij maagkanker cellen. Resultaten nauwelijks giftige concentraties van casticin selectief verbetert-TRAIL geïnduceerde cytotoxiciteit bij maagkanker cellen De cytotoxiciteit van casticin en TRAIL, alleen of in combinatie, werd in menselijke maagkanker lijnen onderzocht BGC- 823, SGC-7901 en MGC-803, zoals bepaald door de MTT-bepaling. Casticin en TRAIL alleen veroorzaakte cytotoxiciteit van maagkanker cellen, in een concentratie-afhankelijke wijze (Figuren 1A en B). Geringe cytotoxiciteit (< 20%) werd waargenomen bij een lagere concentratie casticin (1,0 umol /l, Figuur 1A). Behandeling van maagkanker cellen met 25-50 ng /ml TRAIL gedurende 24 uur veroorzaakte beperkte cytotoxiciteit (< 20%). Gelijktijdige behandeling van maagkanker cellen met casticin (1,0 umol /l) en TRAIL (25 ng /ml of 50 ng /ml) aanzienlijk verhoogd het cytotoxische effecten in vergelijking met behandeling met casticin of TRAIL alleen (figuur 1C). Omdat we vonden dat de gecombineerde behandeling met casticin en sterk TRAIL geïnduceerde cytotoxiciteit bij maagkanker cellen, we vervolgens het effect van de behandeling op de geïmmortaliseerde menselijke maagslijmvlies epitheelcellijn GES-1 onderzocht. Interessant, heeft de combinatie van casticin en TRAIL niet cytotoxiciteit induceren in GES-1-cellen (figuur 1D) .Deze resultaten geven aan dat nauwelijks giftige concentraties van casticin selectief gesensibiliseerd menselijke maagkanker cellen te TRAIL-geïnduceerde cytotoxiciteit. om te onderzoeken of apoptose is betrokken bij de celgroei remmen na gelijktijdige behandeling met casticin en TRAIL, we eerst onderzocht met behulp van apoptose flowcytometrische analyse om verhogingen van hypodiploïde cel op te sporen populaties. De resultaten lieten zien dat het percentage van apoptose was 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% en 37,1 ± 4,9% (gemiddelde ± SD, n We volgende onderzocht of caspases daadwerkelijk werden geactiveerd tijdens de inductie van apoptotische celdood door het gecombineerde behandeling met casticin en TRAIL bij maagkanker cellen. Behandeling van gastic kankercellen met alleen gedurende 24 uur 1 micromol /l casticin geen enkele activiteit van caspase-3 opwekken, -8 en -9. In reactie op TRAIL (50 ng /ml), de activiteiten van caspase-3, -8 en -9 veranderde niet. De gecombineerde behandeling van casticin en TRAIL induceerde de activering van caspase-3 en -8 en licht geactiveerd caspase-9 (Figuur 2 E, F en G). Ook onderzocht die caspase specifiek geactiveerd reactie op casticin TRAIL behandeling met caspase remmers, waaronder pan-caspase inhibitor zVAD-fmk, de caspase-3-remmer zDEVD fmk, de caspase-8-remmer zIETD-fmk en caspase-9-remmer zLEHD fmk. Zoals getoond in figuur 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk en zIETD-fmk aanzienlijk verminderde de activiteit van caspase-3 geïnduceerd door de gecombineerde behandeling van casticin en TRAIL, maar zLEHD-fmk hadden een gering effect. zVAD-fmk en zIETD-fmk gelijktijdig volledig blokkeren caspase-8 activatie en zDEVD-fmk gedeeltelijk geblokkeerd activatie van caspase-8; had echter zLEHD-fink weinig invloed op de activering staat van caspase-8 (figuur 2F). Dienovereenkomstig bleek dat caspase-9 licht geactiveerd in cellen behandeld met casticin en TRAIL, maar niet in cellen behandeld met casticin en TRAIL in aanwezigheid van z-IETD-fmk, zVAD-fmk en zLEHD-fmk (figuur 2G). Gezamenlijk suggereren deze resultaten dat casticin de toevoeging van TRAIL induceert caspase-8 activatie stroomopwaarts van caspase-9 activatie [10]. We eindelijk onderzocht of casticin TRAIL geïnduceerde PARP klieving kunnen bevorderen en vonden dat casticin versterkte TRAIL geïnduceerde verhoging van PARP klieving in BGC-823 en SGC-7901-cellen (Figuur 2H). Deze resultaten zijn sterke aanwijzingen dat een nauwelijks giftige concentratie van casticin verbetert-TRAIL geïnduceerde apoptose van maagkanker cellen. apoptose van hepatocellulair carcinoom cellen, geïnduceerd door casticin was betrokken bij DR5 regulatie [10]. Daarom hebben we behandeld BGC-823 cellen met casticin gedurende 24 uur en daarna gebruikt western blot analyse om de cellen voor TRAIL receptor expressie te onderzoeken. Casticin verhoogde DR5-expressie in een concentratie-afhankelijke manier, maar had geen effect op DR4 expressie noch DcR1 of DcR2 inductie (Figuur 3A). Inductie van DR5-expressie door casticin trad op 6 uur en piekte op 24 uur (figuur 3B). Deze bevindingen suggereren dat DR5 opregulatie in aanmerking mechanisme waardoor casticin versterkt de apoptotische effecten van TRAIL in BGC-823 cellen. te bepalen of de DR op het celoppervlak in de inductie van apoptose is betrokken bij casticin, het celoppervlak expressie van DR5 en DR4 werd waargenomen onder toepassing van stroomcytometrie. Na blootstelling cel casticin (1,0 umol /l), werd het niveau van DR5 op het celoppervlak verhoogd (Figuur 3C). Echter casticin had geen invloed op het niveau van DR4-expressie (Figuur 3D). Gezamenlijk geven deze resultaten aan dat casticin upregulates de expressie van DR5 op het celoppervlak. Of opregulatie van DR5 door casticin specifiek is BGC-823 cellen of ook optreedt in andere maagkanker cellijnen, werd eveneens onderzocht. Casticin geïnduceerde DR5-expressie in maagkanker SGC-7901 en MGC-803 cellijnen, maar voor de hand liggende gevolgen voor de expressie in onsterfelijk maagslijmvlies GES-1 cellijn (figuur 3E) niet. Tezamen suggereren deze bevindingen dat de opregulatie van DR5 door casticin is niet specifiek voor een bepaald type maagkanker cel. de rol van DR5-receptoren in de versterking van middels TRAIL geïnduceerde apoptose door casticin bepalen, gebruikten we siRNA specifiek voor DR5 zijn expressie omlaag reguleren. Transfectie van cellen met siRNA voor DR5 maar niet met de controle siRNA verlaagde casticin-geïnduceerde DR5-expressie. Om te onderzoeken of DR5 opregulatie gaat casticin-versterkte-TRAIL geïnduceerde maag cel apoptose, flow cytometrische analyse werd gebruikt om te onderzoeken of onderdrukking van DR5 expressie door siRNA kon het effect van casticin on-TRAIL geïnduceerde apoptose verzwakken. Figuur 4B toont dat het effect van casticin voor middels TRAIL geïnduceerde apoptose effectief verlaagd in cellen die met DR5 siRNA, terwijl cellen die met controle siRNA niet beïnvloed. Samengenomen geven deze resultaten aan dat inductie van DR5 is essentieel voor sensibilisatie van tumorcellen voor de effecten van casticin in middels TRAIL geïnduceerde apoptose. Casticin geïnduceerde opregulatie DR5 wordt gemedieerd door inductie van CHOP in BGC-823 cellen CHOP-gemedieerde opregulatie van DR5 is aangetoond [11] - [15]; Daarom hebben we de volgende onderzocht hoe deze transcriptiefactor zou kunnen worden betrokken bij-casticin geïnduceerde DR5 opregulatie. Figuur 5A toont dat casticin CHOP geïnduceerde expressie, die zich parallel aan de toename van DR5-expressie. De rol van CHOP in casticin geïnduceerde opregulatie van de DR testen gene silencing CHOP door siRNA gebruikt. Transfectie met CHOP siRNA aanzienlijk onderdrukte casticin-geïnduceerde DR5 opregulatie (Figuur 5B), terwijl casticin opgereguleerd de expressie van DR5 in ongetransfecteerde and-control getransfecteerde (scrambled RNA) cel. We naast gebruikt flowcytometrische analyse onderzoeken of de onderdrukking van CHOP door siRNA verzwakt het effect van overgevoeligheid van casticin on-TRAIL geïnduceerde apoptose. Transfectie met CHOP siRNA aanzienlijk verminderd de effecten (van 37,1 ± 5,3% tot 13,5 ± 1,3%, gemiddelde ± SD, n het is bekend dat ER ER stress induceert marker proteïnen (zoals GRP78 en fosfo-eIF2α), die de expressie van CHOP [12], [19] upregulates, [20]. In de onderhavige studie werd het effect van casticin op de expressie van ER stress markereiwitten onderzocht. Onze resultaten tonen dat casticin al deze zaken markers van ER stress in BGC-823-cellen (Figuur 6A) induceerde. Bepalen of ER stress betrokken is bij de potentiëring van casticin op middels TRAIL geïnduceerde apoptose, salubrinal, een remmer van ER-stress, werd gebruikt. Salubrinal (50 umol /l) aanzienlijk beschermd BGC-823 cellen van apoptose geïnduceerd door de co-toepassing van casticin en TRAIL (figuur 6B). We hebben ook onderzocht of de behandeling van BGC-823 cellen met het endoplasmatisch reticulum (ER) stress-inducerende, tunicamycine [25], DR5-eiwit levels kon verheffen en te verbeteren-TRAIL geïnduceerde apoptotische celdood. We vonden dat tunicamycine (3,0 micromol /l) tijd-afhankelijk verhoogde de eiwit niveaus van DR5, p-eIF2α, GRP78 en CHOP, in BGC-823 cellen (figuur 6C). Gelijktijdige behandeling met tunicamycine (3,0 umol /L) en TRAIL (50 ng /ml) significant verhoogde het percentage cellen in sub-G1 fase tegen tunicamycine of TRAIL alleen (figuur 6D). Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat ER stress deelneemt aan het versterkende effect van casticin voor middels TRAIL geïnduceerde apoptose. we hebben onlangs aangetoond dat 5, 7-dimethoxyflavone selectief versterkt middels TRAIL geïnduceerde apoptose door ROS gestimuleerde ER stress triggering CHOP-gemedieerde opregulatie DR5 in hepatocellular carcinoomcellen [15]. We aldus onderzocht of casticin induceert ROS productie. 2 '7'-dichloorfluoresceïne-diacetaat (DFCH-DA) werd gebruikt als een probe om een verhoging van ROS levels in cellen te meten. Tijdsverloop experimenten bleek dat de niveaus van ROS aanvankelijk 1 uur verhoogd, bereikte een piek bij 3 uur en bleef tot 24 uur na behandeling met 1,0 umol /l casticin (Figuur 7A). Casticin geïnduceerde ROS productie in een concentratie-afhankelijke wijze (Figuur 7B). Om de relatie tussen de ROS generatie en CHOP-afhankelijke DR5 inductie ontcijferen, we onderzocht of ROS regelt casticin-geïnduceerde TRAIL receptoren en CHOP in de aanwezigheid en afwezigheid van N Vervolgens hebben we onderzocht of ROS een rol speelt in de casticin geïnduceerde TRAIL versterking. Zoals getoond in figuur 7D, casticin aanzienlijk verbeterd middels TRAIL geïnduceerde apoptose in BGC-823 cellen en voorbehandeling van cellen met NAC duidelijk verminderde casticin geïnduceerde apoptotische celdood verhoging van 52,4 ± 3,3% tot 8,2 ± 0,8% (gemiddelde ± SD, n = 3) suggereert dat ROS speelt een cruciale rol in het mediëren de effecten van casticin in middels TRAIL geïnduceerde apoptose. casticin neerwaartse regulering van de expressie van verschillende eiwitten in celoverleving BGC-823 cellen het is gerapporteerd dat diverse anti-apoptotische eiwitten, zoals survivine, cFLIP, XIAP, Bcl-2 en Bcl-xL kan middels TRAIL geïnduceerde apoptose [25] reguleren [26]. In de huidige studie hebben we onderzocht of bepaalde geïdentificeerde overleving van de cel eiwitten die betrokken waren bij het versterkende effect van casticin op apoptose geïnduceerd door TRAIL. BGC-823 cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties casticin gedurende 24 uur en vervolgens onderzocht op Bcl-xL, Bcl-2, survivine, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (cellulaire remmer van apoptose-eiwit 1) en TRAF1 (TNF receptor-geassocieerde factor 1) expressie. Casticin remde Bcl-xL, Bcl-2, survivine, cFLIP en XIAP expressie (Figuur 8A). De effecten van casticin op de expressie van Bcl-xL, Bcl-2, survivine, XIAP en cFLIP waren dramatisch, terwijl de neerwaartse regulatie van CIAP-1 was niet erg uitgesproken. Deze resultaten suggereren dat neerwaartse regulatie van celoverleving eiwitten is één van de mechanismen die het versterkende effect van casticin voor middels TRAIL geïnduceerde apoptose. We vervolgens onderzocht of casticin de expressie van pro-apoptotische eiwitten kan moduleren. We vonden dat casticin dramatisch opgeregeld de expressie van Bax in een concentratie-afhankelijke wijze (Figuur 8B). Casticin toegenomen splitsing van Bid in een concentratie-afhankelijke wijze, zoals blijkt uit de afname van de expressie van Bid eiwit (figuur 8B). Deze bevindingen suggereren dat casticin tegelijkertijd de intrinsieke-mitochondriën-gemedieerde route en de extrinsieke DR-geïnduceerde route zoals blijkt uit de afgeknotte pro-apoptotische eiwit kan activeren Bid. In het onderhavige onderzoek, onderzochten we het vermogen van casticin, een polymethoxyflavone afkomstig van Fructus Viticis We hebben aangetoond dat casticin geïnduceerd DR5-expressie in maagkanker cellen. Deze resultaten zijn in overeenstemming met die van onze eerdere werk [10], hebben we gemeld dat de apoptotische effect van casticin in menselijke leverkanker cellen betrokken is bij DR5 opregulatie maar ze hadden niet de vragen over de vraag of casticin-TRAIL geïnduceerde apoptose kan verbeteren aan te pakken of het mechanisme van sensibilisatie. Hier hebben we aangetoond dat DR5 opregulatie essentieel is voor sensitisatie van cellen voor TRAIL als gene silencing van de receptor (DR5) verzwakte TRAIL geïnduceerde apoptose. Aldus kan DR5 opregulatie cellen voor middels TRAIL geïnduceerde apoptose [27] sensibiliseren. Talrijke mechanismen zijn beschreven voor inductie van de DR, waaronder ROS generatie p53-inductie en NF-KB, DDIT3 (DNA-schade-induceerbaar transcript 3), peroxisoom proliferator geactiveerde receptor-γ en MAPK activatie [27], [28] . In de huidige studie, vonden we dat casticin geïnduceerde CHOP en dat gene silencing van CHOP door siRNA het effect van casticin geblokkeerd op de inductie van Drs en on-TRAIL geïnduceerde apoptose. Onze bevindingen zijn vergelijkbaar met die van andere studies waaruit bleek dat CHOP bindt aan de promotor en DR5 upregulates deze receptor expressie [12], [29]. Het is algemeen bekend dat CHOP is een typisch ER stress-gereguleerde eht ER stress geïnduceerde apoptose [11]. Onze bevinding van CHOP inductie door casticin suggereert dat casticin ER stress kan veroorzaken en verhoging van de expressie van GRP78 en eIF2α, die extra eiwitten opgebouwd of steeg in ER stress [17] zijn. Daarom lijkt het waarschijnlijk dat casticin induceert ER stress. Salubrinal is een selectieve remmer van ER stress geïnduceerde apoptose [30]. De aanwezigheid van salubrinal blijkbaar beschermd maagkanker cellen uit casticin plus-TRAIL geïnduceerde apoptose. Zo lijkt het erop dat casticin induceert apoptose versterking door het betrekken van ER stress mechanismen. We vonden dat misschien wel de belangrijkste upstream signaal gekoppeld aan modulatie van TRAIL receptoren casticin is ROS. Onze resultaten tonen ondubbelzinnig dat casticin induceerde de productie van ROS en dat uitdoving van ROS door de antioxidant N Bovendien blijken dat andere mechanisme van sensibilisatie omvat de regulatie van anti-apoptotische eiwitten. Casticin downregulated elevels de expressie van Bcl-2, Bcl-xL, XIAP en survivine, die allemaal zijn gekoppeld aan tumorcellen resistentie tegen TRAIL [34], [35]. Inderdaad, neerwaartse regulatie van XIAP, Bcl-2 en Bcl-xL expressie bleek tumorcellen gevoelig te maken TRAIL [36], [37]. Wang et al. Kobayakawa et al. gemeld dat casticin aanzienlijk remde de groei van KB cellen, maar niet de proliferatie van A431 cellen, die overeenkomt met de normale cellijnen 3T3 Swiss Albino en TIG-103 [38] niet verhinderen. In deze studie hebben we aangetoond dat casticin specifiek geïnduceerde apoptose in menselijke maagkanker cellen maar niet in GES-1-cellen, alhoewel het mechanisme van selectieve inductie van apoptose is niet vastgesteld. Onze resultaten suggereren dat casticin een specifieke anti-tumormiddel, weinig toxisch kan zijn. Samenvattend tonen onze resultaten aan dat casticin bijdraagt aan de gevoeligheid van tumorcellen voor middels TRAIL door gebruik meerdere mechanismen. Casticin bevordert aanvankelijk ROS generatie en triggers ER stress dan induceert DR5 opregulatie door activatie van CHOP die daardoor verbetert-TRAIL geïnduceerde activatie van DR5-geïnduceerde en mitochondriën-gemedieerde apoptose pathways. Tegelijkertijd casticin faciliteert-TRAIL geïnduceerde apoptotische celdood door remming van anti-apoptose proteïne expressie en activatie van pro-apoptose eiwitten. Toekomstige onderzoeken gericht moet zijn om het potentieel van een combinatie van casticin en TRAIL therapie bij patiënten met maagkanker behandeling volledig te realiseren. Daarom zal aanvullend onderzoek van de acties van casticin in diermodellen vereist. reagentia Casticin (zuiverheid ≥ 98%) werd gekocht van Chengdu Biopurify fytochemicaliën Ltd (Chengdu, China), aanwezig als gele kristallen (moleculair gewicht, 374,3). Casticin werd opgelost in dimethyl- sulfoxide (DMSO) tot een 10 mmol /l stockoplossing te maken en verdund in een celkweekmedium met de gewenste concentratie onmiddellijk voor gebruik. De volgende reagentia werden gekocht van Hunan Clonetimes Biotech Co Ltd (Changsha, China): oplosbaar recombinant humaan TRAIL (Pepro Tech), Cell Apoptosis ELISA Detection Kit (Roche), 2 ', 7'-dichloorfluoresceïn diacetaat (DCFH-DA; Molecular Probes Inc), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-acetylcysteïne (NAC, Sigma), tunicamycine (Sigma), propidiumjodide (PI, Sigma), caspase 3 Activity Detection Kit (Millipore), caspase 8 Colorimetrische Activity Assay Kit 25 (Millipore), caspase 9 Colorimetrische Activity Assay Kit (Millipore), antilichaam tegen DR5 (Prosci Inc). Antilichamen tegen DR4, PARP, Bcl-2, Bax, Bid, survivine, CHOP, GRP78 en ATF4 werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology. Anti-XIAP antilichaam werd gekocht van Cell Signaling Technology, Danvers, USA. Caspase-remmers, zoals zVADfmk, zDEVD-fink, zIETD-fink en zLEHD-fink werden gekocht bij R & D Systems (Minneapolis, MN) Cell cultuur BGC-823, SGC. -7901 en MGC-803 menselijke maagkanker cellen werden verkregen van de Chinese Centrum voor Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, China) en GES-1-cellen van het Instituut voor Oncologie in Beijing University. De cellen werden gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penicilline en onderhouden 100 U /ml streptomycine in een vochtige atmosfeer met 5% CO 2 bij 37 ° C. Cellen werden behandeld met verschillende concentraties casticin of TRAIL of zowel MTT assay. Casticin (1,0 umol /l) en TRAIL (25, 50 ng /ml) alleen of in combinatie werden toegepast BGC-823 cellen gebruikt om apoptose te detecteren. Cellen werden gezaaid in een 96-wells plaat met een dichtheid van 0,5104 cellen /putje en gedurende 24 uur, gevolgd door behandeling met verschillende concentraties casticin en TRAIL gedurende 24 uur of behandeld met casticin gedurende 12 uur gevolgd door behandeling met TRAIL nog eens 24 uur. MTT colorimetrische analyse werd uitgevoerd zoals eerder [10] beschreven. De IC 50 waarde waarbij 50% van de celgroei remming vergeleken met dimethylsulfoxide (DMSO) controle werd berekend door niet-lineaire regressie analyse met GraphPad Prism software (San Diego, CA). De cellen werden geënt bij een dichtheid van 4 x 10 6 cellen /ml in 100 ml kolven gedurende 24 uur en vervolgens behandeld met medium dat verschillende concentraties casticin of TRAIL of beide samen gedurende de aangegeven tijden. Apoptose werd gedetecteerd middels flowcytometrie. (FCM; American BD Company, FACS 420) histon /DNA-fragment ELISA De apoptose ELISA detectie kit werd gebruikt om apoptose te detecteren in cellen behandeld met casticin volgens het protocol van de fabrikant. Kort samengevat werden cellen uitgezaaid in een 96-wells plaat met een dichtheid van 1 x 10 4 cellen /putje gedurende 24 uur, en het medium dat verschillende concentraties casticin toegevoegd vereist. Na 24 uur werd het cytoplasma van de controle- en behandelingsgroepen overgebracht naar 96-wells plaat peridiumed door streptavidine, geïncubeerd met gebiotinyleerd histon antilichaam en peroxidase-gelabeld muis anti-humaan DNA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. De absorptie bij 405 nm werd gemeten met een EXL-800 type enzym-gekoppelde immuun-inrichting. De activiteiten van caspase-3, -8 en -9 werden geëvalueerd met behulp van de caspase 3 Activity Detection Kit, de caspase 8 Colorimetrische Activity Assay Kit 25 en de caspase 9 Colorimetrische Activity Assay Kit, respectievelijk. In het kort werden cellysaten bereid na hun behandeling met experimentele middelen. De assays werden uitgevoerd in 96-putjesplaten door incuberen 20 ug cellysaten in 100 gl reactiebuffer (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 10% glycerol) bevattende 5 uM van het caspase-3-substraat Ac-DEVD- p
en gerapporteerd aan anti-carcinogene activiteit uitoefenen op verschillende kankercellen maar het precieze mechanisme achter deze activiteit blijft onduidelijk.
Resultaten
Conclusie /Betekenis
( Manjingzi
is de Chinese naam) namelijk vrucht van Vitex trifolia L.
(familie Verbenaceae
) dat is een traditionele Chinese geneeskunde gebruikt als een anti-inflammatoir middel. Casticin is een van de actieve bestanddelen afkomstig van Fructus Viticis
[1]. Veel studies hebben aangetoond dat casticin uitoefent anti-carcinogene activiteit bij borst- [2], cervicale [3], prostate [4], long- en darmkanker [5], [6], en in maagkanker [7] in vitro
. Ook is gemeld dat casticin remt de groei van humane myeloïde leukemiecellen [8] en induceert de dood van leukemie cellen door de inductie van ofwel apoptosis of mitotische catastrofe [9].
nauwelijks giftige concentraties van casticin sensibiliseren maagkanker cellen to-TRAIL geïnduceerde apoptose
= 3) voor casticin (1 umol /l), TRAIL (50 ng /ml) en casticin TRAIL plus respectievelijk (Figuur 2A). De sub-G1 populatie van BGC-823-cellen was significant verhoogd bij 12 h, en piekte op 24 uur na voorbehandeling met 1 umol /l casticin gevolgd door 50 ng /ml TRAIL (Figuur 2B). We naast bepaalden de histon /DNA-fragment niveaus van maagkanker cellijnen BGC-823, SGC-7901 en MGC-803 met behulp van de cel apoptose ELISA detectie kit. Figuur 2C illustreert dat gecombineerde behandeling van casticin en TRAIL synergetisch geïnduceerde histon /DNA-fragmentatie. De histon /DNA-fragment niveaus van BGC-823 werden verhoogd na 12 uur en piekte 24 uur na gelijktijdige behandeling met casticin (1 umol /l) en TRAIL (50 ng /ml, figuur 2D).
Casticin induceert de expressie van DR5 bij maagkanker cellen
DR5 inductie door casticin vereist voor de verhoging van middels TRAIL geïnduceerde apoptose in BGC-823 cellen
= 3) op casticin plus-TRAIL geïnduceerde apoptose (figuur 5C), terwijl de behandeling met controle siRNA geen effect had (Figuur 5C). Deze resultaten geven aan dat CHOP betrokken is bij DR5 opregulatie en bijdraagt tot het sensibiliserende effect van casticin voor middels TRAIL geïnduceerde apoptose in ons experimentele model.
Casticin geïnduceerde endoplasmatisch reticulum (ER) stress in maagkanker cellen
Casticin geïnduceerde opregulatie DR5 apoptose en versterking zijn ROS-afhankelijke in BGC-823 cellen
-acetylcysteine (NAC), een binder van vrije zuurstofradicalen. We vonden dat voorbehandeling van cellen met NAC verminderde de-casticin geïnduceerde opregulatie van DR5 en CHOP expressie (figuur 7C).
Discussie
, om TRAIL signalering bij maagkanker cellen te moduleren, en onze bevindingen suggereren dat casticin versterkt-TRAIL geïnduceerde apoptose bij maagkanker BGC-823, SGC-7901 en MGC-803 cellen door (1) het induceren van DR5-expressie en (2) downregulatin celoverleving eiwitten gekoppeld tumorcellen resistentie tegen TRAIL. Casticin opregulatie van DR5 lijkt te worden gemedieerd door activering van de ROS-ER stress-CHOP route (Figuur 9).
-acetylcysteine het effect van casticin op de inductie van CHOP en DR5 verzwakt. We vonden dat het doven ROS ook verzwakt casticin versterking van-TRAIL geïnduceerde apoptose. Onze bevindingen zijn in overeenstemming met die gerapporteerd in eerdere studies met behulp van sulforafaan, zerumbone en celastrol voor DR5 inductie. Resultaten van de huidige en eerdere studies sterke aanwijzingen dat ROS speelt een belangrijke rol bij de modulatie van TRAIL-receptor DR5 [31], [32]. Onze resultaten zijn in overeenstemming met die van het eerdere werk, hebben we gemeld dat casticin veroorzaakte opeenstapeling van sub-G1 cellen en een verhoogde ROS productie in HeLa, CaSki en SiHa cellijnen, maar niet in PBMCs [33]. Maar we laten zien dat casticin verminderde het GSH gehalte ( P < 0.05
), maar had geen invloed op het niveau van de intracellulaire ROS in PLC /PRF /5 en Hep G2-cellen [10]. Een plausibele verklaring voor de schijnbare gegevensconflict is dat er verschillen in modaliteit die optreden in verschillende celtypen reguleren.
(2005) [8] heeft dat casticin verminderde Bcl-2 expressie en gedownreguleerd de verhouding van Bcl-2 /Bax expressie in K562-cellen. Onze resultaten zijn ook in overeenstemming met eerdere studies waaruit bleek dat een ethanol extract van de gedroogde rijpe vruchten van MONNIKSPEPER
daalde het niveau van de Bcl-2, Bcl-XL en Bid eiwit, en steeg in het niveau van Bax eiwit [7]. Het rapport van Chen et al.
(2011) heeft onlangs bleek dat Bax werd opgereguleerd, terwijl de expressie van Bcl-XL en XIAP werden neerwaarts gereguleerd door casticin [33].
Materialen en methoden
MTT assay
Flow cytometrie middels PI kleuring
Analyse van caspase-3, -8 en -9 activiteiten
NA, de caspase-8 substraat Ac-IETD- p
NA of de caspase-9-substraat Ac-LEHD- p
NA. Lysaten werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur.
Sterk microbioom in het vroege leven gekoppeld aan minder luchtweginfecties
Nanotechnologie en COVID-19 diagnose en behandeling
De eerste bevindingen van het Human Microbiome Project leidden tot 'honderden vervolgonderzoeken'
Mensen met IBS-symptomen die waarschijnlijk een laag vitamine D-gehalte hebben,
Fastfood kan een hoofdschuldige zijn bij tienerdepressie
Wetenschappers ontwikkelen 3D-geprinte pil die bacteriën in de darmen bemonstert
Ontdekking van 100 nieuwe genen kan helpen bij onderzoek naar pigmentatieziekten
Een nieuwe studie onder leiding van onderzoekers van Kings College London en Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam heeft 124 genen blootgelegd die een sleutelrol spelen bij het bepalen van
Rotavirus speelt rol bij ontwikkeling van type 1 diabetes
Een nieuw artikel gepubliceerd in het tijdschrift PLOS Pathogens op 10 oktober, 2019, beweert dat het gewone rotavirus verantwoordelijk kan zijn voor sommige gevallen van type 1 diabetes, een vorm van
Tests gebruikt voor GERD-diagnose
Bij sommige patiënten, we kunnen gastro-oesofageale refluxziekte vermoeden, maar de symptomen van de patiënt kunnen atypisch zijn. Of misschien moeten we gewoon onze diagnose bevestigen. Om dit te doe