PLOS ONE: casticine potentialise TRAIL induit l'apoptose des cellules de cancer gastrique par réticulum endoplasmique Stress

Résumé

Contexte

casticine est l'un des principaux composants actifs obtenus à partir de Fructus Viticis
et a été rapporté à exercer une activité anti-carcinogène sur une variété de cellules cancéreuses, mais le mécanisme précis qui sous-tend cette activité reste incertaine

Matériel et méthodes

apoptotique activités de casticine (1,0 pmol. /l) et TRAIL (25, 50 ng /ml) seul ou en combinaison dans les lignées cellulaires de cancer gastrique BGC-823, CGS-7901 et MGC-803 ont été détectés par l'utilisation d'un kit de test ELISA de détection de l'apoptose cellulaire, cytométrie de flux ( FCM) d'iodure de propidium (PI), la coloration et les activités de la caspase-3, -8 et -9 par ELISA et le clivage de la polymérase polyADP-ribose (PARP), une protéine en utilisant une analyse western blot. récepteurs de mort (DR) niveaux d'expression ont été évalués en utilisant l'analyse de la FCM et western blot. 2 ', 7'-dichloro diacétate (DCFH-DA) a été utilisé comme une sonde pour mesurer l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) niveaux dans les cellules. Des interventions multiples, comme transfection de siRNA et les inhibiteurs pharmacologiques ont été utilisés pour explorer les mécanismes de ces actions.

Résultats

subtoxiques concentrations de casticine potentialisés significativement la cytotoxicité et l'apoptose induite par TRAIL dans BGC-823, SGC-7901 et MGC-803 cellules. Casticine considérablement régulée positivement l'expression du récepteur DR5 mais n'a eu aucun effet sur DR4 ou récepteurs leurres. Suppression de DR5 par siRNA réduit de manière significative l'apoptose induite par la co-application de TRAIL et casticine. Silençage génique de la protéine de protéine de liaison à un amplificateur /CCAAT homologue (MCPA) et un prétraitement avec salubrinal, un réticulum endoplasmique (RE), un inhibiteur de stress, l'expression atténuée casticine induite par le récepteur DR5, et l'apoptose et la production de radicaux libres. Casticine régulée à la baisse des niveaux des protéines de survie cellulaire cFLIP, Bcl-2, XIAP, et survivine expression. En outre, casticine également induit l'expression de la protéine DR5 dans d'autres cellules de cancer gastrique (SGC-7901 et MGC-803).

Conclusion /Importance

casticine améliore l'apoptose induite par TRAIL par la régulation négative des protéines de survie cellulaire et la régulation positive des récepteurs DR5 par des actions sur le ROS-ER stress CHOP voie

Citation:. Zhou Y, Tian l, long l, Quan M, Liu F, Cao J (2013) casticine potentialise TRAIL apoptose induite par des cellules de cancer gastrique par stress du réticulum endoplasmique. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10.1371 /journal.pone.0058855

Editeur: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: Juin 11, 2012; Accepté: 8 Février 2013; Publié le 11 Mars, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Zhou et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par le projet de NSFC (numéro 30760248), le projet de recherche scientifique de la province du Hunan Bureau de l'administration de la médecine traditionnelle chinoise (numéro 2010081), le projet de recherche scientifique de la province du Hunan, ministère de l'éducation (numéro 10C0975), Major Point de projet de recherche scientifique de la province du Hunan ministère de l'éducation (numéro 09A054) et le projet de recherche scientifique de la ville de Changsha Bureau de la science et de la technologie (numéro K1104060-31). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

( Manjingzi
est le nom chinois), à savoir le fruit de Fructus Viticis de Vitex trifolia L.
(famille Verbenaceae
) qui est une médecine traditionnelle chinoise utilisé comme agent anti-inflammatoire. Casticine est l'un des composants actifs dérivés de Fructus Viticis
[1]. De nombreuses études ont démontré que casticine exerce une activité anti-carcinogène chez sein [2], col de l'utérus [3], de la prostate [4], du poumon et le cancer du colon [5], [6], ainsi que dans le cancer gastrique [7] in vitro
. Il a également été rapporté que casticine inhibe la croissance des cellules de leucémie myéloïde humaines [8] et induit la mort des cellules leucémiques par l'induction de l'une apoptose ou une catastrophe mitotique [9].

Récemment, les travaux antérieurs de notre laboratoire ont indiqué que l'effet de casticine sur l'apoptose des cellules de carcinome hépatocellulaire humain est impliquée dans la voie de DR5, indépendamment de l'état de p53 [10]. Il a été démontré que la protéine de liaison à un amplificateur /CCAAT protéine homologue (MCPA), également connu en tant que arrêt de la croissance et des dommages gène d'ADN 153 (GADD153), régule directement l'expression de DR5 par un site de liaison CHOP dans la région 5 adjacente du gène DR5 [11], [12]. Nous et d'autres, ont rapporté que certains médicaments, tels que 5, 7-diméthyl-diméthoxyflavone et célécoxib, induisent l'expression de DR5 par CHOP-dépendante transactivation du gène DR5 [13] - [15]. En outre, plusieurs études ont montré une relation étroite entre le réticulum endoplasmique (RE) de stress et d'expression DR5. stress du RE est induite lorsque les protéines dépliées accumulent dans la lumière du RE [16]. Il semble que cette réponse peut activer les voies apoptotiques spécifiques pour éliminer les cellules sévèrement endommagées, dans lequel le repliement des protéines défauts ne peuvent pas être résolus [17], [18]. Divers ER inducteurs de stress, tels que MG132 [12], tunicamycine [19] et thapsigargine [20], il a été démontré constamment pour induire l'expression DR5 sur les surfaces cellulaires. Bien que les mécanismes moléculaires pour DR5 expression de la protéine par ER inducteurs de stress peuvent varier avec des stimuli et des types de cellules, l'ER stress inductible facteur de transcription, CHOP, a fourni un lien entre le stress du RE et DR5. Cependant, si casticine induit l'expression de DR5 dans des cellules de cancer de l'estomac et dans l'affirmative, la nature du mécanisme moléculaire impliqué est inconnue.

Une étude récente a montré que la tumeur efficace nécrose ligand induisant l'apoptose lié au facteur α ( TRAIL) de la polythérapie à base peut être obtenue par la régulation positive de DR4 et DR5 expression et ciblant directement les mitochondries des cellules tumorales de stimuler leurs propriétés induisant l'apoptose [21]. La capacité des mitochondries à médier l'apoptose est étroitement régulée par des membres de la superfamille bcl-2 [22]. La suppression de l'expression de protéine anti-apoptotique, avec un ARN anti-sens ou l'ARNsi, a été montré pour sensibiliser les cellules cancéreuses au TRAIL [23]. En conséquence, des agents qui régulent à la baisse de ces protéines anti-apoptotiques comme survivine cellulaire FADD comme le cancer de l'interleukine-1β enzyme de conversion de la protéine inhibitrice (cFLIP), Bcl-2 et un inhibiteur lié au chromosome X de la protéine de l'apoptose (XIAP) peuvent potentiellement sensibiliser cellules aux effets apoptotiques de TRAIL [23], [24].

Dans la présente étude, par conséquent, nous nous sommes concentrés sur l'étude si casticine potentialise cellules cancéreuses de l'apoptose induite par TRAIL, et si oui, comment casticine potentialise cette effet. Nous avons constaté que casticine potentialisé l'apoptose induite par TRAIL par upregulating DR5 par le ROS-ER stress CHOP voie et par la régulation négative de l'expression des protéines de survie cellulaire Bcl-2, XIAP, cFlip et survivine dans les cellules de cancer gastrique.

Résultats

subtoxiques concentrations de casticine améliore sélectivement la cytotoxicité induite par TRAIL dans les cellules cancéreuses gastriques

La cytotoxicité de casticine et TRAIL, seul ou en combinaison, a été examiné dans des lignées de cancer gastriques humaines BGC- 823, 7901 et CGS-MGC-803, tel que déterminé par le test MTT. Casticine et TRAIL seul causé la cytotoxicité des cellules de cancer gastrique, d'une manière dépendante de la concentration (Figures 1A et B). Légère cytotoxicité (< 20%) a été observée à une concentration plus faible casticine (1,0 mol /l, figure 1A). Le traitement des cellules cancéreuses gastriques avec le TRAIL 25-50 ng /ml pendant 24 h, induit une cytotoxicité limitée (< 20%). Cependant, le co-traitement des cellules cancéreuses gastriques avec casticine (1,0 pmol /l) et TRAIL (25 ng /ml ou 50 ng /ml) a augmenté de façon marquée les effets cytotoxiques par rapport au traitement avec casticine ou TRAIL seul (figure 1C).

Parce que nous avons constaté que le traitement combiné avec un casticine et TRAIL cytotoxicité fortement induite dans des cellules cancéreuses gastriques, nous avons ensuite examiné l'effet du traitement sur la lignée cellulaire gastrique muqueuse épithéliale humaine immortalisée GES-1. Fait intéressant, la combinaison de casticine et TRAIL n'a pas induit de cytotoxicité dans GES-1 cellules (Figure 1D) .Ces résultats indiquent que les concentrations subtoxiques de casticine sensibilisées sélectivement les cellules cancéreuses gastriques humaines TRAIL-cytotoxicité induite.

concentrations subtoxiques de casticine sensibiliser les cellules cancéreuses gastriques à induite par TRAIL apoptose

Afin de déterminer si l'apoptose est impliquée dans l'inhibition de la croissance cellulaire suite à la co-traitement avec casticine et TRAIL, nous avons d'abord examiné l'apoptose en utilisant une analyse de cytométrie en flux pour détecter l'augmentation des cellules hypodiploïdes populations. Les résultats ont révélé que le taux d'apoptose était de 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% et 37,1 ± 4,9% (moyenne ± écart-type, n
= 3) pour casticine (1 pmol /l), TRAIL (50 ng /ml) et casticine ainsi que le TRAIL, respectivement (figure 2A). La population sous-G1 du BGC-823 cellules a été significativement augmentée à 12 h, et a atteint un sommet de 24 h après un prétraitement avec 1 pmol /l casticine suivie par 50 ng /ml TRAIL (figure 2B). Nous avons ensuite déterminé les niveaux de fragments histone /ADN de lignées cellulaires de cancer gastrique BGC-823, SGC-7901 et MGC-803 en utilisant le kit de détection ELISA de l'apoptose des cellules. La figure 2C montre que le traitement combiné de casticine et TRAIL synergétique induit la fragmentation histone /ADN. Les niveaux de BGC-823 fragment histone /ADN ont été élevés après 12 h et a atteint un sommet de 24 heures après co-traitement avec casticine (1 pmol /l) et TRAIL (50 ng /ml, la figure 2D).

Nous ensuite examiné si les caspases ont été effectivement activés lors de l'induction de la mort cellulaire apoptotique par le traitement combiné avec casticine et TRAIL dans des cellules cancéreuses gastriques. Le traitement des cellules du cancer gastrique avec 1 umole /L casticine seul pendant 24 heures n'a pas induit une activité de la caspase-3, -8 et -9. En réponse à TRAIL (50 ng /ml), de l'activité de la caspase-3, -8 et -9 n'a pas changé. Cependant, le traitement combiné de casticine et TRAIL induit l'activation de la caspase-3 et -8 et légèrement activé caspase-9 (figure 2 E, F et G).

Nous avons également examiné la caspase qui a été spécifiquement activé dans réponse à casticine et le traitement de TRAIL en utilisant des inhibiteurs de caspases, y compris l'inhibiteur pan-caspase zVAD-fmk, la caspase-3 inhibiteur zDEVD-fmk, la caspase-8 inhibiteur zIETD-fmk et la caspase-9 inhibiteur zLEHD-fmk. Comme le montre la figure 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk et zIETD-fmk diminué de manière significative le niveau d'activité de induite par le traitement combiné de casticine et TRAIL caspase-3, mais zLEHD-fmk a eu un léger effet. zVAD-fmk et zIETD-fmk peut simultanément bloquer complètement caspase-8 activation et zDEVD-fmk partiellement l'activation de la caspase-8 bloqués; cependant, zLEHD-fmk avait peu affecter l'état de la caspase-8 (Figure 2F) activation. De ce fait, nous avons constaté que la caspase-9 a été légèrement activée dans les cellules traitées avec casticine et TRAIL, mais pas dans les cellules traitées avec TRAIL casticine et en présence de Z-IETD-fmk, zVAD-fmk et zLEHD-fmk (figure 2G). Collectivement, ces résultats suggèrent que casticine avec l'ajout de TRAIL induit caspase-8 activation en amont de caspase-9 activation [10].

Nous avons finalement cherché à savoir si casticine pourrait améliorer induite par TRAIL PARP clivage et constaté que casticine améliorée TRAIL-induit une augmentation de PARP clivage BGC-823 et les cellules SGC-7901 (Figure 2H). Ces résultats indiquent clairement qu'une concentration subtoxique de casticine améliore l'apoptose induite par TRAIL de cellules cancéreuses gastriques.

casticine induit l'expression de DR5 dans des cellules cancéreuses gastriques

apoptose des cellules de carcinome hépatocellulaire induite par l'casticine a été impliqué dans DR5 surexpression [10]. Par conséquent, nous avons traité BGC-823 cellules avec casticine pendant 24 h et ensuite utilisé l'analyse Western blot pour examiner les cellules pour l'expression des récepteurs TRAIL. Casticine augmentation de l'expression DR5 d'une manière dépendante de la concentration, mais n'a eu aucun effet sur l'expression DR4 ni DcR1 ou DcR2 induction (figure 3A). L'induction de l'expression DR5 par casticine a eu lieu à 6 h et a culminé à 24 h (figure 3B). Ces résultats suggèrent que DR5 surexpression est un mécanisme de candidat à travers lequel casticine améliore les effets apoptotiques de TRAIL dans BGC-823 cellules.

Pour déterminer si la DR à la surface cellulaire a été impliquée dans l'induction de l'apoptose par casticine, l'expression de surface cellulaire de DR5 et DR4 a été observée en utilisant la cytométrie de flux. Après exposition des cellules à casticine (1,0 pmol /l), le niveau de DR5 sur la surface cellulaire a été augmentée (figure 3C). Cependant, casticine n'a pas influencé le niveau de DR4 expression (Figure 3D). Collectivement, ces résultats indiquent que casticine upregulates l'expression de DR5 à la surface cellulaire.

Si la régulation positive de DR5 par casticine est spécifique au BGC-823 cellules ou se produit dans d'autres lignées cellulaires de cancer gastrique aussi, a également été étudiée. expression de DR5 casticine induite dans le cancer gastrique SGC-7901 et MGC-803 lignées cellulaires, mais n'a pas eu des effets évidents sur son expression dans l'immortalisation muqueuse gastrique GES-1 lignée cellulaire (Figure 3E). Ensemble, ces résultats suggèrent que la surexpression de DR5 par casticine est pas spécifique à un type particulier de cellules de cancer gastrique.

DR5 induction par casticine est nécessaire pour l'amélioration de l'apoptose induite par TRAIL dans BGC-823 cellules

pour déterminer le rôle des récepteurs DR5 dans l'amélioration de l'apoptose induite par TRAIL par casticine, nous avons utilisé siRNA spécifique de DR5 à réguler négativement son expression. La transfection de cellules avec siRNA pour DR5 mais pas avec les siRNA de contrôle réduit l'expression de DR5 casticine-induite.

Pour examiner si DR5 surexpression implique casticine améliorée cellules gastriques apoptose induite par le TRAIL, le débit d'analyse cytométrique a été utilisé pour examiner si suppression de DR5 expression par siRNA pourrait atténuer l'effet de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL. La figure 4B montre que l'effet de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL a été effectivement diminuée dans les cellules transfectées avec l'ARNsi DR5, tandis que les cellules transfectées avec l'ARNsi de contrôle étaient non affectés. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'induction de DR5 est critique pour la sensibilisation des cellules tumorales aux effets de casticine de l'apoptose induite par TRAIL.

casticine induite par régulation à la hausse de DR5 est médiée par l'induction de CHOP BGC-823 cellules

CHOP-médiée de DR5 surexpression a été démontré [11] - [15]; Par conséquent, nous avons ensuite étudié la façon dont ce facteur de transcription pourrait être impliquée dans casticine induite par DR5-régulation à la hausse. La figure 5A montre que casticine expression CHOP, qui a eu lieu parallèlement à l'augmentation de l'expression de DR5 a induit.

Pour tester le rôle de CHOP dans la régulation positive induite par casticine-de DR, silençage génique CHOP par l'ARNsi a été utilisé. Transfection avec CHOP siRNA supprimé de manière significative casticine induite par DR5 surexpression (figure 5B), tandis que casticine upregulated l'expression de DR5 en (ARN brouillés) cellules non transfectées et de contrôle transfectées.

Nous avons ensuite utilisé l'analyse par cytométrie de flux à examiner si la suppression de CHOP par siRNA atténué les effets de sensibilisation casticine sur l'apoptose induite par TRAIL. Transfection avec CHOP siRNA considérablement réduit les effets (de 37,1 ± 5,3% à 13,5 ± 1,3%, moyenne ± écart type, n
= 3) sur casticine ainsi que l'apoptose induite par TRAIL (Figure 5C), tandis que le traitement avec le contrôle siRNA n'a eu aucun effet (Figure 5C). Ces résultats indiquent que CHOP est impliqué dans DR5 surexpression et contribue à l'effet de sensibilisation de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL dans notre modèle expérimental.

casticine réticulum endoplasmique induite (ER) le stress dans les cellules cancéreuses gastriques

on sait que l'ER induit des protéines marqueurs de stress ER (comme la GRP78 et phospho-eIF2α), qui régule à la hausse l'expression de CHOP [12], [19], [20]. Dans la présente étude, l'effet de casticine sur l'expression des protéines marqueurs de stress ER a été examinée. Nos résultats montrent que casticine a en effet induire tous ces marqueurs de stress du RE dans BGC-823 cellules (figure 6A). Pour déterminer si le stress du RE est impliqué dans la potentialisation de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL, salubrinal, un inhibiteur de stress du RE, a été utilisé. Salubrinal (50 pmol /l) significativement protégées BGC-823 cellules de l'apoptose induite par la co-application de casticine et TRAIL (figure 6B).

Nous avons également testé si le traitement de BGC-823 cellules avec le réticulum endoplasmique (ER) le stress inducteur, tunicamycine [25], pourrait élever les niveaux de protéine DR5 et d'améliorer la mort cellulaire apoptotique induite par TRAIL. Nous avons constaté que la tunicamycine (3,0 pmol /L) en fonction du temps a augmenté les niveaux de DR5, p-eIF2α, GRP78 et CHOP, protéines dans BGC-823 cellules (Figure 6C). Co-traitement avec la tunicamycine (3,0 pmol /L) et TRAIL (50 ng /ml) a augmenté de manière significative le pourcentage de cellules en phase de sous-G1 par rapport à la tunicamycine ou TRAIL seul (figure 6D). Ces résultats soutiennent l'hypothèse que le stress du RE participe à l'effet potentialisateur de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL.

casticine induite par surexpression DR5 et l'apoptose potentialisation sont ROS-dépendante BGC-823 cellules

nous avons récemment démontré que 5, 7-diméthoxyflavone favorise de manière sélective l'apoptose induite par TRAIL stimulée par les ERO ER-stress déclenchement CHOP à médiation par la régulation positive de DR5 dans des cellules de carcinome hépatocellulaire [15]. Nous avons étudié donc de savoir si casticine induit la production de ROS. 2 '7'-dichloro diacétate (DFCH-DA) a été utilisé comme une sonde pour mesurer toute augmentation des taux de ROS dans les cellules. Temps des expériences de cours ont révélé que les niveaux de ROS ont augmenté initialement à

1 h, a atteint un pic à 3 h et ont persisté jusqu'à 24 h après le traitement avec 1,0 pmol /l casticine (figure 7A). Casticine induit la production de ROS d'une manière dépendante de la concentration (figure 7B).

Pour déchiffrer la relation entre la production de ROS et CHOP-dépendante DR5 induction, nous avons examiné si ROS régule les récepteurs TRAIL casticine-induits et CHOP en présence et en l'absence de N s -acetylcysteine ​​(NAC), qui est un piégeur de radicaux libres d'oxygène. Nous avons trouvé que le prétraitement des cellules avec NAC réduit la régulation positive induite par casticine-de DR5 et CHOP expression (Figure 7C).

Ensuite, nous avons cherché à savoir si ROS joue un rôle dans le TRAIL potentialisation induite par casticine. Comme le montre la figure 7D, casticine considérablement amélioré l'apoptose induite par TRAIL dans BGC-823 cellules, et le prétraitement des cellules avec NAC nettement réduite casticine induite par l'amélioration de la mort cellulaire apoptotique de 52,4 ± 3,3% à 8,2 ± 0,8%, (moyenne ± écart-type, n = 3), suggérant que les ROS joue un rôle crucial dans la médiation des effets de casticine dans l'apoptose induite par TRAIL.

casticine régule négativement l'expression de différentes protéines de survie cellulaire dans BGC-823 cellules

Il a été rapporté que de nombreuses protéines anti-apoptotiques, tels que la survivine, cFLIP, XIAP, Bcl-2 et Bcl-xL peut réguler l'apoptose induite par TRAIL [25], [26]. Dans la présente étude, nous avons examiné si certaines protéines de survie cellulaire identifiés ont été impliqués dans l'effet potentialisateur de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL. BGC-823 cellules ont été exposées à différentes concentrations de casticine pendant 24 heures et ensuite examinées pour Bcl-xL, Bcl-2, survivine, XIAP, cFLIP, cIAP-1 (inhibiteur cellulaire de la protéine de l'apoptose 1) et TRAF1 (TNF receptor-associated facteur 1) expression. Casticine inhibé Bcl-xL, Bcl-2, la survivine, cFLIP et XIAP expression (figure 8A). Les effets de casticine sur l'expression de Bcl-xL, Bcl-2, survivine, XIAP et cFLIP ont été spectaculaires, tandis que la régulation négative de cIAP-1 n'a pas été très prononcée. Ces résultats suggèrent que la régulation négative de protéines de survie cellulaire est l'un des mécanismes d'entraînement l'effet potentialisateur de casticine sur l'apoptose induite par TRAIL.

Nous avons ensuite examiné si casticine pourrait moduler l'expression des protéines pro-apoptotiques. Nous avons constaté que casticine considérablement régulée à la hausse l'expression de Bax d'une manière dépendante de la concentration (figure 8B). Casticine a également augmenté le clivage de Bid d'une manière dépendante de la concentration, comme le montre la diminution de l'expression de la protéine Bid (figure 8B). Ces résultats suggèrent que casticine peut simultanément activer la voie de mitochondries médiée intrinsèque et la voie extrinsèque DR-induite, comme en témoigne la protéine pro-apoptotique tronquée Bid.

Discussion

Dans la présente enquête, nous avons étudié la capacité des casticine, un polymethoxyflavone dérivé de Fructus Viticis
, pour moduler la signalisation de TRAIL dans les cellules de cancer gastrique, et nos résultats suggèrent que casticine potentialise l'apoptose induite par TRAIL dans le cancer gastrique BGC-823, SGC-7901 et MGC-803 cellules par (1) induisant l'expression DR5 et (2) downregulatin de protéines de survie cellulaire liées à la résistance des cellules tumorales à TRAIL. Casticine surexpression de DR5 semble être médiée par l'activation de la voie de stress-CHOP ROS-ER (Figure 9).

Nous avons démontré que casticine induit l'expression de DR5 dans les cellules de cancer gastrique. Ces résultats sont en accord avec ceux de nos travaux précédents [10], nous avons signalé que l'effet apoptotique de casticine dans les cellules de carcinome hépatocellulaire humain est impliqué dans DR5 surexpression mais ils n'a pas abordé la question de savoir si casticine peut améliorer l'apoptose induite par TRAIL ou le mécanisme de sensibilisation. Ici, nous avons montré que la régulation à la hausse de DR5 est critique pour la sensibilisation des cellules à TRAIL, comme l'inactivation génique du récepteur (DR5) atténué l'apoptose induite par TRAIL. Ainsi, DR5 up-régulation peut sensibiliser les cellules à l'apoptose induite par TRAIL [27]. De nombreux mécanismes ont été décrits pour l'induction de la RD, y compris la génération de ROS, l'induction de p53 et NF-kB, DDIT3 (dommages à l'ADN inductible par transcription 3), le récepteur-γ et MAPK activation activés par les proliférateurs de peroxysomes [27], [28] . Dans la présente étude, nous avons constaté que casticine induite par CHOP et que gene silencing de CHOP par siRNA bloqué l'effet de casticine sur l'induction de l'apoptose et DRs induite par TRAIL. Nos résultats sont similaires à ceux d'autres études indiquant que CHOP se lie au promoteur de DR5 et upregulates cette expression du récepteur [12], [29].

Il est bien connu que CHOP est un ER typique réglementé stress protéine impliquée dans ER stress induit par l'apoptose [11]. Notre constat de CHOP induction par casticine suggère que casticine peut déclencher le stress du RE et d'augmenter les niveaux de GRP78 et eIF2α expression, qui sont des protéines supplémentaires accumulées ou augmenté pendant le stress ER [17]. Par conséquent, il semble probable que casticine induit le stress du RE. Salubrinal est un inhibiteur sélectif de ER stress induit par apoptose [30]. La présence de salubrinal apparemment protégé les cellules cancéreuses gastriques de casticine ainsi que l'apoptose induite par TRAIL. Ainsi, il semble que casticine induit l'apoptose potentialisation en impliquant des mécanismes de stress du RE.

Nous avons trouvé que peut-être le signal amont le plus important lié à casticine modulation des récepteurs TRAIL est ROS. Nos résultats démontrent sans équivoque que casticine induit la production d'ERO, et que la trempe des ERO par l'anti-oxydant N
-acetylcysteine ​​atténué l'effet de casticine sur l'induction de CHOP et DR5. Nous avons constaté que la trempe ROS également atténué casticine potentialisation de l'apoptose induite par TRAIL. Nos résultats sont en accord avec ceux rapportés dans les études précédentes utilisant sulforaphane, zerumbone et celastrol pour DR5 induction. Les résultats des présents et des études antérieures indiquent fortement que les ROS joue un rôle majeur dans la modulation du récepteur TRAIL DR5 [31], [32]. Nos résultats sont en accord avec ceux des travaux antérieurs, nous avons signalé que casticine a provoqué l'accumulation de cellules sous-G1 et augmentation de la production de ROS dans les HeLa, CaSki et des lignées cellulaires SiHa, mais pas dans les CMSP [33]. Mais nous avons montré que casticine a réduit la teneur en GSH ( P < 0,05
), mais n'a pas affecté le niveau intracellulaire de ROS dans les cellules /G2 PRF /5 et Hep PLC [10]. Une explication plausible pour le conflit de données apparent est qu'il existe des différences dans la modalité qui régulent les actions dans différents types de cellules.

Nous avons également identifié que l'autre mécanisme de sensibilisation implique la régulation des protéines anti-apoptotiques. Casticine downregulated les elevels d'expression de Bcl-2, Bcl-xL, et XIAP survivine, qui ont toutes été liées à la résistance des cellules tumorales à TRAIL [34], [35]. En effet, la régulation négative de la protéine XIAP, Bcl-2 et l'expression de Bcl-xL a été montré pour sensibiliser les cellules tumorales à TRAIL [36], [37]. Wang et al.
(2005) [8] a montré que casticine diminué Bcl-2 et les niveaux d'expression régulée à la baisse le taux de Bcl-2 /Bax expression dans des cellules K562. Nos résultats sont également en accord avec des études antérieures qui ont démontré que l'extrait d'éthanol du fruit mûr séché de Vitex agnus-castus
a diminué le niveau de Bcl-2, Bcl-xL et Bid protéines, et a augmenté dans le niveau de la protéine Bax [7]. Le rapport de Chen et al.
(2011) a récemment montré que Bax a été régulée à la hausse, tandis que les niveaux de Bcl-xL et XIAP expression ont été downregulated par casticine [33].

Kobayakawa et al. a rapporté que casticine nettement inhibé la croissance des cellules KB, mais n'a pas inhibé la prolifération des cellules A431, qui est similaire aux lignées cellulaires normales 3T3 Swiss Albino et TIG-103 [38]. Dans la présente étude, nous avons montré que casticine spécifiquement l'apoptose induite dans les cellules cancéreuses gastriques humaines mais pas dans GES-1 cellules, bien que le mécanisme d'induction de l'apoptose sélective n'a pas été déterminée. Nos résultats suggèrent que casticine peut être un agent anti-tumeur spécifique avec une faible toxicité.

En résumé, nos résultats démontrent que casticine contribue à la sensibilité des cellules tumorales à Trail en utilisant de multiples mécanismes. Casticine favorise d'abord la génération de ROS et déclenche le stress du RE induit alors DR5 surexpression par l'activation de CHOP qui améliore par conséquent l'activation induite par TRAIL des voies d'apoptose mitochondries médiée par DR5-induite et. En même temps, facilite casticine induite par TRAIL mort cellulaire par apoptose en inhibant anti-apoptose expression de la protéine et l'activation des protéines pro-apoptotiques. Les recherches futures devraient viser à réaliser pleinement le potentiel d'une combinaison de casticine et TRAIL thérapie pour traiter les patients atteints de cancer de l'estomac. Par conséquent, des études supplémentaires des actions de casticine dans des modèles animaux seront nécessaires.

Matériel et méthodes

Réactifs

casticine (pureté ≥ 98%) a été acheté de Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Chengdu, Chine), présente sous forme de cristaux jaunes (poids moléculaire, 374,3). Casticine a été dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour faire une /l de solution mère à 10 mmol et diluée dans un milieu de culture cellulaire à la concentration requise immédiatement avant utilisation. Les réactifs suivants ont été achetés auprès de Hunan Clonetimes Biotech Co. Ltd (Changsha, Chine): soluble TRAIL humaine recombinante (Pepro Tech), Kit Apoptose ELISA de détection de cellules (Roche), 2 ', 7'-dichloro diacétate (DCFH-DA; Molecular Probes Inc.), salubrinal (EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA), la N-acétylcystéine (NAC; Sigma), la tunicamycine (Sigma), iodure de propidium (PI, Sigma), Caspase 3 Activity Detection Kit (Millipore), caspase 8 Colorimétrie Activité Assay Kit 25 (Millipore), Caspase 9 Colorimétrie Assay Kit Activité (Millipore), anticorps contre DR5 (Prosci Inc). Des anticorps contre DR4, PARP, Bcl-2, Bax, Bid, survivine, CHOP, GRP78 et ATF4 ont été obtenus à partir de Santa Cruz Biotechnology. L'anticorps anti-XIAP a été acheté auprès de Cell Signaling Technology, Danvers, États-Unis. les inhibiteurs de caspases, comme zVADfmk, zDEVD-fmk, zIETD-fmk et zLEHD-fmk ont ​​été achetés chez R &D Systems (Minneapolis, MN)

culture
Cell

BGC-823, SGC. les cellules cancéreuses gastriques -7901 et MGC-803 humaines ont été obtenues auprès du Centre pour la Chine type Culture Collection (CCTCC; Wuhan, Chine) et GES-1 cellules de l'Institut d'oncologie de l'Université de Beijing. Les cellules ont été maintenues dans Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml de pénicilline et 100 U /ml de streptomycine dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO _{2 à 37 ° C. Les cellules ont été traitées avec diverses concentrations de casticine ou TRAIL ou à la fois pour le dosage MTT. Casticine (1,0 pmol /l) et TRAIL (25, 50 ng /ml) seul ou en combinaison ont été appliqués aux BGC-823 cellules utilisées pour détecter l'apoptose.}

test MTT

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 0.5104 cellules /puits et mis en incubation pendant 24 h, suivie d'un traitement avec diverses concentrations de casticine et TRAIL pendant 24 heures ou traitées avec casticine pendant 12 h, suivi d'un traitement avec le TRAIL pendant 24 h. analyse colorimétrique MTT a été effectué comme décrit précédemment [10]. Le circuit intégré _{50 valeur à laquelle 50% d'inhibition de la croissance cellulaire comparée avec le diméthylsulfoxyde (DMSO) de contrôle, a été calculée par analyse de régression non linéaire en utilisant le logiciel GraphPad Prism (San Diego, CA).}

Flux en utilisant la cytométrie coloration PI

les cellules ont été ensemencées à une densité de 4 x 10 ^{6 cellules /ml dans 100 ml de flacons de culture pendant 24 h et ensuite traitées avec un milieu contenant différentes concentrations de casticine ou TRAIL, ou les deux en même temps pendant les temps indiqués. L'apoptose des cellules a été détectée en utilisant la cytométrie de flux. (FCM; Amérique BD Company, FACS 420)}

histone /fragment d'ADN ELISA

Le kit de test ELISA de détection de l'apoptose cellulaire a été utilisée pour détecter l'apoptose dans les cellules traitées avec casticine selon le protocole du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 1 x 10 ^{4 cellules /puits pendant 24 h, et le milieu contenant différentes concentrations de casticine ajouté selon les besoins. Après 24 h, le cytoplasme des groupes témoins et traités a été transféré à la plaque de 96 puits peridiumed par la streptavidine, incubées avec l'anticorps histone biotinylée et de la souris à la peroxydase ADN marqué anti-humain pendant 2 h à température ambiante. L'absorbance à 405 nm a été mesurée avec un appareil Immunosorbent EXL-800 Type Enzyme-Linked.}

Analyse de la caspase-3, -8 et -9 activités

Les activités de caspase-3, -8 et -9 ont été évalués en utilisant le 3 Kit Caspase Activity Detection, la Caspase 8 Colorimétrie Activité Assay Kit 25 et le kit d'analyse Caspase 9 Colorimétrie activité, respectivement. En bref, les lysats cellulaires ont été préparés après leur traitement respectif avec des agents expérimentaux. Les essais ont été réalisés dans des plaques à 96 puits par incubation de 20 pg de lysats de cellules dans 100 ul de tampon de réaction (1% de NP-40, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 137 mM, glycerol à 10%) contenant 5 pM de la caspase-3 substrat Ac-DEVD- p
NA, le substrat Ac-IETD- caspase-8 p
NA ou le substrat Ac-LEHD- caspase-9 p
NA.

• PLOS ONE: Étude de phase II Évaluation 2 schémas posologiques de forétinib Oral (GSK1363089), ÉÉGC /VEGFR2 Inhibitor, chez les patients atteints du cancer métastatique gastrique
• PLOS ONE: Association entre la réduction des taux d'adiponectine plasmatique et risque d'infection bactérienne après chirurgie du cancer gastrique