PLoS ONE: Aktiviranje Transkripcija Faktor 4 stiče se višestruke rezistencije na lijekove fenotip na želudac stanica raka kroz transaktiviranje SIRT1 Expression

Sažetak pregled

Pozadina pregled

višestruke rezistencije na lijekove (MDR) u raka želuca ostaje glavni izazov za kliničko liječenje. Aktivirajući faktor transkripcije 4 (ATF4) je gen odgovor na stres koji su uključeni u homeostazu i stanične zaštite. Međutim, izraz i funkcija ATF4 u raka želuca MDR ostaje nepoznat. U ovom istraživanju, istražujemo da li ATF4 igraju ulogu u želučanom MDR raka i potencijalnih mehanizama. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

Pokazali smo da ATF4 pojačana ekspresija confered MDR fenotip na želučane stanice raka, dok obaranje ATF4 u MDR varijante izazvana ponovno preosjetljivost. U ovom radu je također pokazala da je NAD ^{+ - ovisno HDAC SIRT1 je potreban za ATF4 inducirane MDR učinak u želučanih stanica raka. Pokazali smo da ATF4 olakšan MDR u želučanim stanicama raka kroz izravno vezanje na SIRT1 promotor, što je rezultiralo SIRT1 up-regulacije. Znakovito je da inhibicija SIRT1 Netlogu malim ometa RNA (siRNA) ili specifičnog inhibitora (EX-527) ponovno je terapijski osjetljivost. Također, povećana /Bax odnos Bcl-2 i MDR1 razina ekspresije pronađeni su u ATF4-ekspresijom stanica. Pregled}

Zaključci /Značaj pregled

Mi smo pokazali da ATF4 imao ključnu ulogu u regulaciji MDR u želučanim stanicama raka, kao odgovor na kemoterapiju i Ovi rezultati sugeriraju da ciljaju ATF4 mogao osloboditi terapijsku rezistenciju kod raka želuca pregled

Izvor:. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et al. (2012) aktivirajući transkripcijski faktor 4 stiče se višestruke rezistencije na lijekove fenotip na želudac stanica raka kroz transaktiviranje SIRT1 izražavanja. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431 pregled

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 5. rujna 2011; Prihvaćeno: 8. siječanj 2012. godine; Objavljeno: 17 veljača 2012 pregled

Copyright: © 2012 Zhu et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od kombiniranih donacija od Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (NO.81090270, NO.81090273 i NO.81000864), kineska Postdoktorska znanstvena zaklada (NO.20100471776), nacionalni ključ i Osnovni Razvojni program za istraživanje u Kini ( NO. 2010CB529302), a projekt tehnologijskog razvitka Nacionalni Komunalni (2009ZX09103-667 i 2009ZX09301-009-RC06). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rezistencije na lijekove je obično glavni uzrok neuspjeha kemoterapije protiv malignih tumora, uključujući rak želuca [1] .The termina višestruku otpornost na klasično se koristi za definiranje otpornosti na fenotip, gdje stanice postaju otporne istovremeno na različite lijekove bez kontakta očito strukturna sličnost is različitim staničnim ciljevima [2]. MDR javlja češće kod novih lijekova koji imaju značajniju učinkovitost nakon prve primjene u liječenju raka. Klinička korist od više lijekova ograničena je prirodnog i stečene otpornosti tumorskih stanica, što je gotovo uvijek je više činilaca u [3] prirode. Čimbenici koji mogu utjecati na osjetljivost na droge uključuju: ubrzan izbacivanja droge, aktivaciju droga i inaktivaciju, promjene u cilju droga, DNA metilacije, obrada štete uzrokovane lijekovima i izbjegavanje apoptoze [4] pregled

karcinoma želuca. relativno neosjetljiva kemoterapeuticima. MDR mehanizmi želučanih stanica raka su uglavnom bili ispitivani u našem laboratoriju i drugdje [1], [4], [5], ali oni nisu u potpunosti razjašnjeni, što znači da drugi nepoznati molekule ili putevi mogu biti uključeni u razvoj MDR. pregled

u stanicama sisavaca, eukariotske prevođenje iniciranje faktor 2 α podjedinica (eIF2α) fosforilira različite eIF2α kinaze u odgovoru na različite stresne signale, uključujući i anoksije /hipoksije, endoplazmatski retikulum stres, nedostatak amino kiseline i oksidacije stres. Ta fosforilacija događaj dovodi do brzog smanjenja globalnog biosinteze proteina istodobno s indukcijom translacijske ekspresiju gena, uključujući i ATF4 pregled koji funkcioniraju kako bi ublažili staničnog oštećenja od stresa [6], [7]. Iako ATF4 može igrati proapoptotska ulogu u uvjetima teške ili dugotrajnijeg stresa, ATF4 pregled je jaki stres reagiraju gen mislili da igraju zaštitnu ulogu reguliranjem stanični adaptaciju na nepovoljne okolnosti u odgovoru integrirani stres ( ISR) [8], [9], [10]. Nedavno, pojačanom ekspresijom ATF4 je izvijestila da se dolazi do izražaja u raznim tumorima i zaštititi stanice tumora protiv mnogobrojnih stresova, kao i čitav niz terapijskih sredstava protiv raka [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Potencijalni mehanizmi odgovorni za tu zaštitu su autophagy indukciju, promociju popravka oštećenja DNA, i up-regulaciji unutarstaničnih glutation [12], [13], [14], [17]. Međutim, izraz i funkcija ATF4 u raka želuca MDR ostaje nepoznat. Pregled

U ovom istraživanju smo izvijestili da je ATF4 bila je značajno viša u MDR odgovor želučanih stanica raka u usporedbi s roditeljskim kontrolnim stanicama. Obaranje ATF4 pregled po siRNA značajno osjetljivi na stanice s MDR na niz kemoterapeutika, a up-regulaciji ATF4 u SGC7901 i AGS stanica donio im lijekove otporne. Također smo pokazali da ATF4 promovirao raka želuca MDR dijelom kroz regulaciju ekspresije SIRT1. A inhibicije SIRT1 djelomično mogao preokrenuti rak želuca MDR posredovana s ATF4. Ovi podaci ukazuju na to da ciljaju ATF4 može pružiti novu terapeutsku mogućnost za promjenu smjera kliničkog raka želuca MDR. Pregled

Rezultati

ATF4 modulira MDR fenotip želučanih stanica raka pregled

kako bi se utvrdilo je li ATF4 je uključen u razvoj MDR u želuca stanica karcinoma, razina ATF4 su detektirani Western analizom i qPCR u SGC7901 staničnoj liniji i njegova MDR varijante, SGC7901 /VCR i SGC7901 /ADR. Oba proteina i mRNA razine ATF4 su bili puno veći u staničnim linijama otpornih nego u roditeljskim stanicama (Sl. 1). Pregled

Da bi istražili da li ATF4 prekomjerna ekspresija je dovoljna da izazove MDR fenotip u želučanih stanica raka, ATF4 pregled ekspresija cDNA je stabilno transficirna u SGC7901 i AGS stanica. Prvo, CDDP osjetljivost je testirana testom formiranja kolonije. Kao što je prikazano kvantifikaciju testa formacije kolonije, ATF4 hiperekspresija rezultiralo gotovo 3-struko povećanje broja kolonija u usporedbi s praznim vektorom stanicama koje izražavaju (Sl. 1B). MTT ispitivanja također pokazuju da je IC _{50 Vrijednosti SGC7901-ATF4 za ADR, VCR, CDDP i 5-FU su značajno porasla u odnosu na prazan vektor transfektirane stanice (Sl. 1d). Pregled}

Kao što je razine ATF4 su povišene u MDR stanice raka želuca, mi i dalje htjeli utvrditi da li ATF4 ciljanja mogu ponovno senzibilizirati stanične linije MDR. Obaranje ATF4 pregled po siRNA u SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR stanica doveli do 2 do 3 puta smanjenje broja stanica kada se koristi u kombinaciji s CDDP (sl. 1 C). Podaci na slici. 1E također sugeriraju da dolje reguliranje ATF4
značajno obrće otpor SGC7901 /ADR stanica kao odgovor na kemoterapiju. Pregled

Kao što je inhibicija apoptoze je jedan od važnih mehanizama MDR, također istražuju kapacitet od SGC7901 /ADR stanica transfeciranih specifičnog ATF4 pregled siRNA proći CDDP-induciranu apoptozu Hoechst bojenje i fragmentiranju DNA testovima. Tretman SGC7901-ATF4 i SGC7901 /ADR-SCR stanica s naznačenim koncentracijama CDDP 36 sati ne induciraju apoptozu bilo, kao što je procijenjeno pomoću Hoechst obojenje jezgre (Sl. 1F), a fragmentacija DNA analiza (Sl. 1 g). Nasuprot tome, SGC7901-Vector i SGC7901 /ADR-siATF4 stanicama pokazao je značajno apoptoze, s povećanom učestalošću Morbus kondenzira i fragmentiranih jezgre i formiranje DNA ljestve. Štoviše, očitiji cijepanje procaspase-3 se gleda nakon tretmana s CDDP u SGC7901-vektora i SGC7901 /ADR-siATF4 stanica u usporedbi s SGC7901-ATF4 i SGC7901 /ADR-SCR stanica, odnosno (Sl. 1 H). Pregled

Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da ATF4 ne prenosi MDR fenotip do želučanih stanica raka i da je ciljanje ATF4 daje metodu senzibiliziranju stanica otpornih na kemijske tretmane. pregled

ATF4 se regulira ekspresiju SIRT1, MDR1 , Bcl-2 i Bax u želučanim stanicama raka

Prethodne studije su izvijestili da su stanice s prekomjernom ekspresijom SIRT1 prikazan smanjena osjetljivost na kemoterapiju višestrukim mehanizmima [18], [19], [20], [21]. smo zanima za određivanje je li SIRT1 pregled, što je gen povezan sa stresom kritična multirezistentne razvoj može biti nizvodni cilj ATF4 odgovoran za posredovanje ATF4 inducirane MDR u želučanim stanicama karcinoma. pregled

razina SIRT1 u LV-vektor i LV-ATF4 stabilno transfektirane SGC7901 stanice su ispitane qPCR i Western blot. Hiperekspresija ATF4 bio je povezan s povećanom ekspresijom SIRT1 na oba transkripcijskim (Sl. 2A, lijevo) i razine translacijske (Sl. 2B, lijevo). Za razliku od toga, siRNA obaranje ATF4 pregled u SGC7901 /ADR stanica rezultirala je značajnim smanjenjem endogenog SIRT1 pregled izražavanja (Sl. 2A i 2B, desno). Ovi rezultati ukazuju na to da ATF4 up-regulira SIRT1 pregled izraz u želučanih stanica raka.

Kako dalje istraživati ​​molekularne mehanizme uključene u ATF4 vezane MDR raka želuca, također pregledao MDR1, MRP, Bcl-2 i Bax razine ekspresije kod želučanih stanice raka koriste gore. Kao što je prikazano na slici. 2B, ATF4-iskusan stanice izražavaju više MDR1 u usporedbi s kontrolnim stanicama. U međuvremenu, nema očitih razlika u MRP ekspresije naći u bilo kojoj od ovih staničnih linija. Zanimljivo je da i Bcl-2 i Bax razina ekspresije bila viša u ATF4-iskusan stanice, u odnosu na kontrolnu staničnim linijama, dok je ekspresija Bax pokazala samo neznatne promjene, što znači da se na regulaciju bcl-2 u Bax omjer bi potiskivanje apoptoze drogom izazvanog želuca stanicama raka ATF4-ekspresijom. pregled

Ovi rezultati pokazuju da ATF4 potiče MDR sposobnost želuca stanica raka kroz više mehanizama. pregled

ATF4 transaktivira SIRT1 promotorsku aktivnost i izravno se veže na promotor SIRT1 pregled

kako bi se utvrdilo je li ATF4 posreduje SIRT1 pregled transkripciju gena, 293T stanice su co-transfektirane s 1,2 kb SIRT1 pregled promotor reporter plazmid i ATF4 pregled plazmida ekspresije. Pokusna luciferaznog reportera je pokazala da je SIRT1 pregled promotora aktivnost značajno aktiviran ATF4 na način ovisan o dozi (Sl. 3A). Pregled

U pokušaju da se dobije određeni uvid u mehanizme SIRT1 pregled, indukcija, ispitali smo mogućnost pojave putevi od ATF4. Analizirajući 5-bočnoj slijed SIRT1 pregled gena s bioinformatike softver (Tfsitescan usluga, Tess i Genomatix), dva ATF4 navodni vezna mjesta su identificirati u bp regiji -950 do -600 od SIRT1 pregled promotor (Sl. 3B). pregled

Kako bi se utvrdilo je li SIRT1 pregled je izravna meta ATF4, čip s ATF4 protutijela upotrebom SGC7901-ATF4 stanica pokazala obogaćivanje i veznih mjesta unutar SIRT1 pregled promotorske regije, što ukazuje da su RNK i zatim na razini proteina povećava SIRT1 pregled u ATF4-izražavanje stanične linije su vjerojatno zbog izravne interakcije ATF4 s SIRT1 pregled gena promotora (sl. 3C). pregled

kako istražiti ulogu dviju vezanja ATF4 mjestima u reguliranju SIRT1 transaktiviranje, mutagenezom je korišten mutirati te stranice. Luciferaze analiza je pokazala da je bilo mutira na mjestu vezivanja 1 ili vezno mjesto 2 smanjena aktivnost SIRT1 promotor izazvano ATF4. Nadalje, mutacija oba vezna mjesta ukinuta aktivnost SIRT1 promotora. Ovi rezultati sugeriraju da su vezna mjesta i ATF4 uključeni u transaktivacije od SIRT1 promotora (sl. S1). Pregled

Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da SIRT1 je direktni transkripcije meta ATF4. Pregled

SIRT1 pregled inhibicija siRNA djelomično poništava MDR fenotip želučanih stanica raka ATF4-ekspresijom pregled

identifikacija ATF4 posredovane SIRT1 pregled razina ekspresije povećanja želučanih stanica raka, zatraži nam je analizirati ulogu ovog puta u želučanom MDR raka. Da bi se riješila toga, usporedili smo In vitro pregled osjetljivost na lijek u ATF4 stabilno transfektirane želučane stanice raka nakon transfekcije SIRT1 pregled siRNA ili kodirani siRNA stvaranjem kolonija i MTT testom. Obaranje SIRT1 pregled po siRNA u SGC7901-ATF4 stanica dovela je do > 40% smanjenje broja kolonija kada se koristi u kombinaciji s CDDP (Sl. 4a, gornja). Taj efekt također opaža kod AGS-ATF4 stanicama (Sl. 4A, niži). Osim toga, podaci iz MTT pokusom je također pokazala da je obaranje SIRT1 pregled mogu ponovno senzibilizirati SGC7901-ATF4 stanica na kemijske droge, ali to se nije dogodilo u kodiranim siRNA inficiranim stanicama (Sl. 4b). Pregled

Da bi se utvrdilo je li SIRT1 štiti stanice od CDDP-inducirane apoptoze, SGC7901-ATF4 stanice transficirane s SIRT1 pregled siRNA ili zamagljene siRNA su tretirani s CDDP označena Annexin V i PI. Apoptoze stanice su identificirane Annexin V obilježavanje. Apoptotični postotak SIRT1 siRNA transficirane SGC7901-ATF4 stanica bila je značajno veća nego kod kontrolnih stanica (sl. 5a, 72,8% prema 25,9%). Pojava kondenzirani i fragmentiranih jezgre također povećana u SIRT1 siRNA transficiranih stanica u odnosu na kontrolne stanice (Sl. 5B). Osim toga, cijepanje procaspase-3 opažena već su 12 h nakon tretmana s 10 ug /ml CDDP u SIRT1 siRNA transfektirane SGC7901-ATF4 stanice, ali ne u kodiranim siRNA obrađenih stanica, čak i nakon 24 sata od CDDP liječenja (Sl. 5C ). Ovi rezultati ukazuju na to da SIRT1 pojačana ekspresija potiskuje CDDP apoptozi.

Da bi se odredio utjecaj down-regulacije SIRT1 po siRNA na MDR povezane molekule, ispitali smo MDR1, MRP, Bcl-2 i Bax razine ekspresije u SGC7901-ATF4 stanica nakon transfekcije s SIRT1 siRNA ili kodiranom siRNA. Podreguliranje MDR1 opažena kod tretiranih siRNA SIRT1 stanica u (Sl. 5D) u usporedbi s kontrolnim stanicama. Nasuprot tome, nađeno je nema očitih razlika MRP, Bcl-2, i Bax ekspresije između uzoraka. Pregled

Ta opažanja ukazuju na to da SIRT1 posreduje ATF4 induciranu MDR učinak u želuca stanica raka. Pregled

Inhibicija SIRT1 aktiv-senzibilizira ATF4 transfektiranih stanica do sredstava koja oštećuju DNA

kako bi osigurao dokaz da SIRT1 katalitička aktivnost je također odgovorna za ATF4 inducirane MDR, SGC7901-ATF4 bile tretirane EX-527 je novi, moćan i specifični inhibitor malih molekula SIRT1 i zatim obradom s različitim kemijskim lijekovima. Prvo, utvrdili smo bazalnu citotoksičnost EX-527 u LV-vektor i LV-ATF4 stabilno transfektirane SGC7901 stanica. MTT pokazale da EX-527 pri koncentracijama do 10 uM ne inhibira, već malo povećan, održivost obje stanične linije (Sl. 6A). Dalje je ispitan SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2 i Bax razinu nakon 24 sata inkubacije sa ili bez naznačenim dozama EX-527 u želučanoj stanica raka iznad koristi. Samo izraz MDR1 je podregulira EX-527 u koncentracijskom ovisan način (sl. 6B). Zatim smo prethodno inkubiranoj SGC7901-ATF4 stanica s nosačem ili EX-527 (0,5, 1, 2, 4 i 10 uM) tijekom 24 h, a zatim CDDP- i 5-FU-posredovane stanične smrti je praćena. Kao što je prikazano na slici. 6C, EX-527 značajno poboljšana citotoksičnost oba lijeka na način ovisan o dozi. Također smo utvrdili mogući sinergijski učinak EX-527 na različitim dozama CDDP- i 5-FU posredovanoj inhibiciji proliferacije stanica u SGC7901-ATF4 stanica. Kao što se očekivalo, 10 uM EX-527 je dovoljno da se pojača citotoksičnost oba lijeka (Sl. 6D). Pregled

Ovi rezultati pokazuju da SIRT1 aktivnost igra ključnu ulogu u ATF4 induciranu želuca MDR tumora i to uloga može biti posredovan dijelom kroz MDR1 izražavanja. pregled

Rasprava pregled

MDR predstavljati značajne kliničke izazove za učinkovitu kemoterapiju mnogih ljudskih malignih bolesti. Mehanizmi pomoću kojih se stanice razvijaju rezistenciju su višestruki i složeni, pa opširniji razumijevanje od njih, kao i identifikacija novih mehanizama za kemijska otpornost, bit će osobito korisna u pružanju boljih terapijskih mogućnosti. Ova studija je prvo izvješće da visoke razine ATF4, obično u tumorskim stanicama pod stresnim okolnostima, prenosi želučane stanice raka s MDR fenotipa, a on određuje da taj učinak posredovan djelomice transaktivacije od SIRT1 izražavanja. Pregled

ATF4 pregled i SIRT1 pregled su evolucijski konzerviranih stres geni odgovor koji su uključeni u širokom spektru bioloških procesa, od kojih su mnogi spasonosan za homeostaze i staničnu zaštitu [22], [23], [ ,,,0],24]. Oba ova gena su inducirana u odgovoru na razne stresove uključujući nedostatak kisika (hipoksije /anoksije) oksidativnog stresa, oštećenja DNA, prehrambene deprivacije i kemootrovne stresa. Levenson VV i sur. Pregled, prvi izvijestio da su promjene u ekspresiji ATF4 mogla igrati ulogu u plejotropnim otpornost na različite klase lijekova DNK-ciljanje [16]. U posljednjih nekoliko godina, nekoliko studija je pronašla da ATF4 bio uključen izravno ili neizravno u razvoju rezistencije na lijek kroz autophagy, glutation-ovisnim redoks sustava, te oštećenje DNA popravak [11], [12], [13], [14] [15], [16], [17], [25], [26]. Ovdje pokazujemo da se zaštitna sposobnost ATF4 doista posreduje MDR fenotipu ATF4-ekspresijom želučane staničnim linijama raka, kao odgovor na kemoterapiju. Our rezultati jasno pokazuju da je prekomjerna ekspresija više ATF4 u želučanim stanicama raka povezana je sa više otpora, a obaranje ATF4 inducirane ponovno preosjetljivost. Ovi podaci sugeriraju da je vjerojatno ATF4 važan medijator nizvodno otpornosti uzrokovane višestrukim mehanizmom i stoga vrijedan terapeutski cilj. Ipak, kao jedan od najvažnijih transkripcijskih medijatora ISR koji aktivira razne ciljnih gena koji potiču obnovu homeostaze, ATF4 također može posredovati otpor od strane drugih mehanizama. U našoj studiji, SIRT1 je utvrđeno da je viša u stanicama ATF4-ekspresijom u odnosu na vektor transficirana stanica. Za razliku od toga, obaranje ATF4 pregled sa ATF4 specifične siRNA dovelo do down-regulacije SIRT1 u MDR stanice raka želuca. Naši rezultati pokazuju da SIRT1 može biti nizvodno medijator ATF4 induciranog raka želuca MDR. Pregled

Kao član ATF podvrstu osnovnoj regiji leucinskog zatvarača (bZIP) faktore transkripcije [22], ATF4 ima potencijal da djeluje ili kao transkripcijski aktivator ili represore transkripcije putem ATF ili cAMP odgovarajućim elementom (CRE) veznih mjesta [22]. Konsenzus vezanja za ATF je definirana kao TGACGT (C /A) (G /A) [27], što je sekvenca identična CRE konsenzusa elementa (TGACGTCA) [28]. Također, dobro sačuvana jezgra motiv - ACGT - u većini Cresu [29] može se vezati na različite faktore bZIP ovisno o bočnih baza jezgre motiva [22], [30], [31]. U našem istraživanju pronađena su dva navodni vezna mjesta ATF-CRE u 1.2 kb SIRT1 pregled promotorska regija, a ATF4 direktno aktivira SIRT1 pregled transkripcije putem vezanja na obje vezne elemente. Međutim, kako su se dva vezna mjesta igraju svoje uloge prema detaljnim stres okolnostima ostaje nepoznata i zahtijeva daljnja istraživanja. Pregled

sisavaca SIRT1 pregled je najbliži homologa od kvasca SIR2 pregled i najviše su ispitivane član obitelji Sirta. To je jako uključen u regulaciji staničnih procesa koji određuju dugovječnost, uključujući i anti-apoptoze, živčana zaštite, i staničnog starenja ili starenje [32]. U posljednje vrijeme, sve veći broj istraživanja medjusobno povećana ekspresija SIRT1 otpornosti na kemoterapiju i ionizirajućeg zračenja [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Na primjer, prekomjerna ekspresija SIRT1 je pronađen u neuroblastoma rezistentne, osteosarkom, dojke, jajnika, prostate, debelog crijeva i staničnim linijama raka pluća u usporedbi sa srodnim lijek osjetljivih. Svi ovi lijeka učinci SIRT1 otporne bi moglo biti zbog anti-apoptotičkog djelovanja [37], [38] i odsutnost gena za suzbijanje tumora [39]. Konačno, možemo predvidjeti da ako SIRT1 je uključen u ATF4 inducirane MDR inhibicija SIRT1 treba utjecati na osjetljivost ATF4-ekspresijom stanica kao odgovor na kemoterapiju. Kao što se očekivalo, i siRNA i farmakološka inhibicija SIRT1 mogu ponovno senzibilizirati ATF4-ekspresijom stanica na kemijske droge. Osim toga, naša studija ukazuje na to da SIRT1 štiti stanice od smrti dijelom kroz anti-apoptoze učinkom. Pregled

On je izvijestio da je MDR1 bila viša u stanicama s povećanom ekspresijom SIRT1 [18], [36]. U ovoj studiji, također smo pokazali da MDR1 je viša u ATF4-ekspresijom stanica i obaranje SIRT1 s SIRT1 određenom siRNA ili inhibirati njezino djelovanje sa EX-527 mogla bi dovesti do down-regulacije MDR1, što je u skladu s lijekom -resistant uloga koju SIRT1. Međutim, /Bax omjer Bcl-2, koja je viša u stanicama ATF4-ekspresijom bio SIRT1 neovisan, sugerirajući da SIRT1 neovisno mehanizmi također igraju važnu ulogu u ATF4 inducirane MDR u želučanom stanica raka.

Ukratko, pokazali smo da ATF4 ne prenosi MDR fenotip na stanicama raka želuca, a taj učinak je djelomično posredovano transaktivaciju SIRT1 prekomjernom ekspresijom. Štoviše, ATF4 je valjan cilj u želučanom tumora otpornih na lijekove i razvoju učinkoviti inhibitori ATF4 treba uzeti u obzir u budućnosti. Ovi rezultati pružaju nove uvide u ulozi ATF4 u kontroli ekspresije SIRT1 i na svojim stresom otpora značajke u nastanku tumora i kemoterapije. To je posebno važno za kliničku obzir, kao ATF4 može biti up-regulirana nedostatka kisika, oksidativni stres, prehrambene oduzimanje i gotovo svih negativnih stresora u mikro okolinu tumora, koji bi mogao biti otet od strane stanica raka da izbjegne inhibicije proliferacije i stanične smrti u odgovor na kemoterapiju. Dakle, intervencija utemeljena na ometanje stresa izazvanog ATF4 ekspresija u stanicama raka može biti učinkovit u zaobilaze ili unazad rezistenciju na rak želuca. Pregled

materijali i postupci

Za detaljne metode, pogledajte Tekst S1 . pregled

stanična kultura i reagensi

ljudskog želučanog adenokarcinoma stanične linije SGC7901 (dobiven iz akademije Vojnomedicinsku znanosti, Beijing, China), a MDR varijante, SGC7901 /ADR i SGC7901 /videorekorder (uspostaviti i održavati u našem laboratoriju) i AGS (dobiveni iz banke stanica kineskog akademije znanosti, Shanghai, Kina) uzgajane su u RPMI-1640 mediju s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Hyclone) i penicilin /streptomicina. 293T stanice (također dobiveni iz banke stanica kineskog akademije znanosti) su kultivirane u DMEM s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma. Održavati MDR fenotip, adriamicin (s konačnom koncentracijom od 0.5 ug /ml) i vinkristin (s konačnom koncentracijom od 1 g /ml) dodani su u medije za kulturu za SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR stanica. EX-527 (Sigma) otopi se u DMSO u naznačenim koncentracijama. Adriamicin (ADR), vinkristin (VCR), cisplatin (CDDP), i 5-fluorouracil (5-FU) je otopljen u normalnoj fiziološkoj otopini na naznačenim koncentracijama. Pregled

Cell transfekcije i stabilna stanična linija

ljudska ATF4 pregled plazmida ekspresije (pCMV5-ATF4) ljubazno je ustupio prof Amy S. Lee [25]. Lentivirusni vektor koji kodira siRNA specifične ATF4 pregled i kontrolne siRNA dobiveni su uz uporabu PLKO.1-TRC (Addgene) i označene su kao LV-siATF4 i LV-SCR kontrole, respektivno. Lentivirasni vektor koji kodira ljudsko ATF4 gena su izgrađene u FUW-TETO (Addgene), koji je određen kao LV-ATF4. Prazan vektor upotrijebljen je kao negativna kontrola, su označeni kao LV-vektora. Stabilne stanične linije dobivene su transfekcijom navedenih lentivirusni konstrukata i zatim selekciju puromicinom ili zeocin (Invitrogen), redom. Stanica transfekcijom stvaranje stabilnih staničnih linija koje su izvedene korištenjem standardnih postupaka. Sekvence siRNA konstrukti mogu se naći u tekstu S1. Pregled

Imunobloting pregled

Prikupljanje proteinskim ekstraktima i imunoblot analiza su izvedene korištenjem standardnih postupaka. Za izvore antitijela, pogledajte Tekst S1. Pregled

Kolonija analiza formacija pregled

Test na koloniziranje je izvedena, kao što je prethodno opisano [40], uz male modifikacije (Tekst S1). Pregled

Annexin V bojenje i FACS analizu pregled

Annexin V bojenje i FACS analize su izvedene korištenjem standardnih postupaka. Stanice negativne i za PI i Aneksin V bojenja su klasificirani kao živih stanica, stanica koje su obojene pozitivno za aneksina V samo su klasificirani kao ranih apoptotičnih stanica i PI pozitivne i Aneksin V pozitivne stanice su stanice koje se podvrgavaju kasnim fazama apoptoze. Pregled

DNA fragmentacije test pregled

DNA fragmenti su izvađeni s DNK ljestve Extraction Kit s Spin Stupac (C0008, Beyotime Co, Beijing, China) u skladu s uputama proizvođača. DNA fragmente razdvoji pomoću gel elektroforeze na agaroznom gelu koji sadrži 1% 0.1 ug /ml etidijeva bromida.

Hoechst bojenje

Hoechst Bojenje je provedeno prema protokolu proizvođača (C0003, Beyotime Co. ). Stanice su vizualizirani s DP70 invertni imunofluorescencija mikroskopom (Olympus). Stanice s sažet i fragmentiranih jezgara su bili suđeni da budu apoptoze. Pregled

In vitro pregled osjetljivost na lijek Test pregled

ADR, VCR, CDDP, i 5-FU svi su svježe pripremljena prije svaki eksperiment. osjetljivost na lijek je mjerena korištenjem 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolij-bromid (MTT) testa u skladu sa standardnim protokolima (tekst S1). pregled

Kvantitativna real vremenski PCR (qPCR) pregled

kvantitativni PCR u realnom vremenu provedena je upotrebom LightCycler 480 II sustava (Roche) i SYBR Green otkrivanje (Takara). Sljedove klica može se naći u tekstu S1. Pregled

kromatina imunotaloženje (chip) Test pregled

Chip testovi provedeni su u skladu s uputama proizvođača (P2078, Beyotime Co.) uz male modifikacije. Kromatina otopine su sonificirane i inkubirane s anti-ATF4 ili s kontrolnim IgG i rotira preko noći na 4 ° C. DNA-protein unakrsne veze obrnuta i kromatina DNK je pročišćena i podvrgnute PCR analizi. Primeri 5'-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3 'i 5' TTT GGA GTC CTT CCT TTC-3 'su korišteni za pojačavanje SIRT1 pregled udaljeniji promotora (A1, nukleotide -974 do - 843), i prajmeri 5'-ACC CAA CAA ACC TCT CAT-3 'i 5'-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3' su korišteni za amplifikaciju SIRT1 pregled proksimalnog promotora slijed (A2, nukleotide -781 do -647). Početnice za GAPDH
, 5'-TAC TAG CGG TTT TAC GGG CG-3 'i 5'-TCG AAC AGG AGG AGC AGA GAG CGA-3', korišteni su kao negativne kontrole. Kao pozitivna kontrola za interakcije ATF4-DNA, početnica 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3 'i 5'-CGC TTA TAC CGA GGC CCT TCC T-3', a koji su označeni za amplifikaciju asparagina sintetazu ( ASN pregled) promotorska regija koja sadrži najmanje dva mjesta prijavio se vežu ATF4 [41], su također korišteni. Nakon pojačavanja, PCR produkti su razdvojeni na 1.5% agaroznom gelu i vizualizirano bojenjem pomoću etidijeva bromida pregled

Reporter test gen pregled

1,2 kb humani SIRT1 pregled promotorska sekvencija (, - 1100-100 bp) je sintetiziran i klonira u XhoI i HindlII od pGL3-Basic vektor. Je nastala struktura potvrđena je sekvenciranjem DNA. 293T stanice su zatim ko-transfektirane sa SIRT1 pregled promotor reporter plazmid je pRL-TK plazmid (Promega, SAD), a pCMV5-ATF4 plazmida upotrebom Lipofectamine2000 (Invitrogen). Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su isprane tri puta s hladnom, fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom (PBS). Zatim, stanice su lizirane u 100 ul pufera za pasivnu razgradnju (Promega) i mućka se 15 minuta. Luciferaza krijesnice i aktivnosti Renilla luciferaze mjerena je pomoću Dual-luciferaze sustav za testiranje (Promega) sa Varioskan Flash mikro ploče čitača (Thermo Scientific). "Relativno djelovanje" je definiran kao omjer aktivnosti luciferaze krijesnice za Renilla luciferaze aktivnost i izračunat je dijeljenjem intenziteta luminiscencije dobivene s testom za luciferaze krijesnice po onom Renilla luciferaze. Sva mjerenja provedena su tri puta, i stavi se ponavlja tri puta u 293 T stanicama. Pregled

Statistička analiza pregled

Svaki pokus ponovljen je najmanje tri puta. Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± S.D. Razlika između srednjih analizirano sa Studentovim t testom. Sve statističke analize provedene su pomoću softvera SPSS16.0 (Chicago, IL). Značaj postavljena je na razini od 5%.

popratne podatke Slika S1. pregled Učinak mutiranih veznih mjesta ATF4 na aktivnost SIRT1 promotora. 293T stanice su ko-transfektirane s pCMV-ATF4 i divljeg tipa SIRT1, SIRT1-MUT1, SIRT1-Mut2 ili MUT1 + Mut2 reporter, a relativna aktivnost luciferaze je određena. Luciferaza aktivnost mock pCMV-Taq skupine označen je kao 1,00. Rezultati su srednja vrijednost ± S.D. od tri pokusa provedena u duplikatu. * P < 0.05. Na lijevoj strani je shematski prikaz konstrukata reporter gena. Grafove na desnoj strani predstavljaju relativne razine aktivnosti luciferaze u svakom od transfektiranih uzoraka pregled doi:. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF) pregled, Tekst S1. pregled Dopunsko Materijal i metode. pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002 pregled (DOC) pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo profesoru Amy S. Lee za Vas da nas pruža s pCMV5-ATF4 plazmida , Također zahvaljujemo gospodinu Taidong Qiao i gđa Zheng Chen za svoje odlične tehničke pomoći. Pregled

• PLoS ONE: suscebtibilnosti na CagA molekula koje međusobno djeluju i Gene-okoliša Interakcija s fitoestrogenima: Faktor potencijalnog rizika za želučani Cancer
• PLO ON: S100A6 Protein negativno regulira CacyBP /SIP posredovanoj inhibiciji proliferacije stanica raka želuca i tumorigenezu