Ploche ONE: Aktivácia transkripčný faktor 4 priznáva multidrug odporu fenotyp do žalúdka nádorových buniek cez transaktivaci SIRT1 Expression

abstraktné

Pozadie

multidrug rezistencie (MDR) u karcinómu žalúdka zostáva hlavnou úlohou pre klinickú liečbu. Aktivácia transkripčného faktora 4 (ATF4) je gén, stresovej reakcie zapojené do homeostázy a bunkovej ochrany. Avšak, expresia a funkcie ATF4 v karcinómu žalúdka MDR zostáva neznámy. V tejto štúdii sme skúmať, či ATF4 hrať úlohu v žalúdku MDR rakoviny a jej možných mechanizmov.

Metodika /hlavných zistení

Preukázali sme, že nadmerná expresia ATF4 confered fenotyp MDR k rakovinovým bunkám žalúdka, zatiaľ čo Vyradenie ATF4 v MDR variantoch, ktoré sú indukované opätovné senzibilizáciu. V tejto štúdii sme sa tiež ukázalo, že NAD ^{+ - závislé histondeacetylázy SIRT1 bolo nutné pre ATF4 vyvolanej MDR účinku u buniek karcinómu žalúdka. Preukázali sme, že ATF4 uľahčené MDR v rakovinových bunkách žalúdku prostredníctvom priamej väzby na promótor SIRT1, čo má za následok SIRT1 up-regulácia. Je príznačné, že inhibícia SIRT1
podľa Sirna (siRNA) alebo špecifický inhibítor (EX-527) znovu terapeutický citlivosť. Tiež zvýšená Bcl-2 /Bax pomer a úroveň expresie MDR1 boli nájdené v bunkách ATF4-expresiou.}

Závery /Význam

Ukázali sme, že ATF4 hral kľúčovú úlohu v regulácii MDR do buniek karcinómu žalúdka v reakcii na chemoterapiu a tieto zistenia naznačujú, že by mohli zmierniť cielenie ATF4 terapeutický rezistenciu u karcinómu žalúdka

Citácia :. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et al. (2012) Aktivácia transkripčný faktor 4 priznáva multidrug odporu fenotyp do žalúdka nádorových buniek cez transaktivaci SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Spojené štáty |

prijatá: 05.09.2011; Prijaté: 08.01.2012; Publikované: 17.februára 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený kombinovaným granty z Národného Natural Science Foundation Číny (NO.81090270, NO.81090273 a NO.81000864), čínsky Postdoctoral vedecká nadácia (NO.20100471776), Národné Key a základný výskum Program rozvoja Číny ( NO. 2010CB529302) a Národný Mestské Science and Technology Project (2009ZX09103-667 a 2009ZX09301-009-RC06). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

mnohopočetné liekovej rezistencie je zvyčajne hlavnou príčinou zlyhania chemoterapie proti malígnych nádorov, vrátane rakoviny žalúdka [1] .v termín mnohopočetné liekovej rezistencie sa klasicky používa na definovanie odpor fenotyp, kde bunky stávajú rezistentné súčasne do rôznych liekov s no zrejmé štrukturálne podobnosť s rôznymi bunkovými cieľmi [2]. MDR sa vyskytuje častejšie s novými liekmi, ktoré majú výraznejšie účinnosť po ich prvom použití v liečbe rakoviny. Klinická užitočnosť rôznych liečiv je obmedzená prírodné aj získanej rezistencie nádorových buniek, ktorá takmer vždy je multifaktoriálne povahy [3]. Medzi faktory, ktoré môžu ovplyvniť citlivosti voči liečivám patria: zrýchlil liekové efluxné, aktivácia a deaktivácia drog, zmeny v cieľovej drog, metylácie DNA, spracovanie poškodenie vyvolané liekmi, a obchádzanie apoptózy [4]

rakovinou žalúdka. je relatívne necitlivá na chemoterapeutiká. Mechanizmy MDR vo buniek karcinómu žalúdka bola široko skúmaná v našom laboratóriu a na inom mieste [1], [4], [5], ale neboli úplne objasnený, čo naznačuje, že ďalšie neznáme molekuly alebo cesty môžu byť zapojené do rozvoja MDR.

v cicavčích bunkách, eukaryotic translačný iniciačný faktor 2 α podjednotka (eIF2α) je fosforylovaný rôznymi eIF2α kináz v reakcii na rôzne stresové signály, vrátane anoxiu /hypoxia, endoplazmatického retikula, stres utrpenia aminokyselín, a oxidačné stres. Táto fosforylácia udalosť vedie k rýchlemu poklesu celosvetovej produkcie bielkovín súčasne s indukciou translačný expresie génov, vrátane ATF4
, ktoré fungujú tak, že zmiernenie poškodenia buniek od stresu [6], [7]. Aj keď ATF4 môžu hrať pre proapoptotický úlohu pri silnom alebo dlhodobé namáhanie, ATF4
je silný napätie reagujúce na gén, že hrá ochrannú úlohu tým, že reguluje bunkovú prispôsobenie nepriaznivých okolností, v odpovedi na stres integrovanej ( ISR) [8], [9], [10]. V poslednej dobe zvýšená expresia ATF4 bola hlásená byť prominentnú v širokej škále nádorov a k ochrane nádorovej bunky proti viacnásobnej záťaže, ako aj rad nádorových terapeutických činidiel [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Potenciálne mechanizmy zodpovedné za túto ochranu patrí autofagie indukcii, propagácia opravy poškodenia DNA a up-regulácia intracelulárneho glutatiónu [12] [13], [14], [17]. Avšak, expresia a funkcie ATF4 v karcinómu žalúdka MDR zostáva neznámy.

V tejto štúdii sme hlásené, že ATF4 bola významne up-regulovaný v odpovedi MDR z buniek karcinómu žalúdka v porovnaní s rodičovským kontrolnými bunkami. Vyradenie ATF4
podľa siRNA významne citlivé bunky s MDR na rad chemoterapeutík, zatiaľ čo up-regulácia ATF4 v SGC7901 a AGS buniek spôsobilo, že multirezistentnej. Tiež sme ukázali, že ATF4 podporoval rakoviny žalúdka MDR čiastočne cez up-reguláciu expresie SIRT1. A inhibícia SIRT1 mohol čiastočne zvrátiť rakovina žalúdka MDR fenotyp sprostredkovanej ATF4. Tieto údaje naznačujú, že zacielenie môžu ATF4 poskytnúť novú terapeutickú možnosť pre cúvanie klinického karcinómu žalúdka MDR.

Výsledky

ATF4 moduluje fenotyp MDR žalúdočných rakovinových buniek

Ak chcete zistiť, či ATF4 sa podieľa na vývoji MDR v nádorových bunkách žalúdka, hladiny ATF4 boli detekované pomocou Western blot a qPCR v SGC7901 bunkovej línii a jeho varianty MDR, SGC7901 /VCR a SGC7901 /ADR. Obe úrovne proteínové a mRNA ATF4 boli v rezistentných bunkových línií, oveľa vyššie ako v rodičovských bunkách (Obr. 1A).

Pre zistenie, či ATF4 nadmerná expresia je dostatočná na vyvolanie fenotyp MDR do buniek karcinómu žalúdka, ATF4
expresie cDNA bola trvale transfekována do SGC7901 a AGS buniek. Po prvé, citlivosť CDDP bola testovaná pomocou testu tvorby kolónií. Ako ukazuje kvantifikáciu testu kolónie tvorby, ATF4 nadmerná expresia viedla k takmer 3-násobné zvýšenie počtu kolónií v porovnaní prázdnym vektorom exprimujúcich buniek (Obr. 1B). MTT testy tiež ukázali, že IC _{50 Hodnoty SGC7901-ATF4 pre ADR, VCR, CDDP, a 5-FU významne zvýšili v porovnaní s prázdnych vektorovej transfekciou buniek (obr. 1D).}

hladiny ATF4 sú zvýšené u MDR buniek karcinómu žalúdka, sme ďalej chceli zistiť, či cielenie ATF4 mohla znovu vnímavosť MDR bunkových línií. Vyradenie ATF4
podľa siRNA v SGC7901 ADR a SGC7901 /VCR buniek /viedli k 2- až 3-násobné zníženie počtu buniek pri použití v kombinácii s CDDP (obr. 1c). Údaje na obr. 1E tiež naznačujú, že down-regulácia ATF4
podstatne obracia odolnosť buniek SGC7901 /ADR v odpovedi na chemoterapiu.

inhibícia apoptózy je jedným z dôležitých mechanizmov MDR, sme skúmali kapacita z SGC7901 buniek /ADR transfektovaných s konkrétnym ATF4
siRNA podstúpiť CDDP-indukovanú apoptózu Hoechst farbenie a fragmentáciu DNA testy. Liečba SGC7901-ATF4 a SGC7901 /ADR-SCR buniek s uvedenými koncentráciami CDDP po dobu 36 hodín nespôsobuje žiadne apoptózu, ako je hodnotená farbením jadrovej Hoechst (obr. 1F) a fragmentácia DNA testoch (obr. 1G). Na rozdiel od toho SGC7901-Vector a SGC7901 /ADR-siATF4 bunky zobrazená významnú apoptózu, s častejším výskytom skrátených a roztrieštených jadier a tvorbe DNA rebríka. Okrem toho, viac zrejmé štiepenie procaspase-3 bola pozorovaná po liečbe CDDP v SGC7901-vektorov a SGC7901 ADR-siATF4 buniek /v porovnaní s SGC7901-ATF4 a SGC7901 /ADR-SCR buniek, v danom poradí (obr. 1 H).

dohromady tieto výsledky naznačujú, že ATF4 priznáva MDR fenotyp do buniek karcinómu žalúdka, a že cielenie ATF4 poskytuje spôsob zvyšujúce citlivosť buniek rezistentných k chemickým ošetrením.

ATF4 up-reguluje expresiu SIRT1, MDR1 , Bcl-2 a Bax v rakovinových bunkách žalúdku

Predchádzajúce štúdie preukázali, že bunky so zvýšenou expresiou SIRT1 zobrazená znížená citlivosť na chemoterapiu viacerými mechanizmami [18], [19], [20], [21]. Boli sme zvedaví, či SIRT1
, čo je gén súvisiace so stresom kritické pre vývoj MDR, môže byť downstream cieľ ATF4 zodpovedný za sprostredkovanie ATF4 vyvolané MDR do buniek karcinómu žalúdka.

úrovňou SIRT1 v LV-Vector a LV-ATF4 stabilne prenesené SGC7901 boli bunky testované pomocou qPCR a Western blot. Zvýšená expresia ATF4 bola spojená so zvýšenou expresiou SIRT1 tak na úrovni transkripcie (viď obr. 2A, vľavo) a na úrovni translácie (obr. 2B, vľavo). Na rozdiel od toho siRNA Vyradenie ATF4
v bunkách SGC7901 /ADR za následok významné zníženie endogénnej SIRT1
expresiu (Obr. 2A a 2B, vpravo). Tieto výsledky naznačujú, že ATF4 up-reguluje SIRT1
expresiu v rakovinových bunkách žalúdka.

Ak chcete ďalej skúmať molekulárne mechanizmy zapojené do ATF4 súvisiacich s MDR rakoviny žalúdka, sme tiež skúmal MDR1, MRP, Bcl-2 a Bax hladiny expresie v nádorových bunkách žalúdka sa používa vyššie. Ako je znázornené na Obr. 2B, ATF4-zbehlý bunky exprimovali viac MDR1 v porovnaní s kontrolnými bunkami. Medzitým, žiadny zrejmý rozdiel v expresii MRP bol nájdený v žiadnej z týchto bunkových línií. Je zaujímavé, že obaja Bcl-2 a Bax hladiny expresie boli up-regulované v ATF4-zbehlý buniek, v porovnaní s kontrolnou bunkové línie, zatiaľ čo expresia Bax ukázalo len nepatrné zmeny, čo znamená, že up-regulácia Bcl-2 Bax pomer môže potlačiť apoptózu drogami indukovanej v rakovinových bunkách ATF4-expresiou žalúdka.

Tieto výsledky ukazujú, že podporuje ATF4 MDR schopnosť buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom rôznych mechanizmov.

ATF4 transactivates SIRT1 aktivitu promótorom a priamo viaže na promótor SIRT1

na určenie, či ATF4 sprostredkováva SIRT1
transkripcie génov, 293T bunky boli kotransfekovány s 1,2 kb SIRT1
promótor reportérovým plazmidom a ATF4
expresný plazmid. Luciferázovým reporterovým testom ukázalo, že SIRT1
aktivita promotora bola výrazne aktivovaná ATF4 v spôsobom závislým od dávky (Obr. 3A).

V snahe získať konkrétne pohľad na mechanizmy SIRT1
indukcie, sme skúmali možné vyvolanie cesty z ATF4. Tým, že analyzuje 5'-priľahlé sekvencie SIRT1
gén s bioinformatiky softvér (Tfsitescan služba, TESS, a Genomatix), boli identifikované dve väzobné miesta ATF4 domnelé rámci regiónu bp -950 až -600 z SIRT1
promótor (obr. 3B).

Ak chcete zistiť, či SIRT1
je priamym cieľom ATF4, Chip s ATF4 protilátkou s použitím SGC7901-ATF4 bunky vykazovali obohacovania oboch väzbové miesta v rámci SIRT1
promotorové oblasti, čo naznačuje, že RNA a následné úrovne proteín zvýšenie o SIRT1
v ATF4 exprimujúcich bunkových línií je pravdepodobné, že v dôsledku priamej interakcie ATF4 s SIRT1
promótor génu (obr. 3C).

Ak chcete skúmať úlohu dvoch väzby ATF4 miest v regulácii SIRT1 transaktivaci, lokálne cielená mutagenéza bola použitá k mutácii tieto stránky. Luciferázového reportérového test ukázal, že buď mutácií väzobné miesto 1 alebo väzobné miesto 2 znížila SIRT1 promotorovou aktivitu indukovanú ATF4. Ďalej, mutácia oboch väzobných miest zrušila SIRT1 promotorovou aktivitu. Tieto výsledky naznačujú, že väzobné miesta pre oba ATF4 sa podieľajú na transaktivace SIRT1 promótorom (obr. S1).

Dokopy tieto výsledky ukazujú, že SIRT1 je priamy transkripčný cieľ ATF4.

SIRT1
inhibícia siRNA čiastočne obracia fenotyp MDR nádorových buniek ATF4-expresiou žalúdočných

identifikácia ATF4 sprostredkované SIRT1
zvyšuje úroveň expresie v nádorových bunkách žalúdka, budete vyzvaní aby sme analyzovať úlohu tejto dráhy v žalúdku rakoviny MDR. Na túto adresu, sme porovnali vitro
citlivosť drogou v ATF4 stabilne transfekované nádorové bunky žalúdočnej po transfekciu SIRT1
siRNA alebo siRNA miešaná tvorbou kolónií a MTT testy. Vyradenie SIRT1
podľa siRNA v SGC7901-ATF4 buniek viedli k > 40% zníženie počtu kolónií pri použití v kombinácii s CDDP (obr. 4a, horné). Tento účinok sa pozoroval aj u AGS-ATF4 buniek (obr. 4A, nižšie). Navyše dáta z testu MTT tiež ukázali, že vyraďujúce SIRT1
mohla znovu citlivosť SGC7901-ATF4 bunky k chemickým liekov, ale nedošlo v miešaných siRNA transfekciou buniek (obr. 4B).

na určenie, či SIRT1 chráni bunky pred apoptózou indukovanú CDDP, SGC7901-ATF4 buniek transfekciou SIRT1
siRNA alebo siRNA miešaná bolo liečených CDDP a označené annexinem v a PI. Že apoptotické bunky boli identifikované značením annexinu V. Apoptotické percento SIRT1 siRNA transfekovány SGC7901-ATF4 buniek bola významne vyššia ako u kontrolných buniek (Obr. 5A, 72,8% verzus 25,9%). Vzhľad skrátených a roztrieštených jadier bola tiež zvýšená v SIRT1 siRNA transfekciou bunkách v porovnaní s kontrolnými bunkami (obr. 5B). Okrem toho, štiepenie procaspase-3 bol pozorovaný už 12 hodín po liečbe s 10 ug /ml CDDP v SIRT1 siRNA transfekovány SGC7901-ATF4 bunky, ale nie v miešaných ošetrených siRNA buniek, a to aj po 24 hodinách liečby CDDP (obr. 5C ). Tieto výsledky naznačujú, že zvýšená expresia SIRT1 potláča CDDP-indukovanú apoptózu.

K štúdiu účinku down-reguláciu SIRT1 o siRNA o MDR spojené molekúl, sme sa zaoberali MDR1, MRP, Bcl-2 a Bax hladiny expresie v SGC7901-ATF4 bunky po transfekciu s siRNA SIRT1 alebo miešaná siRNA. Down-regulácia MDR1 bola pozorovaná v SIRT1 siRNA ošetrených buniek (Obr. 5D) v porovnaní s kontrolnými bunkami. Naproti tomu sa zistilo, že žiadny zrejmý rozdiel MRP, Bcl-2, a hladín expresie Bax medzi vzorkami.

Tieto pozorovania ukazujú, že SIRT1 sprostredkúva ATF4 vyvolanej MDR účinok buniek karcinómu žalúdka.

Inhibícia SIRT1 aktivity re-sensitizes ATF4 transfekciou buniek do činidiel poškodzujúcich DNA

Ak chcete doložiť, že SIRT1 katalytická aktivita je tiež zodpovedný za ATF4 indukovanej MDR, SGC7901-ATF4 bunky boli predbežne EX-527 , nový, účinný a špecifický inhibítor s malou molekulou z SIRT1, a po následnej reakcii s rôznymi chemickými liekmi. Po prvé, sme stanovili bazálnej cytotoxicitu EX-527 v LV-Vector a LV-ATF4 stabilne prenesené SGC7901 buniek. Test MTT bolo zistené, že EX-527 pri koncentráciách až do 10 uM neinhiboval, ale sa mierne zvýšila, životaschopnosť obidvoch bunkových líniách (obr. 6a). Ďalej sme sa zaoberali SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2 a úrovne expresie Bax po inkubácii 24 hodín s alebo bez vyznačených dávkach EX-527 v rakovinových bunkách žalúdku ako vyššie. Iba expresie MDR1 boli down-regulované EX-527 v závislosti od koncentrácie spôsobom (obr. 6B). Potom sa vopred inkubuje SGC7901-ATF4 buniek vozidla alebo EX-527 (0,5, 1, 2, 4, a 10 uM) po dobu 24 hodín, a potom CDDP- a 5-FU-sprostredkovanú smrť buniek bola monitorovaná. Ako je znázornené na Obr. 6C, EX-527 značne zvýšenú cytotoxicitu oboch liečiv v spôsobom závislým od dávky. Zistili sme tiež možný synergický efekt ex-527 na rôznych dávok CDDP- a 5-FU-sprostredkovanú inhibíciu proliferácie buniek v SGC7901-ATF4 buniek. Ako sa dalo očakávať, 10 uM EX-527 je dostatočná na zosilnenie cytotoxicity oboch liečiv (Obr. 6D).

Tieto výsledky ukazujú, že aktivita SIRT1 tiež hrá dôležitú úlohu v ATF4 vyvolaného karcinómu žalúdka MDR, a to role by mohla byť sprostredkovaná čiastočne cez MDR1 prejavu.

Diskusia

MDR predstavuje významné klinické výzvy pre efektívne chemoterapiu mnohých ľudských malignít. Mechanizmy, ktorými bunky získavajú rezistenciu je veľa a sú zložité, takže širšie pochopenie z nich, ako aj identifikácia nových mechanizmov pre chemorezistence, budú obzvlášť užitočné pri poskytovaní lepšie liečebné možnosti. Táto štúdia je prvá správa, že vysoké hladiny ATF4, bežne vidieť v nádorových bunkách za stresových podmienok, udeľuje buniek karcinómu žalúdka s fenotypom MDR, a zistí, že tento účinok je sprostredkovaný čiastočne transaktivace SIRT1 expresie.

ATF4 stroje a SIRT1
sú evolučne konzervované stresovej reakcie gény zapojené do širokého spektra biologických procesov, z ktorých mnohé sú prospešné pre bunkové homeostázy a ochranu [22], [23], [ ,,,0],24]. Oba tieto gény sú vyvolané v odozve na rôzne napätia, vrátane nedostatku kyslíka (hypoxia /anoxiu), oxidačný stres, poškodenie DNA, nutričné ​​depriváciu a chemotoxic stresu. Levenson VV et al.
Najprv uviedol, že zmeny v expresii ATF4 by mohol hrať úlohu v pleiotropické rezistencie na rôznych tried liekov DNA cielenie [16]. V uplynulých rokoch, niekoľko štúdií zistil, že ATF4 bol zapojený priamo alebo nepriamo podieľajú na rozvoji liekovej rezistencie cez autofagie, glutatión závislé Redox systém a oprava poškodenia DNA [11], [12], [13], [14] [15], [16], [17], [25], [26]. Tu ukazujeme, že ochranná schopnosť ATF4 skutočne sprostredkováva fenotyp MDR v ATF4-nadexprimující žalúdočné nádorových bunkových línií v odpovedi na chemoterapiu. Naše výsledky jasne ukazujú, že nadmerná expresia ATF4 do buniek karcinómu žalúdka bola spojená s väčším odporom, zatiaľ čo Vyradenie ATF4 indukovanej opätovné senzibilizáciu. Tieto údaje naznačujú, že ATF4 je pravdepodobne dôležitý mediátor po prúde rezistencia spôsobená viac mechanizmy, a preto je cenným terapeutickým cieľom. Zatiaľ, ako jedna z najdôležitejších transkripčný mediátorov ISR, ktorý aktivuje rad cieľových génov, ktoré podporujú obnovu homeostázy, ATF4 môže sprostredkovať odpor inými mechanizmami. V našej štúdii sa zistilo, že SIRT1 byť up-regulovaná v bunkách ATF4-expresiou v porovnaní s vektorovými transfekciou buniek. Na rozdiel od toho Vyradenie ATF4
s ATF4 špecifickú siRNA viedla k down-regulácii SIRT1 v MDR buniek karcinómu žalúdka. Naše výsledky naznačujú, že SIRT1 by mohol byť následný mediátor ATF4 indukované rakoviny žalúdka MDR.

Ako člen ATF podčeľade základného areál leucín zips (BZIP) transkripčné faktory [22], ATF4 má potenciál pôsobiť buď ako transkripčný aktivátor alebo transkripčný represor cez ATF alebo cAMP responzívne element (CRE) väzobných miest [22]. Väzobné miesto pre konsenzus ATF bola definovaná ako TGACGT (C /A) (G /A) [27], čo je sekvencia identická s CRE konsenzuálne prvku (TGACGTCA) [28]. Tiež je vysoko konzervatívny motív jadro - ACGT - vo väčšine Cres [29] sa môže viazať na rôzne BZIP faktorov, v závislosti na sprievodných základov jadra motívu [22], [30], [31]. V našej štúdii boli nájdené dva zdanlivá väzbové miesta ATF-CRE v 1,2 kb SIRT1
promotorovou oblasť, a ATF4 priamo ovládané SIRT1
transkripcie väzbou k obom záväzných prvkov. Avšak, ako tieto dve väzobné miesta hrajú svoju úlohu podľa podrobných stresových podmienok zostáva neznámy a vyžaduje ďalšie skúmanie.

cicavcov SIRT1
je najbližšia homolog kvasiniek Sir2
a najviac značne študoval SIRT člena rodiny. Sa silne podieľa na regulácii bunkových procesov, ktoré určujú životnosť, vrátane anti-apoptózu, neuronálne ochranu, a bunkové starnutie alebo starnutie [32]. V poslednej dobe rastie počet štúdií zapletený zvýšená expresia SIRT1 s rezistenciou na chemoterapiu a ionizujúceho žiarenia [18] [19] [20] [33], [34], [35], [36]. Napríklad SIRT1 nadmerná expresia bola nájdená v rezistentné neuroblastóm, osteosarkóm, prsných žliaz, vaječníkov, prostaty, hrubého čreva, a bunkových línií rakoviny pľúc v porovnaní s ich kolegami drog citlivé. Všetky tieto odolné účinky liekov z SIRT1 by mohlo byť vzhľadom k jeho anti-apoptotický účinok [37], [38] a umlčanie nádorových supresorových génov [39]. Nakoniec, môžeme predpokladať, že, ak je SIRT1 sa podieľa na ATF4 vyvolané MDR, inhibícia SIRT1 by mala mať vplyv na citlivosť buniek ATF4-expresiou v odpovedi na chemoterapiu. Ako sa dalo očakávať, a to ako siRNA a farmakologická inhibícia SIRT1 mohla znovu citlivosť ATF4-expresiou buniek k chemickým liekov. Okrem toho, naša štúdia ukazuje, že SIRT1 chráni bunky pred smrťou čiastočne prostredníctvom anti proapoptotický efekt.

Bolo zistené, že MDR1 bola up-regulovaný v bunkách so zvýšenou expresiou SIRT1 [18], [36]. V tejto štúdii sme preukázali, že MDR1 je up-regulovaný v bunkách ATF4-nadmernou expresiou a Vyradenie SIRT1 s SIRT1 špecifickú siRNA alebo inhibovať jeho aktivitu s EX-527 by mohla viesť k down-regulácii MDR1, čo je v súlade s liečivom -resistant role by SIRT1. Avšak, Bcl-2 /Bax pomer, ktorý bol up-regulovaný v bunkách ATF4-nadmernou expresiou, bol SIRT1 nezávislé, čo naznačuje, že SIRT1 nezávislé mechanizmy tiež zohrávajú úlohu v ATF4 vyvolané MDR do buniek karcinómu žalúdka.

V súhrne sme ukazujú, že ATF4 priznáva MDR fenotyp do buniek karcinómu žalúdka, a tento účinok je čiastočne sprostredkovaná transaktivace SIRT1 nadmernej expresie. Okrem toho, ATF4 je platný cieľ v žalúdočných nádorov rezistentných a rozvojových účinnými inhibítory ATF4 by mali byť brané do úvahy v budúcnosti. Tieto nálezy poskytujú nové vhľad do úlohy ATF4 pri kontrole SIRT1 výraz a do jeho funkcií stres rezistencie in vzniku nádorov a chemoterapie. To je obzvlášť dôležité pre klinické úvahy, ako je ATF4 môže byť up-regulovaná podľa nedostatku kyslíka, oxidačný stres, nutričné ​​depriváciu a takmer všetkých nežiaducich stresorov v mikroprostredie nádoru, ktoré by mohli byť unesených rakovinovými bunkami vyhnúť inhibíciu proliferácie a bunkovú smrť odozva na chemoterapiu. Preto zásahy založený na narušenie vyvolané stresom ATF4 expresiu v rakovinových bunkách môže byť účinná pri obchádzaní alebo cúvaní rezistenciu voči liekom na rakovinu žalúdka.

materiáloch a metódach

V prípade podrobných metód nájdete Text S1 .

bunkových kultúrach a činidlá

ľudskej adenokarcinóme žalúdka bunkové línie SGC7901 (získané z Akadémie Vojenskej lekárskej vedy, Peking, Čína) a MDR varianty, SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR (vytvoriť a udržiavať v našom laboratóriu), a AGS (získané z bunkovej banky čínskej akadémie vied, Shanghai, Čína) boli kultivované v RPMI-1640 doplnenom sérom 10% hovädzieho zárodočného (Hyclone) a penicilínom /streptomycínom. 293T bunky (aj získané z bunkovej banky čínskej akadémie vied) boli kultivované v médiu DMEM doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom. Zachovať MDR fenotyp, adriamycín (s konečnou koncentráciou 0,5 ug /ml) a vinkristín (s konečnou koncentráciou 1 ug /ml) boli pridané do kultivačného média pre SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR buniek, v danom poradí. EX-527 (Sigma) sa rozpustí v DMSO v uvedených koncentráciách. Adriamycín (ADR), vinkristín (VCR), cisplatina (CDDP), a 5-fluorouracil (5-FU), sa rozpustí vo fyziologickom roztoku v uvedených koncentráciách.

Bunková transfekcia a stabilné bunkové línie

ľudská ATF4
expresný plazmid (pCMV5-ATF4) bol láskavo poskytol profesor Amy S. Lee [25]. Lentivirový vektor kódujúci siRNA špecifické pre ATF4 stroje a kontrolné siRNA boli vytvorené s použitím PLKO.1-TRC (Addgene) a boli označené ako LV-siATF4 a ovládanie LV-SCR, v danom poradí. Lentivirový vektor kódujúci ľudský gén ATF4 boli vyrobené v FUW-Teta (Addgene), označované ako LV-ATF4. Prázdny vektor bol použitý ako negatívna kontrola, označované ako LV-Vektor. Stabilné bunkové línie boli vytvorené transfekcia uvedených lentivirových konštruktov s následnou selekciou na puromycin alebo Zeocin (Invitrogen), v danom poradí. Prenos buniek a generovanie stabilných bunkových línií boli vykonané za použitia štandardných postupov. Sekvencie siRNA konštruktov možno nájsť v texte S1.

imuno-blottingom

Zber proteínových extraktov a imuno-blottingom analýzy boli vykonané za použitia štandardných postupov. Pre protilátok zdrojov, pozri text S1.

Colony test formácie

Test Tvorba kolónií bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [40], s miernymi úpravami (Text S1).

annexin V sfarbenie a FACS analýza

annexin V sfarbenie a FACS analýzy boli vykonané za použitia štandardných postupov. Bunky negatívny pre PI a annexin V sfarbenie bola klasifikovaná ako živé bunky, bunky, ktoré farbených pozitívne na annexin V len boli klasifikované ako skorých apoptotických buniek, a PI pozitívne a annexin V pozitívnej bunky boli bunky prechádzajú neskoré štádia apoptózy.

fragmentácia DNA test

fragmenty DNA boli extrahuje DNA Ladder Extraction Kit s Spin Column (C0008, Beyotime Co., Peking, Čína) podľa protokolu výrobcu. DNA fragmenty boli oddelené pomocou gélovej elektroforézy na 1% agarózovom géli obsahujúcom 0,1 ug /ml etídiumbromidu.

Hoechst farbenie

Hoechst farbenie bola vykonaná podľa protokolu výrobcu (C0003, Beyotime Co. ). Bunky boli vizualizované pomocou DP70 invertný imunofluorescencie mikroskopu (Olympus). Bunky s kondenzovaným a ucelenejším jadier boli posúdené ako apoptotické.

In vitro
citlivosť droga test

ADR, VCR, CDDP a 5-FU boli všetky čerstvo pripravené pred každý experiment. citlivosti voči liečivám sa merala pomocou testu s 3- (4,5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium bromidu (MTT) podľa štandardného protokolu (Text S1).

kvantitatívne real -time PCR (qPCR)

Kvantitatívne PCR v reálnom čase bola vykonaná za použitia systému LightCycler 480 II (Roche) a SYBR Green detekcie (Takara). Sekvencie primérov sú uvedené v texte S1.

chromatín Imunoprecipitácia (Chip) test

čip testy boli vykonávané podľa protokolu výrobcu (P2078, Beyotime Co.) s miernymi modifikáciami. Chromatín roztoky sa podrobia pôsobeniu ultrazvuku a inkubované s anti-ATF4 alebo s kontrolným IgG, a otáča sa cez noc pri teplote 4 ° C. DNA-proteín priečne väzby boli obrátené a chromatín DNA bola čistená a podrobená PCR analýzou. Primery 5'-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3 'a 5'-TTT GGA GTC CTT CCT TTC-3' boli použité na zosilnenie SIRT1
distálny promotorovou sekvenciu (A1, nukleotidy -974 až - 843), a primery 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'a 5'-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3' boli použité pre amplifikáciu SIRT1
proximálny promotorové sekvencie (A2, nukleotidy -781 do -647). Primery pre GAPDH
, 5'-TAC TAG CGG TTT TAC GGG CG-3 'a 5'-TCG AGG AAC AGC AGG AGA GAG CGA-3', boli použité ako negatívna kontrola. Ako pozitívna kontrola pre interakciu ATF4-DNA, priméry 5'-TTG TGG GTC CTC GCA GGC AT-3 'a 5'-CGC TTA TAC CCT CGA GGC TCC T-3', ktoré boli navrhnuté tak, aby amplifikáciu asparagín syntetázy ( ASN
) promotorovou oblasť, ktorá obsahuje aspoň dve miesta oznámené viazať ATF4 [41], boli taktiež použité. Po amplifikácii PCR produkty boli rozdelené na 1,5% agarosovém gélu a vizualizované farbením etidiumbromidom

Reporter gén test

1,2 kb ľudskej SIRT1
promotorovou sekvenciu (. - 1100-100 bp) bol syntetizovaný a klonovanie do miest Xhol a HindlII v pGL3-Basic vektora. Výsledný konštrukt bol potvrdený sekvenovaním DNA. 293T bunky potom boli kotransfekovány s SIRT1
promótor reportérovým plazmidom, prl-TK plazmid (Promega, USA), a pCMV5-ATF4 plazmid pomocou Lipofectamine2000 (Invitrogen). Štyridsať osem hodín po transfekciu boli bunky trikrát premyté chladným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfáty (PBS). Potom boli bunky lyžovanie v 100 ul lyzačného pufra pasívne (Promega) a trepe sa po dobu 15 minút. Luciferázy svetlušiek a luciferázové aktivity Renilla boli merané pomocou Dual-Luciferase Reporter testovacieho systému (Promega) s Varioskan Flash mikrodoštičiek (Thermo Scientific). "Relatívna aktivita" bola definovaná ako pomer luciferázy svetlušiek činnosti, aby Renilla luciferázové aktivity a bola vypočítaná delením intenzity luminiscencie, získané stanovením pre luciferázy zo svetlušky, že z Renilla luciferázy. Všetky merania boli vykonávané v triplikátech a testy sa opakovali trikrát v 293 T bunkách.

Štatistická analýza

Každý pokus bol opakovaný aspoň trikrát. Všetky údaje boli uvedené ako stredná ± S.D. Rozdiel medzi prostriedkami, bola analyzovaná s Studentov testu. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softvéru SPSS16.0 (Chicago, IL). Významnosť bola stanovená na úrovni 5%.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Vplyv mutovaných väzobných miest ATF4 na aktivitu promótorom SIRT1. 293T bunky boli kotransfekovány pCMV-ATF4 a divokého typu, SIRT1 SIRT1-MUT1, SIRT1-MUT2 alebo MUT1 + MUT2 reportér, a relatívna aktivita luciferázy bola stanovená. Aktivita luciferázy z makety skupiny pCMV-Taq bol označený ako 1,00. Výsledky predstavujú priemer ± S.D. z troch pokusov vykoná dvojmo. * P < 0,05. Na ľavej strane je schematické znázornenie reportér génovým konštruktom. Grafy pruh na pravej strane predstavujú relatívnej úrovne luciferázové aktivity v každej z transfekciou vzoriek
doi :. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
Text S1.
Doplňujúce Materiál a metódy.
doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC)

Poďakovanie

Ďakujeme profesora Amy S. Lee za láskavé nám poskytuje v pCMV5-ATF4 plazmidu , Ďakujeme tiež pánovi Taidong Qiao a pani Zheng Chen za ich vynikajúce technickej pomoci.

• Ploche ONE: genetická náchylnosť na ČAGA-interagujúcich molekúl a medzi génmi a prostredím Interakcia s fytoestrogény: domnelý rizikový faktor pre vznik rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: S100A6 Proteín Negatívne Reguluje CacyBP /SIP-sprostredkovanú inhibíciu žalúdočné rakoviny množenia sa a Tumorigenesis