PLOS ONE: Activar Fator de Transcrição 4 confere uma multirresistência Fenótipo a células de câncer gástrico através transactivação de SIRT1 Expression

Abstract

Fundo

A multirresistência (MDR) no câncer gástrico continua a ser um grande desafio para tratamento clínico. Ativando fator de transcrição 4 (ATF4) é um gene resposta ao estresse envolvido na homeostase e proteção celular. No entanto, a expressão ea função dos ATF4 no câncer gástrico MDR permanece desconhecida. Neste estudo, investigamos se ATF4 desempenhar um papel na MDR câncer gástrico e os seus potenciais mecanismos.

Metodologia /Principais Achados

Nós demonstramos que ATF4 superexpressão conferiu o fenótipo MDR às células cancerosas gástricas, enquanto knockdown de ATF4 no MDR variantes induzida re-sensibilização. No presente estudo, também mostraram que o NAD ^{+ - SIRT1 histona desacetilase dependente foi necessária para o efeito induzido MDR-ATF4 em células de cancro gástrico. Nós demonstramos que ATF4 facilitado MDR em células cancerosas gástricas através de ligação directa ao promotor SIRT1, resultando em SIRT1-regulação. Significativamente, a inibição da SIRT1
pela pequena interferência RNA (siRNA) ou um inibidor específico (EX-527) reintroduzido sensibilidade terapêutica. Além disso, um aumento da Bcl-2 /relação de Bax e nível de expressão MDR1 foram encontrados em células-superexpressão ATF4.}

Conclusões /Significado

Nós mostramos que ATF4 teve um papel fundamental na regulação da MDR em células de câncer gástrico em resposta à quimioterapia e esses resultados sugerem que a segmentação ATF4 poderia aliviar a resistência terapêutica no cancro gástrico

Citation:. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et ai. (2012) Activar Fator de Transcrição 4 confere uma multirresistência Fenótipo a células de câncer gástrico através transactivação de SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10.1371 /journal.pone.0031431

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de setembro de 2011; Aceito: 08 de janeiro de 2012; Publicação: 17 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações combinadas da National Science Foundation Natural da China (NO.81090270, NO.81090273 e NO.81000864), o chinês de Pós-Doutorado Science Foundation (NO.20100471776), o Key Nacional e Programa de Desenvolvimento de Pesquisa básica da China ( nO. 2010CB529302), eo Projeto de Ciência e Tecnologia Nacional Municipal (2009ZX09103-667 e 2009ZX09301-009-RC06). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a multirresistência é geralmente a principal causa para o fracasso da quimioterapia contra tumores malignos, incluindo câncer gástrico [1] .O prazo multirresistência é classicamente utilizado para definir um fenótipo de resistência onde as células se tornam resistentes simultaneamente para diferentes medicamentos sem semelhança estrutural óbvia e com diferentes alvos celulares [2]. MDR ocorre mais frequentemente com novos medicamentos que têm eficácia mais significativa após a sua primeira aplicação no tratamento do câncer. A utilidade clínica de múltiplas drogas é limitada pela resistência de células tumorais tanto natural e adquirido, que quase sempre é multifactorial na natureza [3]. Os fatores que podem afetar a sensibilidade de drogas incluem: aceleração de efluxo de drogas, a ativação de drogas e inactivação, alterações no alvo da droga, a metilação do DNA, o processamento de dano induzido por drogas, e evasão de apoptose [4]

O câncer gástrico. é relativamente insensível a agentes quimioterapêuticos. Os mecanismos de MDR em células de cancro gástrico têm sido amplamente investigados em nosso laboratório e outros lugares [1], [4], [5], ainda não tenham sido completamente elucidados, indicando que outras moléculas ou vias desconhecidos podem estar envolvidos no desenvolvimento de MDR.

em células de mamíferos, o factor de iniciação da tradução eucariótica 2 α subunidade (eIF2α) é fosforilado por cinases diferentes eIF2α em resposta a sinais de tensão diferentes, incluindo anóxia /hipóxia, estresse retículo endoplasmático, a privação de aminoácidos, e oxidativa estresse. Este evento de fosforilação conduz a uma rápida diminuição concomitante mundial biossíntese de proteínas com a indução da expressão de translação de genes, incluindo o ATF4
que funcionam para aliviar danos celulares do stress [6], [7]. Embora ATF4 pode desempenhar um papel pró-apoptótica sob condições de estresse grave ou prolongada, ATF4
é um gene de stress-responsivo potente pensado para desempenhar um papel protetor, regulando adaptação celular às circunstâncias adversas na resposta ao estresse integrado ( ISR) [8], [9], [10]. Recentemente, a sobre-expressão de ATF4 foi relatado para ser proeminente em uma ampla variedade de tumores e para proteger as células de tumor contra várias tensões, bem como uma variedade de agentes terapêuticos do cancro [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Os potenciais mecanismos responsáveis ​​por essa proteção incluem a indução de autofagia, a promoção de reparação de danos ao DNA, e up-regulação da glutationa intracelular [12], [13], [14], [17]. No entanto, a expressão ea função dos ATF4 no câncer gástrico MDR permanece desconhecida.

Neste estudo, nós relatamos que ATF4 foi significativamente up-regulada na resposta MDR de células de câncer gástrico em comparação com células de controlo parental. Knockdown de ATF4
por siRNA células com MDR sensibilizados de forma significativa para uma variedade de agentes quimioterapêuticos, enquanto up-regulação da ATF4 em SGC7901 e células AGS tornou-os resistentes a múltiplas drogas. Nós também mostrou que ATF4 promovido câncer gástrico MDR em parte através de up-regulação da expressão de SIRT1. E inibição SIRT1 pode, em parte reverter o câncer de MDR fenótipo gástrico mediada pela ATF4. Estes dados sugerem que a segmentação ATF4 pode proporcionar uma nova opção terapêutica para reverter câncer gástrico clínica MDR.

Resultados

ATF4 modula o fenótipo MDR de células cancerosas gástricas

Para determinar se ATF4 está envolvido no desenvolvimento da MDR em células de cancro gástrico, os níveis de ATF4 foram detectadas por Western blot e qPCR na linha de células e a sua SGC7901 variantes MDR, SGC7901 /VCR e SGC7901 /ADR. Ambos os níveis de proteína e ARNm de ATF4 eram muito mais elevados nas linhas de células resistentes do que nas células parentais (Fig. 1A).

Para investigar se a sobre-expressão ATF4 é suficiente para induzir um fenótipo MDR em células de cancro gástrico, ATF4
ADNc expressão foi estavelmente transfectado para células SGC7901 e AGS. Primeiro, a sensibilidade de CDDP foi testado utilizando um ensaio de formação de colónias. Como mostrado pela quantificação do ensaio de formação de colónia, ATF4 superexpressão resultou num aumento de quase 3 vezes no número de colónias em comparação com células que expressam o vector vazio (Fig. 1B). ensaios MTT também indicou que o IC _{50 valores de SGC7901-ATF4 para ADR, VCR, CDDP, e 5-FU foram significativamente aumentados em comparação com células vetor transfectadas vazios (Fig. 1D).}

Como níveis ATF4 são elevados em células de câncer gástrico MDR, queríamos ainda mais para determinar se a segmentação ATF4 poderia re-sensibilizar as linhas de células MDR. Knockdown de ATF4
por siRNA no ADR ea SGC7901 /VCR células SGC7901 /levaram a uma de 2 a 3 vezes a redução no número de células quando usado em combinação com CDDP (Fig. 1C). Os dados na fig. 1E também sugerem que a sub-regulação de ATF4
inverte significativamente a resistência das células SGC7901 /ADR em resposta à quimioterapia.

como a inibição da apoptose é um dos importantes mecanismos de MDR, também investigamos a capacidade de as células SGC7901 /ADR transfectadas com o específico ATF4
siRNA para sofrer apoptose induzida por CDDP através de ensaios de coloração e fragmentação de ADN Hoechst. Tratamento de SGC7901-ATF4 células e /ADR-SCR SGC7901 com as concentrações indicadas de CDDP, durante 36 horas não induziu qualquer apoptose, tal como avaliado por coloração nuclear Hoechst (Fig. 1F) e ensaios de fragmentação de ADN (Fig. 1G). Em contraste, SGC7901 por vetores e SGC7901 /ADR-siATF4 células exibido apoptose significativa, com o aparecimento mais frequente de núcleos condensados ​​e fragmentados e formação de escada de DNA. Além disso, observou-se a clivagem mais óbvia de procaspase-3 após o tratamento com CDDP em SGC7901 vector e células SGC7901 /ADR-siATF4 em comparação com células SGC7901-ATF4 e SGC7901 /ADR-SCR, respectivamente (Fig. 1H).

Tomados em conjunto, estes resultados indicam que ATF4 confere um fenótipo MDR às células cancerosas gástricas e ATF4 que a segmentação proporciona um método de sensibilização de células resistentes a tratamentos químicos.

ATF4-regula a expressão de SIRT1, MDR1 , Bcl-2, Bax e em células de cancro gástrico

estudos anteriores relataram que as células que sobre-expressam SIRT1 exibida sensibilidade diminuída à quimioterapia por múltiplos mecanismos de [18], [19], [20], [21]. Nós estávamos curiosos para determinar se SIRT1
, que é um gene relacionado ao estresse fundamental para o desenvolvimento MDR, poderia ser o alvo a jusante de ATF4 responsável por mediar MDR-induzida ATF4 em células cancerosas gástricas.

os níveis de SIRT1 em LV-Vector e LV-ATF4 células SGC7901 estavelmente transfectadas foram analisadas por qPCR e Western blot. A sobre-expressão de ATF4 foi associada com aumento da expressão SIRT1, tanto a transcrição (Fig. 2A, esquerdo) e os níveis de translação (Fig. 2B, esquerda). Em contraste, siRNA knockdown de ATF4
em células SGC7901 /ADR resultou numa redução significativa de endógena SIRT1
expressão (Fig. 2A e 2B, direita). Estes resultados sugerem que ATF4 up-regula expressão SIRT1
em células cancerosas gástricas.

Para investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na MDR relacionados com ATF4 de câncer gástrico, que também examinou MDR1, MRP, Bcl-2, Bax e os níveis de expressão em células de cancro gástrico utilizado acima. Como mostrado na Fig. 2B, as células ATF4-proficiente expressa mais MDR1, em comparação com as células de controlo. Entretanto, nenhuma diferença óbvia na expressão de MRP foi encontrada em qualquer uma destas linhas celulares. Curiosamente, ambos os níveis de expressão de Bcl-2 e Bax foram regulados positivamente em células ATF4-proficiente, em comparação com as linhas celulares de controlo, enquanto que a expressão do Bax mostrou apenas ligeiras alterações, o que indica que um aumento da regulação da proteína Bcl-2 a Bax rácio pode suprimir a apoptose induzida por drogas em células cancerosas gástricas-superexpressão ATF4.

Estes resultados indicam que ATF4 promove MDR capacidade das células cancerosas gástricas através de vários mecanismos.

ATF4 transactiva atividade do promotor SIRT1 e liga-se directamente ao promotor SIRT1

para determinar se ATF4 medeia SIRT1
a transcrição de genes, culas 293T foram co-transfectadas com os 1,2 kb SIRT1
plasmídeo repórter promotor e o ATF4
plasmídeo de expressão. O ensaio de repórter de luciferase mostrou que o SIRT1
actividade do promotor foi marcadamente activado por ATF4 de um modo dependente da dose (Fig. 3A).

Numa tentativa para obter uma visão específica sobre os mecanismos de SIRT1
indução, nós examinamos as possíveis vias de indução de ATF4. Ao analisar a sequência flanqueante 5 'do gene SIRT1
com softwares de bioinformática (serviço Tfsitescan, TESS, e Genomatix), dois sítios de ligação ATF4 putativos foram identificados na região de -950 para -600 pb do SIRT1
promotor (Fig. 3B).

Para determinar se SIRT1
é um alvo direto de ATF4, chip com o anticorpo ATF4 usando células SGC7901-ATF4 mostrou o enriquecimento de ambos sites dentro do região promotora SIRT1
vinculativo, indicando que o RNA e nível de proteína subsequente aumento de SIRT1
em linhas de células que expressam ATF4 são provavelmente devido a uma interação direta de ATF4 com o promotor SIRT1
gene (Fig. 3C).

para investigar o papel dos dois locais de ligação na regulação ATF4 SIRT1 transactivação, mutagénese dirigida ao local foi usado para transformar estes locais. ensaio de repórter de luciferase mostraram que tanto a mutação do local de ligação ou um local de ligação 2 reduziu a actividade do promotor induzida por SIRT1 ATF4. Além disso, a mutação de ambos os sítios de ligação aboliu a actividade do promotor SIRT1. Estes resultados sugerem que os sítios de ligação tanto ATF4 estão envolvidos na transactivação do promotor SIRT1 (Fig. S1).

Tomados em conjunto, estes resultados indicam que SIRT1 é um alvo da transcrição directa de ATF4.

SIRT1
inibição por siRNA em parte inverte o fenótipo MDR de células cancerosas gástricas-superexpressão ATF4

a identificação dos mediada por ATF4 nível de expressão SIRT1
aumentos em células cancerosas gástricas, solicitado -nos analisar o papel desta via em MDR câncer gástrico. Para resolver isso, nós comparamos a in vitro
sensibilidade droga em ATF4 estavelmente transfectadas células cancerosas gástricas após transfecção de SIRT1
siRNA ou mexidos siRNA por formação de colónia e ensaios MTT. Knockdown de SIRT1
por siRNA em células SGC7901-ATF4 levaram a a > 40% de redução no número de colónias quando usado em combinação com CDDP (Fig. 4A, superior). Este efeito também foi observado em células AGS-ATF4 (Fig. 4A, inferior). Além disso, os dados do ensaio MTT também indicaram que knockdown de SIRT1
poderia re-sensibilizar as células SGC7901-ATF4 a drogas químicas, mas isto não aconteceu em células mexidos siARN transfectadas (Fig. 4B).

Para determinar se SIRT1 protege as células de apoptose induzida pela CDDP, células SGC7901-ATF4 transfectadas com SIRT1
siRNA ou mexidos siRNA foram tratados com CDDP e marcadas com Anexina V e PI. As células apoptóticas foram identificadas por etiquetagem Anexina V. A percentagem de apoptose das células transfectadas SIRT1 siARN SGC7901-ATF4 foi significativamente maior do que a das células de controlo (Fig. 5A, 72,8% vs 25,9%). A aparência de núcleos condensados ​​e fragmentados também foi aumentada nas células transfectadas SIRT1 siRNA em comparação com as células de controlo (Fig. 5b). Além disso, a clivagem de pro-caspase-3 foi observado tão cedo quanto 12 h após o tratamento com 10 ug /ml de CDDP em SIRT1 siARN transfectadas células SGC7901-ATF4, mas não em células tratadas com siRNA mexidos, mesmo após 24 h de tratamento com CDDP (Fig. 5C ). Estes resultados sugerem que SIRT1 superexpressão suprime a apoptose induzida por CDDP.

Para estudar o efeito da diminuição da regulação da SIRT1 por siRNA em moléculas MDR associada, examinamos MDR1, MRP, Bcl-2 e Bax níveis de expressão em células SGC7901-ATF4 após a transfecção com SIRT1 siRNA ou mexidos siARN. A sub-regulação de MDR1 foi observada nas células tratadas com siRNA SIRT1 (Fig. 5D) em comparação com as células de controlo. Em contraste, não foram encontradas diferença óbvia de MRP, Bcl-2, e os níveis de expressão Bax entre as amostras.

Estas observações indicam que SIRT1 medeia o efeito MDR-induzida ATF4 em células cancerosas gástricas.

a inibição da actividade SIRT1 re-sensibiliza células transfectadas ATF4 a agentes que danificam o DNA

para fornecer evidências de que a atividade catalítica SIRT1 também é responsável para as células induzidas por ATF4 MDR, SGC7901-ATF4 foram pré-tratados com EX-527 , um novo e potente inibidor e de pequena molécula específica de SIRT1, e seguida de tratamento com diferentes drogas químicas. Em primeiro lugar, determinou-se a citotoxicidade basal de EX-527 em LV-Vector e LV-ATF4 células SGC7901 transfectadas de forma estável. O ensaio de MTT revelou que EX-527 em concentrações até 10 uM não inibiu, mas sim ligeiramente aumentado, a viabilidade de ambas as linhas celulares (Fig. 6A). Em seguida, examinámos a SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, a Bcl-2, Bax e os níveis de expressão após 24 horas de incubação com ou sem as doses indicadas de EX-527 em células de cancro gástrico utilizados acima. Apenas a expressão de MDR1 foram regulados negativamente por EX-527 de um modo dependente da concentração (Fig. 6B). Em seguida, pré-incubadas células SGC7901-ATF4 com veículo ou EX-527 (0,5, 1, 2, 4, e 10 uM) durante 24 h, e, em seguida CDDP- e morte celular 5-FU-mediada foi monitorizada. Como mostrado na Fig. 6C, EX-527 aumentou significativamente a citotoxicidade de ambos os fármacos de uma maneira dependente da dose. Determinou-se também o efeito sinérgico possível de EX-527 em diferentes doses de inibição CDDP- e 5-FU-mediada de proliferação celular em células SGC7901-ATF4. Como esperado, 10 uM EX-527 é suficiente para potenciar a citotoxicidade de ambos os fármacos (Fig. 6D).

Estes resultados sugerem que a actividade SIRT1 também desempenha um papel crítico na MDR cancro gástrico induzida por ATF4 e esta papel pode ser mediada, em parte, através da expressão MDR1.

Discussão

MDR coloca desafios clínicos significativos para a quimioterapia eficaz de muitas doenças malignas humanas. Os mecanismos pelos quais as células adquirem resistência são múltiplas e complexas, de modo mais abrangente compreensão das mesmas, bem como a identificação de novos mecanismos para chemoresistance, será particularmente útil para fornecer melhores opções terapêuticas. Este estudo é o primeiro relatório que altos níveis de ATF4, comumente visto em células tumorais em circunstâncias estressantes, confere células cancerosas gástricas com um fenótipo MDR, e identifica que este efeito é mediado em parte pela transativação de expressão SIRT1.

ATF4
e SIRT1 quais são evolutivamente genes de resposta ao estresse conservados envolvidos em um amplo espectro de processos biológicos, muitos dos quais são salutares para a homeostase e proteção celular [22], [23], [ ,,,0],24]. Ambos os genes são induzidos em resposta a uma variedade de tensões, incluindo privação de oxigénio (hipoxia /anoxia), o stress oxidativo, danos no ADN, privação nutricional, e stress quimiotóxicas. Levenson VV et ai.
Primeiro relataram que as alterações na expressão de ATF4 poderia desempenhar um papel na resistência pleiotrópica a diferentes classes de drogas de direccionamento de ADN [16]. Nos últimos anos, vários estudos descobriram que ATF4 estava envolvido direta ou indiretamente no desenvolvimento de resistência aos medicamentos através de autofagia, o sistema dependentes da glutationa redox, e reparação de danos ao DNA [11], [12], [13], [14] [15], [16], [17], [25], [26]. Aqui mostra-se que a capacidade de protecção de ATF4 fato medeia um fenótipo MDR em linhas celulares de cancro que sobre-expressam ATF4 gástricas em resposta à quimioterapia. Nossos resultados mostram claramente que a superexpressão de ATF4 em células cancerosas gástricas foi associada com mais resistência, enquanto o knockdown de ATF4 induzida re-sensibilização. Estes dados sugerem que ATF4 é provavelmente um importante mediador a jusante da resistência causada por múltiplos mecanismos e é, portanto, um alvo terapêutico valioso. No entanto, como um dos mais importantes mediadores da transcrição do ISR que activa uma variedade de genes alvo que promovem a restauração da homeostase, ATF4 pode também mediar a resistência por outros mecanismos. No nosso estudo, SIRT1 foi encontrado para ser regulados positivamente em células que sobre-expressam ATF4, em comparação com células transfectadas vector. Em contraste, o knockdown de ATF4
com ATF4 siRNA específico levou a uma diminuição da regulação da SIRT1 em células de câncer gástrico MDR. Nossos resultados sugerem que SIRT1 pode ser um mediador a jusante do câncer gástrico induzida por ATF4 MDR.

Como um membro da subfamília ATF do fecho de leucina-região básica (bZIP) fatores de transcrição [22], ATF4 tem a potencial de actuar tanto como um activador transcricional ou um repressor de transcrição ou por meio de ATF elemento responsivo a AMPc (CRE) sítios de ligação de [22]. O local de ligação de consenso para ATF foi definida como TGACGT (C /A) (G /A) [27], que é uma sequência idêntica ao consenso elemento CRE (TGACGTCA) [28]. Além disso, o motivo do núcleo altamente conservada - ACGT - na maioria dos CRE [29] pode ligar-se a diferentes factores bZIP, consoante as bases que flanqueiam o motivo de núcleo [22], [30], [31]. Em nosso estudo dois sítios de ligação putativos ATF-CRE foram encontrados em 1,2 kb SIRT1 e região promotor e ATF4 diretamente ativados SIRT1
transcrição via ligação a ambos os elementos de ligação. No entanto, como os dois sítios de ligação desempenhar as suas funções em condições de estresse detalhadas permanece desconhecido e requer uma investigação mais aprofundada.

Mammalian SIRT1
é o homólogo mais próximo da levedura Sir2 Comprar e o membro da família mais estudada SIRT. É fortemente implicada na regulação de processos celulares que determinam a longevidade, incluindo o anti-apoptose, protecção neuronal, e senescência celular ou envelhecimento [32]. Recentemente, um número cada vez maior de estudos têm implicado o aumento da expressão de SIRT1 com resistência à quimioterapia e à radiação [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36] ionizante. Por exemplo, a sobre-expressão SIRT1 foi encontrado no neuroblastoma resistente a drogas, osteossarcoma, da mama, do ovário, da próstata, do cólon, e linhas celulares de cancro do pulmão, em comparação com os seus homólogos sensíveis a fármacos. Todos estes efeitos resistentes a drogas de SIRT1 poderia ser devido ao seu efeito anti-apoptótico [37], [38] e o silenciamento de genes supressores de tumor [39]. Finalmente, podemos prever que, se SIRT1 está envolvido na MDR induzida por ATF4, a inibição da SIRT1 deve afectar a sensibilidade de células que sobre-expressam ATF4 em resposta à quimioterapia. Como esperado, ambos siRNA e a inibição farmacológica de SIRT1 poderia re-sensibilizar as células que sobre-expressam ATF4 a drogas químicas. Além disso, o nosso estudo indica que SIRT1 protege as células de morte, em parte, através de um efeito anti-apoptótico.

tem sido relatado que MDR1 foi regulados positivamente em células com a expressão aumentada SIRT1 [18], [36]. Neste estudo, também foi demonstrado que MDR1 é sobre-regulada em células que sobre-expressam ATF4, e knockdown de SIRT1 com SIRT1 siRNA específico ou inibir a sua actividade com EX-527 poderia levar a sub-regulação de MDR1, o que é consistente com uma droga papel resistente à por SIRT1. No entanto, a proporção de Bcl-2 /Bax, a qual foi regulada em células que sobre-expressam ATF4, era independente de SIRT1, sugerindo que os mecanismos independentes de SIRT1 também desempenhar um papel na MDR induzida por ATF4 em células de cancro gástrico.

Em resumo, demonstrámos que ATF4 confere um fenótipo MDR às células cancerosas gástricas, e este efeito é mediado, em parte, por sobre-expressão de transactivação de SIRT1. Além disso, ATF4 é um alvo válido em tumores gástricos resistentes a drogas, e desenvolver novos inibidores eficazes de ATF4 deve ser tomado em consideração no futuro. Estes resultados fornecem novos insights sobre o papel da ATF4 no controle da expressão SIRT1 e em suas características de tensão-resistência em tumorigênese e quimioterapia. Isto é especialmente importante para a consideração clínica, como ATF4 pode ser regulada para cima pela privação de oxigênio, estresse oxidativo, privação nutricional e quase todos os estressores adversos em um microambiente do tumor, o que poderia ser sequestrados pelas células cancerosas para escapar inibição da proliferação e morte celular em resposta à quimioterapia. Portanto, as intervenções baseiam em interromper expressão ATF4 induzida por estresse em células de câncer pode ser eficaz em contornar ou reverter a resistência a drogas em câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Para métodos detalhados, consulte Texto S1 .

cultura de células e reagentes

as linhas de células adenocarcinoma gástrico humanos SGC7901 (obtido a partir da Academia de Ciências Médicas militares, Beijing, China) eo MDR variantes, SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR (estabelecido e mantido no nosso laboratório), e AGS (obtidos a partir do banco de células da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e penicilina /estreptomicina. As células 293T (também obtidos a partir do banco de células da Academia Chinesa de Ciências) foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. Para manter o fenótipo MDR, adriamicina (com uma concentração final de 0,5 ug /ml) e vincristina (com uma concentração final de 1 ug /ml) foram adicionados ao meio de cultura para SGC7901 /ADR e células SGC7901 /VCR, respectivamente. EX-527 (Sigma) foi dissolvido em DMSO nas concentrações indicadas. A adriamicina (ADR), vincristina (VCR), cisplatina (CDDP), e 5-fluorouracilo (5-FU) foram dissolvidos em solução salina normal a concentrações indicadas.

transfecção de células e linhas celulares estáveis ​​

O humano ATF4
plasmídeo de expressão (pCMV5-ATF4) foi gentilmente cedido pelo Professor Amy S. Lee [25]. Lentiviral vector que codifica siRNA específico para ATF4
e ARNsi de controlo foram gerados com a utilização de PLKO.1-TRC (Addgene) e foram designados como LV-siATF4 e controlo LV-SCR, respectivamente. ATF4 gene humano lentiviral vector que codifica foram construídos em FUW-teto (Addgene), designado como LV-ATF4. O vector vazio foi utilizado como controlo negativo, designado como LV-vector. As linhas celulares estáveis ​​foram gerados por transfecção de construções lentivirais indicados seguido de selecção em puromicina ou zeocina (Invitrogen), respectivamente. transfecção celular e geração de linhas celulares estáveis ​​foram realizadas usando procedimentos padrão. As sequências das estruturas de ARNip pode ser encontrada em textos S1.

imunotransferência

A recolha de extractos de proteína e análise de imunotransf erência foram realizadas usando procedimentos padrão. Para fontes de anticorpos, consulte S1 texto.

Colony ensaio de formação de

O ensaio de formação de colónias foi realizada, como descrito anteriormente [40], com ligeiras modificações (Texto S1).

V coloração de anexina e análise FACS

Anexina V coloração e análise FACS foi realizada utilizando procedimentos padrão. Células negativas para ambos PI e anexina V coloração foram classificados como células vivas, células que coraram positivo para anexina V só foram classificados como células em apoptose precoce e células positivas PI positivos e anexina V foram células em estágios tardios da apoptose.

DNA fragmentação ensaio

os fragmentos de DNA foram extraídas com o kit de extracção de DNA Ladder com coluna de rotação (C0008, Beyotime Co., Beijing, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Os fragmentos de ADN foram separados usando electroforese em gel num gel de agarose a 1% contendo 0,1 ug /ml de brometo de etídio.

Hoechst coloração

Hoechst A coloração foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (C0003, Beyotime Co. ). As células foram visualizadas com um microscópio de imunofluorescência DP70 invertido (Olympus). As células com núcleos condensados ​​e fragmentados foram julgados por apoptose.

In vitro
sensibilidade droga ensaio

ADR, VCR, CDDP, e 5-FU foram todos preparados antes cada experiência. sensibilidade ao fármaco foi medida utilizando um ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio (MTT) de acordo com o protocolo padrão (Texto S1).

real quantitativa -tempo de PCR (qPCR)

quantitativa PCR em tempo real foi realizado utilizando um sistema LightCycler 480 II (Roche) e SYBR Green detecção (Takara). Sequências dos iniciadores podem ser encontrados em S1 texto.

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

ensaios ChIP foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante (P2078, Beyotime Co.) com ligeiras modificações. Chromatin soluções foram sonicadas e incubadas com anti-ATF4 ou com IgG de controlo, e rodada durante a noite a 4 ° C. ADN-proteína ligações cruzadas foram invertidos e o DNA de cromatina foi purificado e sujeito a análise por PCR. Os iniciadores 5'-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3 'e 5'-TTT GGA GTC CTT CCT TTC-3' foram usados ​​para amplificar o SIRT1
sequência do promotor distai (A1, os nucleótidos -974 a - 843), e os iniciadores 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'e 5'-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3' foram usados ​​para amplificar o SIRT1
sequência promotora proximal (A2, nucleótidos -781 a -647). Os iniciadores para a GAPDH
, 5'-TAG CGG TAC TTT GGG TAC CG-3 'e 5'-TCG AAC AGG AGG AGC AGA GAG CGA-3', foram utilizados como um controlo negativo. Como um controlo positivo para a interacção ADN-ATF4, os iniciadores 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3 'e 5'-CGC TTA TAC CGA GCG CCT TCC T-3', que foram concebidos para amplificar a asparagina sintetase a região do promotor ( ASNS
) que contém pelo menos dois sítios relatados para ligar ATF4 [41], foram também usadas. Após a amplificação, os produtos de PCR foram resolvidos num gel de agarose a 1,5% e visualizado por coloração com brometo de etídio

Repórter ensaio de gene

O 1,2 kb humano SIRT1
sequência promotora (. - 1100-100 pb) foi sintetizado e clonado nos locais XhoI e HindIII do vector pGL3-Basic. A construção resultante foi confirmada por sequenciação de ADN. As células 293T foram depois co-transfectados com o SIRT1
plasmídeo repórter promotor, o plasmídeo pRL-TK (Promega, EUA), e o plasmídeo pCMV5-ATF4 utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lavadas três vezes com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, as células foram lisadas em 100 ul de Tampão de Lise Passiva (Promega) e agitou-se durante 15 minutos. Luciferase de pirilampo e Renilla actividades de luciferase foram medidas usando o Ensaio Repórter Sistema Dual-Luciferase (Promega) com um leitor de microplacas Varioskan flash (Thermo Scientific). "Actividade Relativa" foi definido como a razão de actividade de luciferase do pirilampo para Renilla actividade de luciferase e foi calculada dividindo a intensidade de luminescência obtidos com o ensaio de luciferase de pirilampo pela da luciferase de Renilla. Todas as medições foram realizadas em triplicado, e os ensaios foram repetidos três vezes em 293 células T.

A análise estatística

Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. Todos os dados foram apresentados como o valor médio ± D.P. A diferença entre as médias foram analisados ​​com o teste t de Student. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS16.0 (Chicago, IL). Significância foi estabelecido ao nível de 5%.

Informações de Suporte
Figura S1.
Efeito de sítios de ligação mutados ATF4 sobre a actividade do promotor SIRT1. As células 293T foram co-transfectadas com pCMV-ATF4 e tipo selvagem SIRT1, SIRT1-Mut1, SIRT1-Mut2, ou Mut1 + Mut2 repórter, e a actividade de luciferase relativa foi determinada. A actividade da luciferase do grupo pCMV-Taq simulada foi designado como 1,00. Os resultados são a média ± S.D. de três experiências realizadas em duplicado. *, P < 0,05. O lado esquerdo é uma representação esquemática das construções de gene repórter. Os gráficos de barras no lado direito representam os níveis relativos de actividade luciferase em cada uma das amostras transfectadas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
texto S1.
material suplementar e Métodos.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos ao professor Amy S. Lee para gentilmente nos fornecer com o plasmídeo pCMV5-ATF4 . Agradecemos também o Sr. Taidong Qiao e Zheng Chen por sua excelente assistência técnica.

• PLOS ONE: suscetibilidade genética na CagA-Interacting Moléculas e interação gene-ambiente com Fitoestrógenos: Um Factor de putativos Risco para Câncer Gástrico
• PLOS ONE: Proteína S100A6 Negativamente Regula CacyBP /SIP-Mediated inibição de câncer gástrico proliferação celular e Tumorigênese