Background VerfÜgung
Multidrug Resistenz (fir Premier) zu gastric Kriibs bleift eng grouss Erausfuerderung fir Krankheete behandelen. Activating Transkriptiouns Faktor 4 (ATF4) ass e Stress Äntwert Gentherapie zu homeostasis a bewosst Schutz Équipe. Allerdéngs bleift d'Expressioun an Funktioun vun ATF4 zu gastric Kriibs fir Premier onbekannt. An dëser Etude, mir kucken ob ATF4 eng Roll an gastric Kriibs fir Premier an den potenziellen Mechanisme spillen. VerfÜgung
Methodik /Principal effektiv VerfÜgung
Mir bewisen, dass ATF4 overexpression de Premier phenotype zu gastric Kriibs Zellen confered, iwwerdeems knockdown vun ATF4 am fir Premier Varianten du-drëm entschlof. An dëser Etude mir awer och, datt d'Nad Konklusiounen /Grousses VerfÜgung Mir weisen datt ATF4 eng Schlësselroll an der Regulatioun vun fir Premier hat zu gastric Kriibs Zellen an Äntwert ze Chimiotherapie an dëse Conclusiounen hindeit datt ATF4 gezielt therapeutesch Resistenz zu gastric Kriibs anersäits konnt VerfÜgung Fro:. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et al. (2012) Activating Transkriptioun Factor 4 jidferengem eng Multidrug Resistance Phenotype zu Gastric Cancer BTS duerch Transactivation vun SIRT1 Expression. PLoS NËMMEN 7 (2): e31431. Doi: 10.1371 /journal.pone.0031431 VerfÜgung Redakter: Wael El-Rifai, Barnard University Medical Center, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung Arnaque: September 5, 2011; Akzeptéiert: 8 Januar 2012; Publizéiert: 17. Februar 2012 zu Copyright: © 2012 Zhu et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung Funding:. Dës Etude Chinesesch Postdoctoral Science Foundation (NO.20100471776), d'National Key an Grondakommes Research Development plangen vu China war vun kombinéiert Stipendien aus der National Natural Science Foundation of China (NO.81090270, NO.81090273, an NO.81000864) ënnerstëtzt, ( KENG. 2010CB529302), an der National Municipal Wëssenschaft an Technologie Project (2009ZX09103-667 an 2009ZX09301-009-RC06). D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung Multidrug Resistenz ass normalerweis der Haaptrei féieren fir Echec vun Chimiotherapie géint malignant erhéijen, inklusiv gastric Kriibs [1] Éislek laangfristeg multidrug Resistenz ass classically benotzt engem Resistenz phenotype ze definéieren, wou Zellen mat kee zu verschiddenen Drogen gläichzäiteg méi resistent ginn kloer strukturell funktionéiert a mat verschiddene bewosst Ziler [2]. Fir Premier iwwerhaapt méi dacks mat Roman Drogen datt no hir éischt Uwendung vun Kriibs Behandlung méi bedeitend Wierksamkeet hunn. D'Medeziner Nëtzlechkeet vun Multiple Drogen ass déi souwuel natierlech an Qualifikatiounen entholl Zell Resistenz limitéiert, déi bal ëmmer multifactorial ass an Natur [3]. D'Facteuren, datt Drogenofhängeger Empfindlechkeet Afloss kann och: denke Drogenofhängeger efflux, Drogen- Aktivéierung an inactivation, hire Restaurant am Alkohol- Zil, DNA methylation, Ofwécklung vun Drogen-entschlof Schued, a kënne vun apoptosis [4] VerfÜgung Gastric Kriibs. ass relativ Géigestand seng Identitéit verléiert zu chemotherapeutics. D'fir Premier Mechanismen gastric Kriibs Zellen schonn an eisem Labo a soss [1], [4], [5], nach si hunn breeder propagéieren net vollstänneg opgekläert ginn, wat beweist, datt aner onbekannt Molekülle oder Weeër kann an der Entwécklung vun Équipe ginn fir Premier. VerfÜgung an mammalian Zellen, eukaryotic Iwwersetzung Initiatioun Faktor 2 α subunit (eIF2α) ass duerch verschidden eIF2α kinases an Äntwert zu verschiddene Stress Signaler, dorënner anoxia /hypoxia, endoplasmic reticulum Stress, Aminosaier Entzuch phosphorylated, an oxidative Stress. Dëst phosphorylation Evenement féiert zu enger séierer Ofsenkung global FAQ biosynthesis concurrent mat Aféierungs- vun respektiv Ausdrock vun Genen, dorënner ATF4 VerfÜgung dass bewosst Schued vu Stress verréngeren Funktioun zu [6], [7]. Obwuel ATF4 eng pro-apoptotic Roll ënnert de Konditiounen vun schwéieren oder länger Stress spille kann, ass ATF4 VerfÜgung engem mächtegst Stress-responsiven Gentherapie geduecht fir eng Schutz- Roll Leeschtung vun Regulatioun bewosst Upassung un ongewollt Ëmstänn vun der integréiert Stress Äntwert ( ISR) [8], [9], [10]. Kuerzem, overexpression vun ATF4 gemellt huet zu enger grousser Villfalt vu erhéijen groussaarteg gin an entholl Zellen géint Multiple betount, wéi och eng Rei vun Kriibs therapeutesch Agenten [11], [12], [13], [14] ze schützen, [15], [16], [17]. D'Potential Mechanismen responsabel fir dës Protektioun och autophagy kopéiert, Promotioun vun DNA Schued gefléckt, an weider-Regulatioun vun intracellular glutathione [12], [13], [14], [17]. Allerdéngs bleift d'Expressioun an Funktioun vun ATF4 zu gastric Kriibs fir Premier onbekannt. VerfÜgung An dëser Etude, mir gemellt, datt ATF4 war vill an der fir Premier Äntwert vun gastric Kriibs Zellen am Verglach mat den Elteren Kontroll Zellen up-reegelen. Knockdown vun ATF4 VerfÜgung vun siRNA vill Zellen mat fir Premier zu enger Rei vun chemotherapeutic Agenten sensitized hierkommen weider-Regulatioun vun ATF4 zu SGC7901 an AGS Zellen sprachlos se méi resistent multidrug. Mir weisen awer och, datt ATF4 gastric Kriibs fir Premier deelweis duerch up-Regulatioun Ausdrock vun SIRT1 gefördert. An SIRT1 inhibition kéint deelweis ëmgedréint der gastric Kriibs fir Premier phenotype mediated vun ATF4. Dës Donnéeë hindeit, datt gezielt ATF4 engem Roman therapeutesch Méiglechkeet bidden kann Medeziner gastric Kriibs fir reversing fir Premier. VerfÜgung ATF4 modulates de Premier phenotype vun gastric Kriibs Zellen VerfÜgung Fir erauszefannen, ob ATF4 ass an der Entwécklung vun fir Premier an gastric Kriibs Zellen wollten, waren ATF4 Niveau vun Western blot an qPCR vun der Linn SGC7901 Zell fonnt ginn an hiren fir Premier Varianten, SGC7901 /VCR an SGC7901 /ADR. Béid FAQ a mRNA Niveau vun ATF4 sech vill méi héich an de resistent Zell Linnen ewéi am Congé Zellen (Figebam. 1A). VerfÜgung Fir ze kucken, ob ATF4 overexpression genuch ass e fir Premier phenotype zu gastric Kriibs Zellen ze induce, ATF4 VerfÜgung war Ausdrock cDNA an SGC7901 an AGS Zellen stably transfected. Éischt, war CDDP Empfindlechkeet getest enger Kolonie Opstellung assay benotzt. Wéi déi vun der quantification vun der Kolonisatioun Opstellung assay gewisen, schéinen ATF4 overexpression an engem bal 3-fantastesch Erhéijung vun Amphipolis Zuelen am Verglach mat eidelen Vecteure-ausdrécken Zellen (Figebam. 1B). MTT assays annoncéiert och dass d'IC 50 Wäerter vun SGC7901-ATF4 fir ADR, VCR, CDDP, a 5-FU sech vill méi wéi am Verglach zu eidel Vecteure transfected Zellen (Figebam. 1D). VerfÜgung Wéi ATF4 Niveauen gastric Kriibs Zellen an fir Premier gefördert ginn, hu mer nach weider ze bestëmmen, ob gezielt ATF4 de Premier Zell Linnen du-sensitize konnt. Knockdown vun ATF4 VerfÜgung vun siRNA an der SGC7901 /ADR an SGC7901 /VCR zu engem 2- bis 3-fantastesch Reduktioun zu Zell Zuel gefouert Zellen wann a Kombinatioun mat CDDP benotzt (Figebam. 1c). Donnéeën zu Figebam. 1E proposéieren och, datt verwandelt-Regulatioun vun ATF4 VerfÜgung d'Resistenz vun SGC7901 /ADR Zellen an Äntwert ze Chimiotherapie vill reverses. VerfÜgung Als inhibition vun apoptosis eent vun wichteg Mechanisme vun fir Premier ass, mir och propagéieren d'Kapazitéit vun der SGC7901 /ADR Zellen mat der konkreter transfected ATF4 VerfÜgung siRNA CDDP-entschlof apoptosis vun Hoechst staining an DNA véiermol assays ze forméieren. Traitement vun SGC7901-ATF4 an SGC7901 /ADR-SCR Zellen mat der uginn Konzentratioune vun CDDP fir 36 Stonnen induce hu keng apoptosis, évaluéieren wéi vun Hoechst nuklear staining (Figebam. 1F) an DNA véiermol assays (Figebam. 1G). Am Géigesaz, ugewisen SGC7901-Vecteure an SGC7901 /ADR-siATF4 Zellen bedeitendst apoptosis, mat de méi heefege Optrëtt vun der condenséierter an fragmentaresch Kären an DNA Leeder Équipe. Desweideren, méi kloer Rëss vun procaspase-3 war zu SGC7901-Vecteure an SGC7901 /ADR-siATF4 Zellen der Behandlung mat CDDP observéiert als Verglach zu SGC7901-ATF4 an SGC7901 /ADR-SCR Zellen, bzw. (Figebam. 1H). VerfÜgung zesummen deelgeholl, weg dës Resultater datt ATF4 eng fir Premier phenotype zu gastric Kriibs Zellen jidferengem an datt ATF4 gezielt gëtt eng Method vun resistent Zellen ze chemesch Behandlung sensitizing. VerfÜgung ATF4 up-reguléieren den Ausdrock vun SIRT1, MDR1 , BCL-2, an Bax zu gastric Kriibs Zellen VerfÜgung virdrun Studien gemellt hunn, dass Zellen overexpressing SIRT1 ofgeholl Empfindlechkeet op Chimiotherapie vun Multiple Mechanismen ugewisen [18], [19], [20], [21]. Mir ware virwëtzeg fir festzestellen, ob SIRT1 VerfÜgung, déi engem Stress-Zesummenhang Gentherapie un fir Premier Entwécklung kritesch ass, konnt de afgerappt Zilscheif vun ATF4 responsabel fir mediating ATF4-entschlof fir Premier an gastric Kriibs Zellen ginn. VerfÜgung SIRT1 Niveauen am LV-Vecteure an LV-ATF4 stably transfected SGC7901 Zellen sech duerch qPCR a Western blot assayed. D'overexpression vun ATF4 war um mam fräi SIRT1 Ausdrock verbonne souwuel d'transcriptional (Figebam. 2A, lénks) an respektiv Niveauen (Figebam. 2B, lénks). Am Géigesaz, siRNA knockdown vun ATF4 VerfÜgung zu SGC7901 /ADR Zellen e schéinen däitleche Minus vun endogenous SIRT1 VerfÜgung Ausdrock (Figebam. 2A an 2B, riets). Dës Resultater hindeit, datt ATF4 up-reguléieren SIRT1 VerfÜgung Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung weider Fir de molekulare Mechanismen ermëttelen ATF4-Zesummenhang fir Premier vun gastric Kriibs Équipe an mir och iwwerpréift MDR1, MRP, BCL-2, an Bax Ausdrock Niveauen an der gastric Kriibs Zellen virun benotzt. Als zu Lalumi gewisen. 2B, ausgedréckt ATF4-beherrscht Zellen méi MDR1 wéi zu der Kontroll Zellen Verglach. Mëttlerweil, war keng kloer Differenz zu MRP Ausdrock vun enger vun dësen Zell Linnen fonnt. Spannen, sech souwuel BCL-2 an Bax Ausdrock Niveauen am ATF4-beherrscht Zellen-up reegelen, am Verglach mat der Kontroll Zell Linnen, iwwerdeems den Ausdrock vun Bax nëmme liicht Ännerunge weisen, wat beweist, datt eng weider-Regulatioun vun der BCL-2 zu Bax Verhältnis kéint d'Drogen-entschlof apoptosis zu ATF4-overexpressing gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung Des Resultater weisen, datt ATF4 Reklamm fir Premier Fähegkeet vun gastric Kriibs Zellen duerch verschidde Mechanismen oofgesinn. VerfÜgung ATF4 transactivates SIRT1 Promoteur Aktivitéit an direkt Photo'en zu der SIRT1 Promoteur VerfÜgung fir erauszefannen, ob ATF4 mediates SIRT1 VerfÜgung Gentherapie Transkriptiouns, 293T Zellen sech Co-transfected mat der 1.2 kB SIRT1 VerfÜgung Promoteur reporter plasmid an der ATF4 VerfÜgung Ausdrock plasmid. D'luciferase reporter assay gewisen, datt d' SIRT1 VerfÜgung Promoteur Aktivitéit Ofstand vun ATF4 an enger Portioun-ofhängeg Manéier (Figebam. 3A). VerfÜgung An opgeraf ausgeléist gouf spezifesch Abléck an d'Mechanismen ze gewannen vun SIRT1 VerfÜgung kopéiert, iwwerpréift mir de méiglech Aféierungs- Weeër aus ATF4. Vun der analyséiert 5'-Reliefsailen Haaptrei vun der SIRT1 VerfÜgung Gentherapie mat Bioinformatik softwares (Tfsitescan Service, Tess, an Genomatix), zwee ATF4 putative bindend Siten am -950 bis -600 BP Regioun vun der identifizéiert goufen SIRT1 VerfÜgung Promoteur (Figebam. 3B). VerfÜgung fir erauszefannen, ob SIRT1 zu engem direkte Zilscheif vun ATF4 ass, Chip mat der ATF4 antibody benotzt SGC7901-ATF4 Zellen Beräicherung souwuel zougedréckt verbindlech Siten am SIRT1 VerfÜgung Promoteur Regioun, wat beweist, datt d'RNS a Kierzunge FAQ Erhéijunge vun SIRT1 VerfÜgung an sinn ATF4-ausdrécken Zell Linnen wahrscheinlech wéinst engem direkten Interaktioun vun ATF4 mat der SIRT1 VerfÜgung Gentherapie Promoteur (Figebam. 3C). VerfÜgung fir d'Roll vun den zwou ATF4 bindend Siten ermëttelen war zu Regulatioun SIRT1 transactivation, Site-Direkter mutagenesis benotzt dëse Siten ze mutate. Luciferase reporter assay gewisen, datt entweder d'obligatoresch Site mutating 1 oder obligatoresch Site 2 der SIRT1 Promoteur Aktivitéit entschlof vun ATF4 reduzéiert. Ausserdeem, stattfannen souwuel bindend Siten ofgeschaf der SIRT1 Promoteur Aktivitéit. Dës Resultater ugeholl datt béides ATF4 bindend Siten an der transactivation vun SIRT1 Promoteur Équipe ginn (Figebam. S1). VerfÜgung zesummen deelgeholl, weg dës Resultater datt SIRT1 engem direkten transcriptional Zilscheif vun ATF4 ass. VerfÜgung SIRT1 VerfÜgung inhibition vun siRNA deelweis de Premier phenotype vun ATF4-overexpressing gastric Kriibs Zellen reverses VerfÜgung d'Identifikatioun vun ATF4-mediated SIRT1 VerfÜgung Ausdrock Niveau Erhéijunge gastric Kriibs Zellen, Suite eis d'Roll vun dëser Passerelle an gastric Kriibs fir Premier ze analyséieren. Fir Adress dat, am Verglach mir den kënschtlech VerfÜgung Drogenofhängeger Empfindlechkeet vun ATF4 stably gastric Kriibs Zellen der transfection vun SIRT1 VerfÜgung siRNA transfected oder siRNA vun Amphipolis Équipe an MTT assays Jacquerie. Knockdown vun SIRT1 VerfÜgung vun siRNA zu SGC7901-ATF4 zu engem gefouert Zellen > 40% Reduktioun vun Amphipolis Zuel wann a Kombinatioun mat CDDP benotzt (. Lalumi 4A, uewen). Dësen Effekt gouf och zu AGS-ATF4 Zellen (Figebam. 4A, manner) observéiert. Desweideren, Daten aus der MTT assay annoncéiert och dass knockdown vun SIRT1 VerfÜgung konnt SGC7901-ATF4 Zellen ze chemesch Drogen du-sensitize, mee dat net gemaach an Jacquerie siRNA transfected Zellen geschéien (Figebam. 4B). VerfÜgung Fir erauszefannen, ob SIRT1 d'Zellen aus CDDP-entschlof apoptosis schützt, transfected SGC7901-ATF4 Zellen mat SIRT1 VerfÜgung siRNA oder Jacquerie siRNA sech mat CDDP behandelt a mat Annexin V an PI ausgezeechent. D'apoptotic Zellen sech duerch Annexin V Etikette identifizéiert. D'apoptotic Prozentsaz vun SIRT1 siRNA transfected SGC7901-ATF4 Zellen wéi déi vun der Kontroll Zellen bedeitend méi héich war (Figebam. 5A, 72,8% vs. 25,9%). D'Ernimmung vun der condenséierter an fragmentaresch Käre war och zu SIRT1 siRNA transfected Zellen sech am Verglach zu der Kontroll Zellen (Figebam. 5B). Ausserdeem, Rëss vun procaspase-3 war observéiert esou fréi wéi 12 h der Behandlung mat 10 μg /ml CDDP zu SIRT1 siRNA transfected SGC7901-ATF4 Zellen, mä net zu Jacquerie siRNA behandelt Zellen, och no 24 h vu CDDP Behandlung (Figebam. 5C ). Dës Resultater hindeit, datt SIRT1 overexpression Hien CDDP-entschlof apoptosis. VerfÜgung Fir d'Wierkung vun verwandelt-Regulatioun vun SIRT1 vun siRNA op fir Premier verbonne Molekülle studéieren, mir iwwerpréift MDR1, MRP, BCL-2, an Bax Ausdrock Niveauen am SGC7901-ATF4 Zellen folgenden transfection mat SIRT1 siRNA oder Jacquerie siRNA. Down-Regulatioun vun MDR1 war an der SIRT1 siRNA-behandelt Zellen (Figebam. 5D) am Verglach zu der Kontroll Zellen observéiert. Am Géigesaz, keng kloer Differenz vun MRP, BCL-2, an Bax Ausdrock Niveauen sech tëscht dem Echantillon. VerfÜgung Dës Observatioune weg fonnt dass SIRT1 der ATF4-entschlof fir Premier Effet vun gastric Kriibs Zellen mediates. VerfÜgung Inhibition vun SIRT1 Aktivitéit du-sensitizes ATF4 transfected Zellen ze DNA-Lupp Agenten VerfÜgung Beweiser fir déi déi SIRT1 Katalysator Aktivitéit ass och responsabel fir d'ATF4-entschlof fir Premier, SGC7901-ATF4 Zellen sech mat pretreated EX-527 , e Roman, mächtegst a spezifesch kleng-Protein inhibitor vun SIRT1, a vum Traitement mat verschidden chemesch Drogen gefollegt. Éischt, sech mir d'basal cytotoxicity vun EX-527 am LV-Vecteure an LV-ATF4 stably transfected SGC7901 Zellen. D'MTT assay Teamchef EX-527 bis zu 10 μM um Konzentratioune inhibit net, mä éischter e bësse méi, d'Nuetsvolen souwuel Zell Linnen (Figebam. 6A). Next, mir iwwerpréift SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, BCL-2, an den Ausdrock Niveauen Bax no 24 incubation 'Stonnen mat oder ouni d'uginn Dosis vun EX-527 zu der gastric Kriibs Zellen virun benotzt. Nëmmen d'Expressioun vun MDR1 sech verwandelt-reegelen EX-527 zu enger Konzentratioun-ofhängeg Manéier (Figebam. 6B). Dunn preincubated mir SGC7901-ATF4 Zellen mat Gefier oder EX-527 (0,5, 1, 2, 4, an 10 μM) fir 24 h, an dann CDDP- a 5-FU-mediated Zell Doud iwwerwaacht gouf. Als zu Lalumi gewisen. 6C, EX-527 der cytotoxicity souwuel Drogen an enger Portioun-ofhängeg Manéier bedeitend verstäerkt ginn. Mir sech och d'méiglech synergistic Effet vun EX-527 op verschidde Schrëtt vun CDDP- a 5-FU-mediated inhibition vun Zell Verbreedung zu SGC7901-ATF4 Zellen. Wéi erwaart, ass 10 μM EX-527 genuch der cytotoxicity souwuel Drogen ze potentiate (Figebam. 6D). VerfÜgung Des Resultater hindeit, datt SIRT1 Aktivitéit spillt och eng kritesch Roll an der ATF4-entschlof gastric Kriibs fir Premier an dëser Roll kënnen deelweis duerch MDR1 Ausdrock mediated ginn. VerfÜgung fir Premier stellt bedeitendst Medeziner Erausfuerderunge fir déi effektiv Chimiotherapie vu ville mënschleche malignancies. D'Mechanisme vun deenen Zellen Resistenz Kaf sinn Multiple a komplex, also méi extensiv Versteesdemech vun hinnen, souwéi Identifikatioun vun Roman Mechanismen fir chemoresistance, wäert besonnesch wertvoll zu besser therapeutesch Optiounen ëmzesetzen. Dës Etude ass den éischte Rapport, datt héich Niveaue vu ATF4, allgemeng zu entholl Zellen ënner stresseg Ëmstänn gesinn, jidferengem gastric Kriibs Zellen mat enger fir Premier phenotype, an et identifizéiren dat Effekt deelweis duerch transactivation vun SIRT1 Ausdrock mediated ass. VerfÜgung ATF4 VerfÜgung a SIRT1 VerfÜgung zu engem breede Spektrum vun engem biologesche Prozesser Équipe evolutionarily conserved Stress Äntwert Genen sinn, vill vun deenen salutary sinn fir homeostasis a bewosst Schutz [22], [23], [ ,,,0],24]. Zwee vun dësen Genen sinn an Äntwert zu enger Rei vu Logik entschlof, dorënner Sauerstoff Entzuch (hypoxia /anoxia), oxidative Stress, DNA Schued, muss Entzuch, a chemotoxic Stress. Levenson VV et al. VerfÜgung gemellt éischt dass Ännerungen an Ausdrock vun ATF4 eng Roll an der pleiotropic Resistenz zu verschiddene Klasse vun DNA-gezielt Drogen Leeschtung kéint [16]. An de leschte Joren, no e puer Studien fonnt dass ATF4 war direkt oder indirekt un der Entwécklung vun Drogenofhängeger Resistenz duerch autophagy, déi glutathione-ofhängeg redox System, an DNA Schued gefléckt [11], Équipe [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Hei weisen mir, datt d'Schutzpatrounin Fähegkeet vun ATF4 Exemplar mediates eng fir Premier phenotype zu ATF4-overexpressing gastric Kriibs Zell Linnen an Äntwert ze Chimiotherapie goen. Eis Conclusiounen weisen kloer dass overexpression vun ATF4 zu gastric Kriibs Zellen mat méi Resistenz verbonne war, iwwerdeems knockdown vun ATF4 du-drëm entschlof. Dës Donnéeë hindeit, datt ATF4 ass wahrscheinlech eng wichteg afgerappt Vermëttler vu Resistenz vun Multiple Mechanismen ëmmer an ass deemno e wäertvolle therapeutesch viséieren. Nach, als eent vun de wichtegsten transcriptional mediators vun der ISR déi ganz Varietéit vun Zil- Genen activéiert datt Restauratioun vun homeostasis förderen, kann ATF4 Mediate och Resistenz vun anere Mechanismen. An eiser Etude, war SIRT1 fonnt an ATF4-overexpressing Zellen am Verglach zu Vecteure transfected Zellen up-reglementéiert gin. Am Géigesaz, knockdown vun ATF4 VerfÜgung mat ATF4 spezifesch siRNA Nerve engem Ugrëff-Regulatioun vun SIRT1 zu gastric Kriibs Zellen fir Premier. Eis Resultater hindeit, datt SIRT1 kéint ee matgeholl Vermëttler vun ATF4-entschlof gastric Kriibs fir Premier ginn. VerfÜgung Als Member vun der ATF subfamily vun der Basis-Regioun leucine kridd (bZIP) Transkriptiouns Faktoren [22], huet ATF4 der Potential ze handelen, entweder e transcriptional activator oder engem transcriptional repressor via ATF oder Camp responsiven Element (CRE) bindend Siten [22]. De Konsens bindend Site fir ATF war den TGACGT (C /A) (G /A) [27], definéiert, déi eng Rei sëlwecht fir den CRE Konsens Element ass (TGACGTCA) [28]. Och, déi héichgradeg conserved Kär Motif - ACGT - am meeschte CREs [29] kann zu verschiddene bZIP Faktoren festleeën, jee op d'Kontinentaltruppe Base vun de Kär Motif [22], [30], [31]. An eiser Etude zwee putative ATF-CRE bindend Siten am 1.2 KB fonnt goufen SIRT1 VerfÜgung Promoteur Regioun, an ATF4 direkt ageschalt SIRT1 VerfÜgung Transkriptiouns via zu zwee verbindlech Elementer obligatoresch. Mä, wéi déi zwee verbindlech Siten Leeschtung hir Rollen ënner detailléierte Stress Ëmstänn bleift onbekannt a verlaangt weider Enquête. VerfÜgung Mammalian SIRT1 VerfÜgung ass den nosten homologue vun den Happ Sir2 VerfÜgung an déi extensiv SIRT Familljemember studéiert. Et ass kräfteg an d'Regulatioun vun bewosst Prozesser agebonne datt longevity festzestellen, dorënner anti-apoptosis, neuronal Schutz, a bewosst senescence oder Alterungsprozess [32]. Kuerzem, hunn eng waarden Zuel vun Studien mat Resistenz ze Chimiotherapie Ausdrock vun SIRT1 agebonne fräi an ioniséierender Stralung [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Zum Beispill, huet SIRT1 overexpression gouf zu Drogenofhängeger-resistent neuroblastoma, Kand besser, mammary, spillt, Aarbecht, Colon, an haett Kriibs Zell Linnen am Verglach mat hirer Alkohol--senisitive Kollegen fonnt. All dës Drogenofhängeger resistent géint Auswierkunge vun SIRT1 kéint eventuell gin wéinst hirer Anti-apoptotic Effekt [37], [38] an silencing vun entholl suppressor Genen [39]. Endlech, kéint mir viraus, datt, wann SIRT1 an der ATF4-entschlof fir Premier Équipe ass, inhibition vun SIRT1 soll der Empfindlechkeet vun ATF4-overexpressing Zellen an Äntwert ze Chimiotherapie betreffen. Wéi erwaart, hätt souwuel siRNA an pharmacological inhibition vun SIRT1 ATF4-overexpressing Zellen ze chemesch Drogen-du sensitize. Zousätzlech, eiser Etude beweist dass SIRT1 Zellen aus Doud deelweis duerch en Anti-apoptotic Effekt schützt. VerfÜgung Et gemellt gouf, datt MDR1 war vun Zellen mat fräi SIRT1 Ausdrock an-reegelen [18], [36]. An dëser Etude, hien huet mir och, datt an ATF4-overexpressing Zellen up-reegelen, an knockdown vun SIRT1 mat SIRT1 spezifesch siRNA oder inhibiting hir Aktivitéit mat EX-527 Féierung konnt bis erof-Regulatioun vun MDR1, déi mat engem Alkohol- konsequent ass MDR1 ass -resistant Roll vun SIRT1. der BCL-2 /Bax Verhältnis, awer, deen an der ATF4-overexpressing Zellen up-reglementéiert war, war SIRT1-onofhängeg, suggeréiert datt SIRT1-onofhängeg Mechanisme och eng Roll an der ATF4-entschlof fir Premier an gastric Kriibs Zellen Leeschtung. Am Resumé, weisen mir dat ATF4 eng fir Premier phenotype zu gastric Kriibs Zellen jidferengem, an dësem Effet deelweis duerch transactivation vun SIRT1 overexpression mediated ass. Ausserdeem, ass ATF4 eng valabel Zilscheif vun Drogenofhängeger-resistent gastric erhéijen, an den Entwécklungslänner effikass inhibitors vun ATF4 soll an allem an der Zukunft geholl ginn. Dës Conclusiounen déi Roman Abléck an d'Roll vun ATF4 an Kontrollfunktioun SIRT1 Ausdrock an an hirer Stress-Resistenz Fonctiounen am tumorigenesis an Chimiotherapie goen. Dëst ass besonnesch wichteg fir de Medeziner allem, wéi ATF4 kann duerch Sauerstoff Entzuch, oxidative Stress, muss Entzuch a bal all déi ongewollt stressors zu engem entholl microenvironment up-regulariséiert ginn, déi duerch Kriibs Zellen distanzéiert kéint Prolifératioun inhibition an Zell Doud ze flüchten an Äntwert op Chimiotherapie goen. Dofir, op jonken Studenten Stress-entschlof ATF4 Ausdrock zu Kriibs Zellen predicated Interventiounen kann zu circumventing oder reversing Drogenofhängeger Resistenz zu gastric Kriibs effikass ginn. VerfÜgung Fir detailléierte Methoden, kuckt weg Text S1 . VerfÜgung Zell Kultur an reagents an der fir Premier Varianten, SGC7901 /ADR an SGC7901 /VCR VerfÜgung de Mënsch gastric adenocarcinoma Zell Linnen SGC7901 (vun der Academy of Military Medical Science, Peking, China kritt) (gegrënnt an an eisem Labo haten), an AGS (kritt vun der Zell Bank vun Chinese Akademie vun de Wëssenschaften, Shanghai, China) waren cultured zu RPMI-1640 mëttelfristeg ergänzt mat 10% an et Bovine serum (Hyclone) an penicillin /streptomycin. 293T Zellen (och aus der Zell Bank vun Chinese Akademie vun de Wëssenschaften kritt) huet cultured zu DMEM mat 10% An et Bovine serum ergänzt. Fir de Premier phenotype, adriamycin (mat engem Finale Konzentratioun vun 0,5 μg /ml) an vincristine (mat engem Finale Konzentratioun vun 1 μg /ml) erhalen sech fir SGC7901 /ADR zu der Kultur Medien derbäi a SGC7901 /VCR Zellen, bzw.. EX-527 (Fläch) war um uginn Konzentratioune vun DMSO opgeléist. Adriamycin (ADR), vincristine (VCR), cisplatin (CDDP), a 5-fluorouracil (5-FU) waren bei uginn Konzentratioune vun normal Salins opgeléist. VerfÜgung Zell transfection a stabil Zell Linnen VerfÜgung De Mënsch ATF4 VerfÜgung Ausdrock plasmid (pCMV5-ATF4) war Audit vun Professer Amy S. Lee [25]. Lentiviral Vecteure Zeechesaatz siRNA spezifesch ze ATF4 VerfÜgung a Kontroll siRNA mat der Benotzung vun PLKO.1-TRC generéiert goufen (Addgene) an huet als LV-siATF4 an LV-SCR Kontroll designéierte, bzw.. Lentiviral Vecteure Zeechesaatz Mënsch ATF4 Gentherapie sech zu FUW-teto (Addgene), designéierte den LV-ATF4 gebaut. Déi eidel Vecteure war den negativen Kontroll, designéierte den LV-Vecteure benotzt. Stabil Zell Strecken vun transfection vun uginn lentiviral gesond entsteet duerch Auswiel duerno zu puromycin oder zeocin (Invitrogen), bzw.. Zell transfection an Generatioun vun stabil Zell goufe benotzt Standard Prozeduren gesuergt. De Message vun der siRNA gesond kann am Text S1 fonnt ginn. VerfÜgung Immunoblotting VerfÜgung D'Kollektioun vun FAQ dovu an immunoblotting Analyse waren benotzt Standard Prozeduren gesuergt. Fir antibody Quellen, weg Text S1 gesinn. VerfÜgung Kolonie Opstellung assay VerfÜgung D'Kolonie Opstellung assay gesuergt huet, wéi virdru beschriwwen [40], mat liichte Ännerungen (Text S1). VerfÜgung Annexin V staining an FACS Analyse VerfÜgung Annexin V staining an FACS Analyse waren benotzt Standard Prozeduren gesuergt. Zellen negativ fir béid PI an Annexin V staining sech als liewen Zellen séiert, Zellen, datt fir Annexin V positive Kierchefënster nëmmen als fréi apoptotic Zellen séiert huet, an PI positiv an Annexin V positive Zellen sech Zellen spéiden Etappe vun apoptosis amgaang. VerfÜgung DNA véiermol assay VerfÜgung DNA Fragmenter sech mat der DNA Leeder Extraktioun Kit Quecksëlwer mat Spin Colonne (C0008, Beyotime Co., Peking, China) no de Protokoll d'Hiersteller. Den DNA Fragmenter benotzt gelies electrophoresis op engem 1% agarose gelies getrennt mat 0,1 μg /ml ethidium bromide. VerfÜgung Hoechst staining VerfÜgung Hoechst Staining war laut Hiersteller d'Protokoll gesuergt (C0003, Beyotime Co. ). Zellen sech mat engem DP70 ëmdréinen Immunofluorescence microscope (Olympus) visualized. Zellen mat ënnersichen an fragmentaresch Käre sech apoptotic zu Yogy. VerfÜgung An kënschtlech VerfÜgung Drogenofhängeger Empfindlechkeet assay VerfÜgung ADR, VCR, CDDP, a 5-FU all frësch preparéiert sech virun all Experimenter. Drogenofhängeger Empfindlechkeet war mat engem 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) gemooss assay laut der Norm Protokoll (Text S1). VerfÜgung Chemeschen real hut Hinnen alleguer (qPCR) VerfÜgung Chemeschen Hinnen alleguer real-Zäit Leeschtung war e LightCycler 480 II System (Roche) an SYBR Green erkennen (TaKaRa) benotzt. Message vun der primers kann am Text S1 fonnt ginn. VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation (Chip) assay VerfÜgung Chip assays laut den Hiersteller d'Protokoll gemaach goufen (P2078, Beyotime Co.) mat liicht Modifikatioune. Chromatin Léisungen sech mat Anti-ATF4 oder mat Kontroll IgG sonicated an incubated, an Nuecht op 4 ° C rotated. DNA-FAQ Kräiz-Linke sech réckgängeg an chromatin DNA war sidd an zu Hinnen alleguer Analyse ënnerworf. D'primers 5'-zu Enn CCT CGT Eenzelzäitfueren ACA TCT-3 'an 5'-Eenzelzäitfueren GGA GTC CTT CCT TTC-3 "benotzt huet déi SIRT1 VerfÜgung distal Promoteur Haaptrei (A1, nucleotides zu Meenungsfreiheet nennt -974 zu - 843), an der primers 5'-zu Enn CAA CAA zu Enn CAT TCT-3 'an 5'-CCT CCT GGG AAG zu Enn Eenzelzäitfueren-3 "benotzt huet den SIRT1 VerfÜgung proximal Promoteur Haaptrei (A2, nucleotides zu Meenungsfreiheet nennt -781 bis -647). D'primers fir GAPDH VerfÜgung, 5'-TAC Tag CGG Eenzelzäitfueren TAC GGG CG-3 'an 5'-TCG AAC AGG AGG AGC Agées Série CGA-3 ", huet als negativ Kontroll benotzt. Als positiv Kontroll fir de ATF4-DNA Interaktioun, déi primers 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC OP-3 'an 5'-CGC TTA TAC CGA CCT GGC tcc T-3 ", deen d'asparagine synthetase zu Meenungsfreiheet nennt entworf goufen ( ASNS VerfÜgung) Promoteur Regioun datt gemellt mannst zwee Siten enthält ATF4 zu kruet [41], huet och benotzt. No amplification, goufen Hinnen alleguer Produiten op engem 1,5% agarose gelies geléist a vun ethidium bromide staining visualized VerfÜgung Reporter Gentherapie assay VerfÜgung D'1.2 KB Mënsch SIRT1 VerfÜgung Promoteur Haaptrei (. - 1100 bis +100 BP) war Wierderbuch a gekloonten an der XhoI an HindIII Siten vun der pGL3-Grondakommes Vecteure. Déi doraus resultéierend bauen war vun DNA sequencing confirméiert. 293T Zellen sech dann Co-transfected mat der SIRT1 VerfÜgung Promoteur reporter plasmid, d'Praxis-TkLanguage plasmid (Promega, USA), an der pCMV5-ATF4 plasmid andems Lipofectamine2000 (Invitrogen). Véierzeg aacht Stonnen no transfection, goufen Zellen dräimol mat kal phosphate-gefiermt Salins (PBS) gewäsch. Dunn, goufen d'Zellen zu 100 μl vun Popup- Lysis Respektiv (Promega) lysed a fir 15 Minutten huelen. Liichtkäfer luciferase an Renilla luciferase Aktivitéite sech mat der Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) gemooss mat engem Varioskan Flash microplate Lieser (Thermo Wëssenschaftlech). "Relativ Aktivitéit" war wéi d'Verhältnis vun Liichtkäfer luciferase Aktivitéit definéiert luciferase Aktivitéit zu Renilla a gouf duerch Partitur der luminescence Intensitéit mat de assay fir Liichtkäfer luciferase duerch déi vun der Renilla luciferase kritt berechent. All Mesure goufen zu triplicate gesuergt, an der assays dräimol zu 293 T Zellen widderholl huet. VerfÜgung statistique Analyse VerfÜgung All Experimenter widderholl huet op d'mannst dräi Mol. All Donnéeën goufen als mengen Wäert ± S.D. presentéiert Den Ënnerscheed tëscht der bedeit huet mat Student d't Test analyséiert. All Statistik analyséiert goufen benotzt SPSS16.0 Software (Chicago, IL) gesuergt. Bedeitung war um 5% Niveau gesat. VerfÜgung Merci Mir Professer Amy S. Lee fir eis mat der pCMV5-ATF4 plasmid Audit suergt . Mir soen och dem Här Taidong Qiao an Joffere Zheng Chen fir hir exzellent technesch Assistenz. VerfÜgung
Aféierung VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Ennerstëtzung Informatiounen VerfÜgung S1 Dorënner. VerfÜgung Effekt vun mutated ATF4 bindend Siten op der Aktivitéit vun der SIRT1 Promoteur. 293T Zellen sech Co-transfected mat pCMV-ATF4 a Wëllschwäin Typ SIRT1, SIRT1-MUT1, SIRT1-MUT2, oder MUT1 + MUT2 Rapporteur, an der famill luciferase Aktivitéit sech war. D'luciferase Aktivitéit vun der mierkt pCMV-Taq Grupp war den 1.00 designéierte. D'Resultater sinn d'mengen ± S.D. vun dräi Experimenter am zweete gesuergt. *, P &Si besteet; 0,05. Déi lénks Säit ass e Sënn Representatioun vun de Rapporteur Gentherapie gesond. Déi Bar Grafike op der rietser Säit vertrieden relativ Niveau vun luciferase Aktivitéit zu jidderengen vun den transfected Echantillon VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0031431.s001 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung Text S1. VerfÜgung Zousätzlecht Material a Methoden. VerfÜgung Doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002 VerfÜgung (Intrigue) VerfÜgung
Arbeschterlidder VerfÜgung
Gewiichtsverloscht Medikament Wegovy vun der FDA guttgeheescht
DUS Food and Drug Administration (FDA) huet dWegovy (Semaglutide) Injektioun guttgeheescht (2,4 mg eemol dWoch) als eng chronesch Gewiichtmanagementbehandlung bei fettegen oder iwwergewiichtegen Erwue
Diagnos vu virale Infektiounen mat Mikro- an Nanoskala Technologien
De Besoin fir Bevëlkerungswäit, séier, sensibel, a kosteneffektiv Diagnostik ass wesentlech eropgaang als Resultat vum schwéieren akuten Otemsyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), den causative Agent vu
Oral Sex kann bakteriell Vaginose ausléisen
Eng nei Studie am Journal publizéiert PLOS Biologie huet verschidde mikrobiell Populatiounen opgedeckt déi vaginale Kolonisatioun vu Pathogenen erliichteren, déi ofwiesselnd dCharakteristike vun der
