PLoS ONE: Activeren Transcription Factor 4 Verleent een multidrug resistance fenotype aan maagkanker cellen door transactivatie van SIRT1 Expression

De abstracte

Achtergrond

multidrug resistance (MDR) bij maagkanker blijft een grote uitdaging voor klinische behandeling. Activerende transcriptiefactor 4 (ATF4) is een reactie op stress gen dat betrokken is bij de homeostase en cellulaire bescherming. Echter, de expressie en functie van ATF4 bij maagkanker MDR blijft onbekend. In deze studie onderzoeken we of ATF4 een rol spelen bij maagkanker MDR en de mogelijke mechanismen.

Methodologie /voornaamste bevindingen

We hebben aangetoond dat ATF4 overexpressie confered de MDR fenotype om maagkanker cellen, terwijl de knock-down van ATF4 in de MDR-varianten geïnduceerde re-sensibilisering. In deze studie hebben we laten zien ook dat de NAD ^{+ - afhankelijke histondeacetylase SIRT1 nodig was voor-ATF4 geïnduceerde MDR effect bij maagkanker cellen. We hebben aangetoond dat ATF4 vergemakkelijkt MDR bij maagkanker cellen door directe binding aan de SIRT1 promoter, waardoor SIRT1 opwaartse regulatie. Aanzienlijk, remming van de SIRT1
door kleine interfererende RNA (siRNA) of een specifieke remmer (EX-527) opnieuw therapeutische gevoeligheid. Ook een verhoogde Bcl-2 /Bax ratio en MDR1 expressieniveau gevonden in ATF4-overexpressie cellen.}

Conclusies /Belang

We hebben aangetoond dat ATF4 een sleutelrol in de regulatie van MDR had bij maagkanker cellen in respons op chemotherapie en deze bevindingen dat gericht ATF4 therapeutische weerstand kan verlichten maagkanker

Citation:. Zhu H, L Xia, Zhang Y, Wang H, Xu w, Hu H, et al. (2012) activeren transcriptie Factor 4 Verleent een multidrug resistance fenotype aan maagkanker cellen door transactivatie van SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10.1371 /journal.pone.0031431

Uitgever: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 5 september 2011; Aanvaard: 8 januari 2012; Gepubliceerd: 17 februari 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door gecombineerd subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NO.81090270, NO.81090273 en NO.81000864), de Chinese Postdoctoraal Science Foundation (NO.20100471776), de Nationale Sleutel en Basic Research Development Program van China ( NO. 2010CB529302) en de National Science and Technology Project (2009ZX09103-667 en 2009ZX09301-009-RC06). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

multidrug resistance is meestal de belangrijkste oorzaak voor het falen van chemotherapie tegen kwaadaardige tumoren, met inbegrip van maagkanker [1] .De termijn weerstand multidrug is klassiek gebruikt om een ​​weerstand fenotype waar de cellen resistent worden gelijktijdig verschillende geneesmiddelen zonder te definiëren duidelijke structurele gelijkenis met andere cellulaire doelwitten [2]. MDR komt vaker met nieuwe geneesmiddelen die meer significant effectiviteit na hun eerste toepassing in de behandeling van kanker te hebben. De klinische bruikbaarheid van meerdere geneesmiddelen wordt beperkt door zowel natuurlijke en verworven tumorcel resistentie, die bijna altijd multifactorieel in [3] natuur. De factoren die geneesmiddelgevoeligheid kunnen beïnvloeden omvatten: versnelde medicijn efflux, drug activering en inactivering, veranderingen in de drug target DNA methylatie, verwerking door drugs geïnduceerde schade en ontwijken van apoptose [4]

maagkanker. relatief ongevoelig voor chemotherapeutica. De MDR mechanismen maagkanker cellen zijn algemeen onderzocht in ons laboratorium en elders [1], [4], [5], maar ze zijn niet volledig opgehelderd, wat aangeeft dat andere onbekende moleculen of wegen betrokken kan zijn bij de ontwikkeling van MDR.

in zoogdiercellen, eukaryotische translatie-initiatie factor 2 α subeenheid (eIF2α) wordt gefosforyleerd door verschillende kinasen eIF2α in reactie op verschillende stress-signalen, zoals anoxie /hypoxie, endoplasmatisch reticulum stress aminozuur ontbering en oxidatieve spanning. Deze fosforylering gebeurtenis leidt tot een snelle daling in de wereldwijde eiwit biosynthese gelijktijdig met inductie van translationeel expressie van genen, met inbegrip van ATF4
die functioneren om cellulaire schade van stress te verlichten [6], [7]. Hoewel ATF4 een pro-apoptotische rol onder omstandigheden van ernstige of langdurige stress kan spelen, ATF4
is een krachtige stress responsieve gen gedacht aan een beschermende rol spelen bij het reguleren van cellulaire aanpassing aan de ongunstige omstandigheden in de geïntegreerde stressrespons ( ISR) [8], [9], [10]. Recentelijk overexpressie van ATF4 werd gemeld prominent in diverse tumoren en tumorcellen tegen meerdere spanningen, alsmede diverse kanker therapeutische middelen [11] beschermen, [12], [13], [14], [15], [16], [17]. De mogelijke mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze bescherming onder autofagie inductie, de bevordering van DNA-schade herstel, en up-regulatie van de intracellulaire glutathion [12], [13], [14], [17]. Echter, de expressie en functie van ATF4 bij maagkanker MDR blijft onbekend.

In deze studie hebben we gemeld dat ATF4 was significant up-gereguleerd in de MDR reactie van maagkanker cellen in vergelijking met ouderlijk toezicht cellen. Knockdown van ATF4
door siRNA aanzienlijk gesensibiliseerde cellen met MDR van verschillende chemotherapeutische middelen, terwijl up-regulatie van ATF4 in SGC7901 en AGS cellen rendered ze multiresistente. We toonden ook aan dat ATF4 gepromoot maagkanker MDR deels door up-reguleren van expressie van SIRT1. En SIRT1 remming zou gedeeltelijk omkeren van de maagkanker MDR fenotype gemedieerd door ATF4. Deze gegevens suggereren dat gericht ATF4 kan een nieuwe therapeutische optie voor het omkeren van de klinische maagkanker bieden MDR.

Resultaten

ATF4 moduleert de MDR fenotype van maagkanker cellen

Om te bepalen of ATF4 is betrokken bij de ontwikkeling van MDR bij maagkanker cellen werden ATF4 niveaus gedetecteerd door Western blot en qPCR in de SGC7901 cellijn en de MDR-varianten SGC7901 /VCR en SGC7901 /ADR. Zowel eiwit- en mRNA-niveaus van ATF4 waren in de resistente cellijnen veel hoger dan in de ouderlijke cellen (Fig. 1A).

Om te onderzoeken of ATF4 overexpressie is voldoende om een ​​MDR fenotype bij maagkanker induceren, ATF4
cDNA expressie werd stabiel getransfecteerd in SGC7901 en AGS-cellen. Eerst werd CDDP gevoeligheid getest met een kolonievorming assay. Zoals blijkt uit de kwantificering van de kolonievorming assay ATF4 overexpressie resulteerde in een bijna 3-voudige toename in aantallen kolonie vergeleken met lege-vector tot expressie brengende cellen (Fig. 1B). MTT assays aangegeven dat de IC _{50 waarden van SGC7901-ATF4 ADR, VCR, CDDP, en 5-FU significant verhoogd in vergelijking met lege vector getransfecteerde cellen (Fig. 1D).}

Al ATF4 niveaus worden verhoogd in MDR maagkanker cellen, we verder wilden bepalen of richten ATF4 kunnen opnieuw gevoelig MDR cellijnen. Knockdown van ATF4
van siRNA ter SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR cellen tot een 2- tot 3-voudige vermindering in celaantal bij gebruik in combinatie met CDDP (Fig. 1C). Gegevens in Fig. 1E suggereren dat neerwaartse regulatie van ATF4
aanzienlijk keert de weerstand van SGC7901 /ADR-cellen als reactie op chemotherapie.

Al remming van apoptose een belangrijke mechanismen van MDR, we eveneens onderzocht de capaciteit van de SGC7901 /ADR-cellen die met de specifieke ATF4
siRNA aan CDDP-geïnduceerde apoptose door Hoechst kleuring en DNA fragmentatie assays. Behandeling van SGC7901-ATF4 en SGC7901 /ADR-SCR cellen met de aangegeven concentraties van CDDP gedurende 36 uur heeft geen apoptose induceert, zoals bepaald door Hoechst nucleaire kleuring (Fig. 1F) en DNA fragmentatie assays (fig. 1G). In tegenstelling getoond SGC7901-Vector en SGC7901 /ADR-siATF4 cellen significant apoptose, met de meer frequente verschijning van gecondenseerde en gefragmenteerde kernen en de vorming van DNA ladder. Bovendien duidelijker splitsing van procaspase-3 werd waargenomen na behandeling met CDDP in SGC7901-vector en SGC7901 /ADR-siATF4 cellen in vergelijking met SGC7901-ATF4 en SGC7901 /ADR-SCR-cellen (Fig. 1H).

Samengenomen geven deze resultaten aan dat ATF4 verleent een MDR fenotype maagkanker cellen en die gericht ATF4 een werkwijze voor het sensibiliseren resistente cellen tegen chemische behandelingen.

ATF4 omhoog-reguleert de expressie van SIRT1, MDR1 , Bcl-2 en Bax bij maagkanker cellen

Eerdere studies hebben gemeld dat overexpressie SIRT1 weergegeven verminderde gevoeligheid voor chemotherapie door meerdere mechanismen [18], [19], [20], [21]. We vroegen zich bepalen of SIRT1
, dat een stress-gen essentieel voor MDR ontwikkeling, kan de stroomafwaartse doelstelling ATF4 verantwoordelijk voor het mediëren-ATF4 geïnduceerde MDR bij maagkanker cellen.

SIRT1 niveaus in LV-Vector en LV-ATF4 stabiel getransfecteerde SGC7901 cellen werden getest door qPCR en Western blot. De overexpressie van ATF4 werd geassocieerd met verhoogde expressie SIRT1 zowel de transcriptie (Fig. 2A, links) en translationele niveau (fig. 2B, links). In tegenstelling siRNA knock-down van de ATF4
in SGC7901 /ADR-cellen resulteerde in een significante vermindering van de endogene SIRT1
expressie (Fig. 2A en 2B, rechts). Deze resultaten suggereren dat ATF4 up-regelt SIRT1
expressie bij maagkanker cellen.

Om verder onderzoek naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ATF4 gerelateerde MDR van maagkanker, hebben we ook onderzocht MDR1, MRP, Bcl-2 en Bax expressieniveaus in de maag kankercellen hierboven gebruikt. Zoals getoond in Fig. 2B, ATF4-bekwame cellen brachten meer MDR1 in vergelijking met de controlecellen. Ondertussen, geen duidelijke verschil in MRP expressie werd gevonden in elk van deze cellijnen. Interessant is dat zowel Bcl-2 en Bax expressieniveaus waren opgereguleerd in ATF4-bekwame cellen, vergeleken met de controlegroep cellijnen, terwijl de expressie van Bax bleek slechts geringe wijzigingen, waaruit blijkt dat een up-regulatie van Bcl-2 tot Bax verhouding kan de geneesmiddel-geïnduceerde apoptose in ATF4 overexpressie maagkanker cellen onderdrukken.

de resultaten geven aan dat ATF4 bevordert MDR vermogen van maagkanker cellen via meerdere mechanismen.

ATF4 transactiveert SIRT1 promotoractiviteit en direct bindt aan de SIRT1 promotor

om te bepalen of ATF4 bemiddelt SIRT1
gentranscriptie, 293T-cellen werden gecotransfecteerd met de 1,2 kb SIRT1
promotor reporter plasmide en de ATF4
expressieplasmide. De luciferase reporter assay bleek dat de SIRT1
promotoractiviteit werd sterk geactiveerd door ATF4 op een dosis-afhankelijke manier (Fig. 3A).

In een poging om specifieke inzicht in de mechanismen van krijgen SIRT1
inductie, onderzochten we de mogelijke inductie paden van ATF4. Door het analyseren van de 5'-flankerende sequentie van de SIRT1
gen met bioinformatica software (Tfsitescan service, TESS en Genomatix), twee ATF4 vermoedelijke bindingsplaatsen werden geïdentificeerd binnen de -950 tot -600 bp gebied van het SIRT1
promoter (Fig. 3B).

Om te bepalen of SIRT1
is een directe doelwit van ATF4, chip met de ATF4 antilichaam met behulp van SGC7901-ATF4 cellen toonde verrijking van beide bindingsplaatsen binnen de SIRT1
promotor gebied, wat aangeeft dat het RNA en de daaropvolgende eiwit stijgt van SIRT1
in-ATF4 tot expressie cellijnen zijn waarschijnlijk te wijten aan een directe interactie van ATF4 met de SIRT1
genpromotor (fig. 3C).

de rol van de twee ATF4 bindingsplaatsen bij de regulering SIRT1 transactivatie onderzoeken, werd plaatsgerichte mutagenese gebruikt om deze sites muteren. Luciferase reporter test toonde aan dat ofwel het muteren van de bindingsplaats 1 of bindingsplaats 2 verminderde de SIRT1 promoter activiteit geïnduceerd door ATF4. Bovendien mutatie van beide bindingsplaatsen schafte de SIRT1 promoter activiteit. Deze resultaten suggereren dat beide ATF4 bindingsplaatsen betrokken zijn bij de transactivatie van SIRT1 promoter (Fig. S1).

Samengenomen geven deze resultaten aan dat SIRT1 een directe transcriptionele doel van ATF4.

SIRT1
remming door siRNA deels keert de MDR fenotype van-ATF4 overexpressie maagkanker cellen

de identificatie van ATF4 gemedieerde SIRT1
expressie niveau stijgt bij maagkanker cellen, gevraagd ons om te analyseren van de rol van deze route bij maagkanker MDR. Om dit aan te pakken, vergeleken we de In vitro
drug gevoeligheid in ATF4 stabiel getransfecteerde maagkanker cellen na transfectie van SIRT1
siRNA of roerei siRNA door kolonievorming en MTT assays. Knockdown van SIRT1
van siRNA in SGC7901 ATF4-cellen bracht > 40% reductie van kolonieaantal bij gebruik in combinatie met CDDP (fig. 4A, boven). Dit effect werd ook waargenomen in AGS-ATF4 cellen (Fig. 4A, lager). Bovendien zijn gegevens van de MTT-bepaling ook aangegeven dat knockdown van SIRT1
kunnen opnieuw gevoelig SGC7901-ATF4 cellen aan chemische middelen, maar dit gebeurde niet in scrambled siRNA getransfecteerde cellen (Fig. 4B).

Om te bepalen of SIRT1 beschermt de cellen tegen CDDP-geïnduceerde apoptose, SGC7901-ATF4 cellen die met SIRT1
siRNA of roerei siRNA werden behandeld met CDDP en gelabeld met Annexine V en PI. De apoptotische cellen werden geïdentificeerd door Annexine V labeling. Het percentage apoptotische SIRT1 siRNA getransfecteerde SGC7901 ATF4-cellen was significant hoger dan die van de controlecellen (Fig. 5A, 72,8% vs. 25,9%). Het uiterlijk van gecondenseerde en gefragmenteerde kernen was eveneens verhoogd in SIRT1 siRNA getransfecteerde cellen vergeleken met de controle cellen (Fig. 5B). Bovendien splitsing van procaspase-3 werd reeds na 12 uur na behandeling met 10 ug /ml CDDP in SIRT1 siRNA getransfecteerde SGC7901-ATF4 cellen, maar niet in scrambled siRNA behandelde cellen, zelfs na 24 uur CDDP behandeld (Fig. 5C ). Deze resultaten suggereren dat SIRT1 overexpressie onderdrukt CDDP-geïnduceerde apoptose.

Om het effect van neerwaartse regulatie van SIRT1 door siRNA over MDR geassocieerde moleculen te bestuderen, onderzochten wij MDR1, MRP, Bcl-2 en Bax expressieniveaus in SGC7901-ATF4 cellen na transfectie met SIRT1 siRNA of roerei siRNA. Neerwaartse regulatie van MDR1 werd waargenomen in de SIRT1 siRNA behandelde cellen (Fig. 5D) in vergelijking met de controlecellen. In tegenstelling, geen duidelijke verschil MRP, Bcl-2 en Bax expressieniveaus werden gevonden tussen de monsters.

Deze waarnemingen geven aan dat SIRT1 bemiddelt de ATF4 geïnduceerde MDR effect bij maagkanker cellen.

Remming van SIRT1 activiteit opnieuw sensibiliseert ATF4 getransfecteerde cellen aan DNA-beschadigende agenten

om bewijs te leveren dat SIRT1 katalytische activiteit is ook verantwoordelijk voor de ATF4 geïnduceerde MDR, SGC7901-ATF4 cellen werden voorbehandeld met EX-527 een nieuwe, krachtige en specifieke kleine molecule inhibitor van SIRT1, gevolgd door behandeling met verschillende chemische middelen. In de eerste plaats hebben we de basale cytotoxiciteit van EX-527 in LV-Vector en LV-ATF4 stabiel getransfecteerde SGC7901 cellen. De MTT-test bleek dat EX-527 bij concentraties tot 10 uM remden, maar licht verhoogd, de levensvatbaarheid van beide cellijnen (Fig. 6A). Vervolgens onderzochten we SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2 en Bax expressieniveaus na 24 uur incubatie met of zonder de aangegeven doseringen van EX-527 in de gastrische kankercellen hierboven gebruikt. Alleen de expressie van MDR1 werden neergereguleerd door EX-527 in een concentratie-afhankelijke manier (Fig. 6B). Toen we gepreïncubeerd SGC7901 ATF4-cellen met drager of EX-527 (0,5, 1, 2, 4, en 10 uM) gedurende 24 uur en vervolgens CDDP- en 5-FU-gemedieerde celdood werd gevolgd. Zoals getoond in Fig. 6C, EX-527 aanzienlijk verbeterd de cytotoxiciteit van beide geneesmiddelen in een dosis-afhankelijke wijze. Ook bepaalden de mogelijke synergistische effect van EX-527 op verschillende doses CDDP- en 5-FU-geïnduceerde remming van celproliferatie in SGC7901 ATF4-cellen. Zoals verwacht, 10 uM EX-527 is voldoende om de cytotoxiciteit van beide geneesmiddelen (Fig. 6D) versterken.

Deze resultaten suggereren dat SIRT1 activiteit speelt ook een cruciale rol in de ATF4 geïnduceerde maagkanker MDR en deze rol zou kunnen deels worden bemiddeld door MDR1 expressie.

Discussie

MDR stelt significante klinische uitdagingen voor de effectieve chemotherapie van vele menselijke maligniteiten. De mechanismen waardoor cellen verwerven resistentie vormen zeer complex, dus uitgebreider begrip ervan, en de identificatie van nieuwe mechanismen chemoresistance zal bijzonder nuttig betere therapeutische opties. Deze studie is het eerste verslag dat hoge niveaus van ATF4, vaak gezien in tumorcellen onder stressvolle omstandigheden, verleent maagkanker cellen met een MDR fenotype en beschrijft dat dit effect wordt gemedieerd deels door transactivatie van SIRT1-expressie.

ATF4 Kopen en SIRT1 Wat zijn evolutionair geconserveerd stress respons genen die betrokken zijn in een breed spectrum van biologische processen, waarvan er vele heilzaam voor homeostase en cellulaire bescherming [22], [23], [ ,,,0],24]. Beide genen worden geïnduceerd als reactie op verschillende spanningen, waaronder zuurstoftekort (hypoxie /anoxie), oxidatieve stress, DNA schade, voeding ontbering en chemotoxische belasting. Levenson VV et al.
Eerst gemeld dat veranderingen in expressie van ATF4 een rol in de pleiotrope weerstand zou kunnen spelen verschillende klassen van DNA-targeting middelen [16]. De laatste jaren hebben verscheidene studies bleek dat ATF4 rechtstreeks of onrechtstreeks was betrokken bij de ontwikkeling van resistentie door middel autophagy, het glutathion-afhankelijke redox systeem en DNA schade herstel [11], [12], [13], [14] [15], [16], [17], [25], [26]. Hier laten we zien dat het beschermende vermogen van ATF4 inderdaad bemiddelt een MDR fenotype in ATF4 tot overexpressie maagkanker cellijnen in reactie op chemotherapie. Onze bevindingen tonen duidelijk aan dat overexpressie van ATF4 bij maagkanker cellen werd geassocieerd met meer weerstand, terwijl het neerhalen van ATF4 geïnduceerde re-sensibilisering. Deze gegevens suggereren dat ATF4 is waarschijnlijk een belangrijke stroomafwaartse mediator van resistentie veroorzaakt door meerdere mechanismen en is een waardevol therapeutisch doel. Maar één van de belangrijkste transcriptionele mediatoren van de ISR die een verscheidenheid van target genen die herstel van de homeostase bevorderen activeert ATF4 ook weerstand bemiddelen door andere mechanismen. In onze studie was SIRT1 gevonden dat opwaarts gereguleerd in-ATF4 overexpressie cellen vergeleken met vector getransfecteerde cellen. In contrast, knock-down van de ATF4 hotels met ATF4 specifieke siRNA geleid tot een down-regulatie van SIRT1 in MDR maagkanker cellen. Onze resultaten suggereren dat SIRT1 een stroomafwaartse mediator van ATF4 geïnduceerde MDR maagkanker kan zijn.

Als lid van de subfamilie van de ATF basische gebied leucine-rits (bZIP) transcriptiefactoren [22], ATF4 heeft dienst kunnen doen als ofwel een transcriptionele activator of repressor transcriptie via ATF of cAMP responsief element (CRE) bindingsplaatsen [22]. De consensus bindingsplaats voor ATF werd gedefinieerd als TGACGT (C /A) (G /A) [27], dat een sequentie identiek is aan de CRE consensus element (TGACGTCA) [28]. Ook de sterk geconserveerde kern motief - ACGT - kan in de meeste cres [29] binden aan verschillende bZIP factoren, afhankelijk van de flankerende basen van de kern motief [22], [30], [31]. In onze studie werden twee vermeende ATF-CRE-bindende plaatsen in de 1,2 kb SIRT1
promoter regio en ATF4 direct geactiveerd SIRT1
transcriptie via binding aan beide bindende elementen. Echter, hoe de twee bindingsplaatsen spelen hun rol in het kader van gedetailleerde spanning omstandigheden blijft onbekend en vergt nader onderzoek.

Mammalian SIRT1
ligt het dichtst homoloog van de gist Sir2 Kopen en het meest uitgebreid bestudeerd SIRT familielid. Het is sterk betrokken bij de regulering van cellulaire processen die levensduur, waaronder anti-apoptose, neuronale bescherming en cellulaire senescentie of veroudering [32] bepalen. Onlangs hebben een toenemend aantal studies Betrokken verhoogde expressie van SIRT1 met resistentie tegen chemotherapie en ioniserende straling [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Zo is SIRT1 overexpressie gevonden in resistente neuroblastoom, osteosarcoom, borstklier, eierstokkanker, prostaatkanker, colonkanker en longkanker cellijnen in vergelijking met hun geneesmiddel- gevoelige tegenhangers. Al deze geneesmiddelen resistente effecten van SIRT1 zou kunnen te wijten zijn aan het anti-apoptotische effect [37], [38] en onderdrukking van tumorsuppressorgenen [39]. Tenslotte zouden wij voorspellen dat, indien SIRT1 is betrokken bij de ATF4 geïnduceerde MDR remming van SIRT1 moet de gevoeligheid van ATF4 overexpressie cellen beïnvloeden in respons op chemotherapie. Zoals verwacht, zowel siRNA en farmacologische remming van SIRT1 konden re-gevoelig-ATF4 overexpressie cellen om chemische drugs. Bovendien, onze studie blijkt dat SIRT1 beschermt de cellen tegen dood gedeeltelijk via een anti-apoptotisch effect.

Vermeld is dat MDR1 werd up-gereguleerd in cellen met verhoogde expressie SIRT1 [18], [36]. In deze studie hebben we aangetoond dat MDR1 is up-gereguleerd in-ATF4 overexpressie cellen en knock-down van SIRT1 met SIRT1 specifieke siRNA of remmen van de activiteit met EX-527 kan leiden tot down-regulatie van MDR1, die in overeenstemming is met een drug resistente rol van SIRT1. De Bcl-2 /Bax ratio was opwaarts gereguleerd in de ATF4 overexpressie cellen was SIRT1-onafhankelijk, wat suggereert dat SIRT1-onafhankelijke mechanismen een rol bij de ATF4 geïnduceerde MDR bij maagkanker cellen spelen.

Samenvattend tonen we aan dat ATF4 verleent een MDR fenotype maagkanker cellen en dit effect wordt gedeeltelijk gemedieerd door transactivatie van SIRT1 overexpressie. Bovendien ATF4 een geldige doelwit resistente maag tumoren en ontwikkelen van effectieve remmers van ATF4 moet rekening worden gehouden in de toekomst. Deze bevindingen verschaffen nieuwe inzichten in de rol van ATF4 bij het regelen SIRT1 expressie en in zijn stressbestendigheid functies in tumorigenese en chemotherapie. Dit is vooral belangrijk voor klinische overweging, zoals ATF4 up-gereguleerd door zuurstoftekort, oxidatieve stress, voeding ontbering en bijna alle negatieve stressoren in een tumor micro-omgeving die door kankercellen kunnen worden gekaapt proliferatie remmen en celdood omzeilen wijze kunnen zorgen respons op chemotherapie. Daarom mogen de activiteiten stoelt op het verstoren van stress-geïnduceerde ATF4 expressie in kankercellen effectief bij het omzeilen of omkeren van resistentie tegen geneesmiddelen in maagkanker zijn.

Materialen en methoden

Voor gedetailleerde methoden, zie Tekst S1 .

Cell cultuur en reagentia

de menselijke adenocarcinoom cellijnen SGC7901 (verkregen uit de Academie van Militaire Medische Wetenschappen, Beijing, China) en de MDR-varianten, SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR (opgericht en onderhouden in ons laboratorium) en AGS (verkregen uit de cel bank van de Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China) werden gekweekt in RPMI-1640-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (Hyclone) en penicilline /streptomycine. 293T cellen (ook verkregen van de celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen) werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum. Het MDR fenotype, adriamycine (met een eindconcentratie van 0,5 ug /ml) en vincristine (een eindconcentratie van 1 ug /ml) behouden werden toegevoegd aan de kweekmedia voor SGC7901 /ADR SGC7901 /VCR cellen. EX-527 (Sigma) werd opgelost in DMSO in de aangegeven concentraties. Adriamycine (ADR), vincristine (VCR), cisplatine (CDDP) en 5-fluorouracil (5-FU) werden opgelost in normale zoutoplossing bij aangegeven concentraties.

Celtransfectie en stabiele cellijnen

De menselijke ATF4
expressieplasmide (pCMV5-ATF4) werd vriendelijk verschaft door Professor Amy S. Lee [25]. Lentivirale vector codeert siRNA specifiek ATF4 Kopen en controle siRNA werden gegenereerd met behulp van PLKO.1-TRC (Addgene) en werden aangeduid als LV-siATF4 en LV-SCR control, respectievelijk. Lentivirale vector dat codeert voor humaan ATF4 gen werden geconstrueerd in FUW-teto (Addgene), aangeduid als LV-ATF4. De lege vector werd gebruikt als negatieve controle, aangeduid als LV-vector. Stabiele cellijnen werden gegenereerd door transfectie van aangegeven lentivirale constructen gevolgd door selectie in puromycine of zeocine (Invitrogen), respectievelijk. Celtransfectie en genereren van stabiele cellijnen werden uitgevoerd met behulp van standaardprocedures. De sequenties van de siRNA constructen kunnen worden gevonden in de tekst De S1.

Immunoblottingtest

De collectie van eiwit extracten en immunoblotting analyse werden uitgevoerd met behulp van standaard procedures. Voor antilichaam bronnen, zie Tekst S1.

Kolonie vorming assay

De kolonie formatie test werd uitgevoerd, zoals eerder beschreven [40], met lichte wijzigingen (tekst S1).

Annexine V kleuring en FACS analyse

Annexine V kleuring en FACS-analyse werd uitgevoerd met behulp van standaardprocedures. Cellen negatief voor zowel PI en annexine V-kleuring werden geclassificeerd als levende cellen, cellen die positief gekleurd voor Annexine V alleen werden geclassificeerd als vroege apoptotische cellen en PI positieve en Annexine V positieve cellen waren cellen ondergaan late stadia van apoptose.

DNA fragmentatie assay

DNA-fragmenten werden met de DNA Ladder Extraction Kit met Spin Column (C0008, Beyotime Co., Beijing, China) volgens het protocol van de fabrikant. De DNA fragmenten werden gescheiden onder toepassing van gelelektroforese op een 1% agarosegel bevattende 0,1 ug /ml ethidiumbromide.

Hoechst kleuring

Hoechst kleuring werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant (C0003, Beyotime Co. ). De cellen werden gevisualiseerd met een DP70 omkeren Immunofluorescentie microscoop (Olympus). Cellen met gecondenseerd en gefragmenteerde kernen werden beoordeeld apoptotische te zijn.

In vitro
drug gevoeligheid assay

ADR, videorecorder, CDDP, en 5-FU waren allemaal vers bereid voor elk experiment. Geneesmiddelgevoeligheid werd gemeten met een 3- (4,5- dimethyl-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT) bepaling volgens het standaardprotocol (Text S1).

Kwantitatieve real -tijd PCR (qPCR)

Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met een LightCycler 480 II-systeem (Roche) en SYBR Green detectie (TaKaRa). Sequenties van de primers zijn te vinden in de tekst De S1.

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assay

ChIP assays werden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant (P2078, Beyotime Co.) met lichte wijzigingen. Chromatine oplossingen werden gesonificeerd en geïncubeerd met anti-ATF4 of controle IgG en overnacht geroteerd bij 4 ° C. DNA-eiwit verknopingen omgedraaid en chromatine DNA werd gezuiverd en onderworpen aan PCR-analyse. De primers 5'-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3 'en 5'-TTT GGA CTT GTC CCT TTC-3' werden gebruikt om de SIRT1
distale promotersequentie amplificeren (A1, nucleotiden -974 tot - 843), en de primers 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'en 5'-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3' werden gebruikt om de SIRT1
proximale promotorsequentie (A2 amplificeren, nucleotiden -781 tot -647). De primers voor GAPDH
, 5'-TAG CGG TAC TAC TTT GGG CG-3 'en 5'-AAC TCG AGG AGG AGC AGA GAG CGA-3' werden gebruikt als negatieve controle. Als een positieve controle voor de ATF4 DNA-interactie de primers 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3 'en 5'-CGC TTA TAC CGA CCT GGC TCC T-3', die zijn ontworpen om het asparagine synthetase amplificeren ( ASNS
) promotor gebied dat ten minste twee locaties gemeld ATF4 binden bevat [41], werden ook gebruikt. Na amplificatie werden de PCR-producten gescheiden op een 1,5% agarosegel en zichtbaar gemaakt door ethidiumbromidekleuring

Reporter gen assay

De 1,2 kb menselijke SIRT1
promotersequentie (. - 1100-100 bp) werd gesynthetiseerd en gekloneerd in de XhoI en HindIII-plaatsen van pGL3-Basic vector. Het resulterende construct werd bevestigd door DNA sequentiebepaling. 293T cellen werden daarna gecotransfecteerd met SIRT1
promotor reporterplasmide, de pRL-TK-plasmide (Promega, USA) en de pCMV5-ATF4 plasmide met Lipofectamine2000 (Invitrogen). Achtenveertig uur na transfectie werden de cellen driemaal gewassen met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Vervolgens werden de cellen gelyseerd in 100 pl Passive Lysis Buffer (Promega) en 15 minuten geschud. Vuurvliegluciferase en Renilla luciferase activiteiten werden gemeten met behulp van de Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) met een Varioskan Flash microplaat reader (Thermo Scientific). "Relatieve activiteit" is gedefinieerd als de verhouding van vuurvlieg luciferase activiteit Renilla luciferaseactiviteit en werd berekend door de luminescentie-intensiteit verkregen met de bepaling voor vuurvlieg luciferase door die van de Renilla luciferase. Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd, en de testen werden driemaal herhaald in 293 T-cellen.

Statistische analyse

Elk experiment werd ten minste driemaal herhaald. Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde waarde ± S.D. Het verschil tussen de gemiddelden werd geanalyseerd met Student's t-test. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp SPSS16.0 software (Chicago, IL). Significantie werd vastgesteld op het 5% -niveau.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Effect van gemuteerde ATF4 bindingsplaatsen op de activiteit van de promoter SIRT1. 293T-cellen werden co-getransfecteerd met pCMV-ATF4 en wildtype SIRT1, SIRT1-Mut1, SIRT1-Mut2 of Mut1 + Mut2 reporter, en de relatieve luciferaseactiviteit werd bepaald. De luciferase activiteit van de mock pCMV-Taq groep werd aangeduid als 1,00. De resultaten zijn het gemiddelde ± S.D. van drie experimenten uitgevoerd in tweevoud. *, P < 0,05. De linkerzijde is een schematische weergave van het reportergen constructen. De grafieken aan de rechterkant vertegenwoordigen de relatieve niveaus van luciferase-activiteit in elk van de getransfecteerde monsters
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
tekst S1.
aanvullend materiaal en methoden.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC)

Dankwoord

Wij danken Professor Amy S. Lee voor vriendelijk ons ​​met de pCMV5-ATF4 plasmide . We danken ook Mr. Taidong Qiao en mevrouw Zheng Chen voor hun uitstekende technische bijstand.

• PLoS ONE: genetische gevoeligheid op CagA-interagerende moleculen en Gen-omgeving interactie met Fyto-oestrogenen: een mogelijke risicofactor voor Gastric Cancer
• PLoS ONE: S100A6 Eiwit regelt Negatief CacyBP /SIP-gemedieerde remming van Gastric Cancer Cell proliferatie en Tumorigenesis