PLoS ONE: Activating Transcription Factor 4 koituu Moniresistenssi resistenssifenotyyppi syöpään Cells kautta transaktivaation SIRT1 Expression

tiivistelmä

Background

moniresistenssin (MDR) mahasyövän on merkittävä haaste kliiniseen hoitoon. Aktivoiva transkriptiotekijä 4 (ATF4) on stressivastetta geeni osallistuu homeostaasin ja solujen suojaus. Ilmaisulla ja toiminta ATF4 mahasyövän MDR edelleen tuntematon. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko ATF4 osansa mahasyövän MDR ja sen mahdollisia mekanismeja.

Menetelmät /Principal Havainnot

osoittaneet, että ATF4 yliekspressio confered MDR fenotyyppi mahalaukun syöpäsoluja, kun taas knockdovvn ATF4 että MDR-variantit aiheuttama uudelleen herkistymisen. Tässä tutkimuksessa ilmeni myös, että NAD ^{+ - riippuvaista histonideasetylaasi SIRT1 vaadittiin ATF4 aiheuttama MDR vaikutus mahalaukun syöpäsoluja. Olemme osoittaneet, että ATF4 helpottanut MDR mahasyövän soluissa suoraan sitoutumalla SIRT1 promoottori, jolloin SIRT1 säätelyä ylöspäin. Merkittävää on, esto SIRT1
by Sirna (siRNA) tai spesifinen estäjä (EX-527) uudelleen terapeuttisia herkkyys. Myös lisääntynyt Bcl-2 /Bax suhteen ja MDR1 ekspressiotaso havaittiin ATF4 yli-ilmentäviä soluja.}

Johtopäätökset /merkitys

Osoitimme, että ATF4 oli avainasemassa säätelyssä MDR mahalaukun syöpäsolujen vastauksena kemoterapiaa ja nämä löydökset viittaavat siihen, että kohdistaminen ATF4 voisi helpottaa terapeuttista vastustusta mahasyövässä.

Citation: Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W Hu H, et al. (2012) aktivoiva transkriptiotekijä 4 koituu Moniresistenssi resistenssifenotyyppi syöpään Cells kautta transaktivaation SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 syyskuu 2011; Hyväksytty: 8. tammikuuta 2012 Julkaistu: 17 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat yhdistettiin avustuksia National Natural Science Foundation of China (NO.81090270, NO.81090273, ja NO.81000864), Kiinan Postdoctoral Science Foundation (NO.20100471776), National Key ja Basic Research Development Program of China ( NO. 2010CB529302), ja National Municipal Science and Technology Project (2009ZX09103-667 ja 2009ZX09301-009-RC06). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

monilääkeaineresistenssin on yleensä tärkein syy epäonnistumiseen kemoterapiaa vastaan ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien mahasyöpä [1] kantavassa termi monilääkeresistenssiä klassisesti käytetään määrittelemään resistenssifenotyyppi jossa solut tulevat vastustuskykyisiksi samanaikaisesti eri lääkkeitä ilman ilmeinen rakenteellinen samankaltaisuus ja eri solukohteita [2]. MDR esiintyy useammin uusia lääkkeitä, jotka ovat merkittävämpiä tehokkuus jälkeen ensimmäisen hakemuksen syövän hoidossa. Kliininen hyödyllisyys useiden lääkkeiden rajoittavat sekä luonnolliset ja hankittu kasvainsolujen vastustuskyky, joka lähes aina on monitekijäinen luonteeltaan [3]. Tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa lääkkeen herkkyys ovat: nopeutettu lääkevuoto-, huumeiden aktivaatio ja inaktivaatio, muutoksia lääkkeen kohde, DNA: n metylaatio, käsittelyä lääkkeen aiheuttamista vahingoista, ja kiertäminen apoptoosin [4].

Mahasyöpää on suhteellisen epäherkkä kemoterapeuttisia aineita. MDR mekanismit mahasyövässä soluja on laajasti tutkittu laboratoriossamme ja muualla [1], [4], [5], mutta niitä ei ole täysin selvitetty, mikä osoittaa, että muut tuntemattomia molekyylejä tai reittejä voi olla mukana kehittämässä MDR.

nisäkässoluissa, eukaryoottisia translaation aloituksen tekijä 2 α-alayksikön (eIF2α) fosforyloituu eri eIF2α kinaasien vastauksena eri stressin merkkejä, mukaan lukien anoksian /hypoksia, endoplasmakalvostoon stressi, aminohappo puutetta, ja oksidatiivisen stressi. Tämä fosforylaatio tapahtuma johtaa nopeaan laskuun globaalissa proteiinibiosynteesin samanaikainen kanssa induktion translaation geenien ilmentymisen, kuten ATF4
jotka toimivat lieventämiseksi soluvauriot stressistä [6], [7]. Vaikka ATF4 voi olla pro-apoptoottisia rooli olosuhteissa vaikea tai pitkäaikainen stressi, ATF4
on voimakas stressi reagoiva geenin ajatellaan olla suojaava tehtävä säätämällä solujen sopeutuminen epäsuotuisten olosuhteiden integroituun stressivaste ( ISR) [8], [9], [10]. Äskettäin yliekspressio ATF4 raportoitiin olevan merkittävä monenlaisia ​​kasvaimia ja suojella kasvainsoluihin vastaan ​​kovan paineen alaisena, sekä erilaisia ​​syöpää terapeuttisten aineiden [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Mahdollinen mekanismit vastuussa tästä suojaustavoista autophagy induktio, edistäminen DNA-vaurion korjaamiseen, ja ylös-säätely solunsisäisen glutationin [12], [13], [14], [17]. Ilmaisulla ja toiminta ATF4 mahasyövän MDR edelleen tuntematon.

Tässä tutkimuksessa raportoimme että ATF4 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin MDR vasteen mahasyövän solujen verrattuna lapsilukko soluihin. Knockdovvn ATF4
siRNA merkittävästi herkistyneet solut MDR erilaisia ​​kemoterapia-aineiden, kun taas säätely ylöspäin ATF4 vuonna SGC7901 ja AGS solut tehnyt niistä monilääkeresistenttejä. Osoitimme myös, että ATF4 edistetään mahasyövän MDR osittain ylös säätelevä ilmentymä SIRT1. Ja SIRT1 esto voisi osittain kumota mahasyövän MDR fenotyyppi välittämää ATF4. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kohdistaminen ATF4 voi tarjota uusia terapeuttisia vaihtoehto kääntää kliinisen mahasyövän MDR.

Tulokset

ATF4 moduloi MDR fenotyyppi mahasyövän solujen

Voit selvittää ATF4 on mukana kehittämässä MDR mahasyövän soluissa, ATF4 tasot havaittiin Western blot- ja qPCR on SGC7901 solulinjaa ja sen MDR-variantit, SGC7901 /VCR ja SGC7901 /ADR. Sekä proteiini- että mRNA-tasot ATF4 oli paljon suurempi resistenttejä solulinjoja kuin emosoluista (Fig. 1A).

Sen tutkimiseksi, onko ATF4 yli-ilmentyminen on riittävä indusoimaan MDR-fenotyypin mahasyövän soluissa, ATF4
ilmentymisen cDNA transfektoitiin stabiilisti SGC7901 ja AGS soluja. Ensimmäinen, CDDP herkkyys testattiin käyttäen pesäkemuodostusta. Mikä näkyy kvantifiointiin pesäkemuodostusta, ATF4 yli-ilmentyminen johti lähes 3-kertainen nousu pesäkemäärät verrattuna tyhjällä vektorilla-ilmentäviä soluja (Fig. 1 B). MTT määritykset myös, että IC _{50-arvot SGC7901-ATF4 ADR, videonauhurin, CDDP, ja 5-FU lisääntyivät merkitsevästi verrattuna tyhjän vektorin transfektoituja soluja (Kuva. 1 D).}

ATF4 tasot ovat koholla MDR mahalaukun syöpäsoluissa, me edelleen halusimme selvittää kohdistaminen ATF4 voisi uudelleen herkistää MDR solulinjat. Knockdovvn ATF4
siRNA on SGC7901 /ADR ja SGC7901 /videonauhuri solut johti 2- 3-kertainen väheneminen solujen määrä, kun sitä käytetään yhdessä CDDP (Fig. 1 C). Data on esitetty. 1E viittaavat myös siihen, että down-regulation ATF4
merkittävästi kääntää resistanssin SGC7901 /ADR-solut vasteena kemoterapiaa.

apoptoosin inhibitio on yksi tärkeimmistä mekanismeista, MDR, tutkimme myös kapasiteettia SGC7901 /ADR-soluja, jotka on transfektoitu erityisiä ATF4
siRNA tehdään CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia Hoechst-värjäys ja DNA: n fragmentoituminen määrityksissä. Hoito SGC7901-ATF4 ja SGC7901 /ADR-SCR solujen konsentraatiot CDDP 36 tuntia ei aiheuttanut apoptoosia, joka arvioidaan Hoechstin tumavärjäystä (Fig. 1 F) ja DNA pirstoutuminen määrityksissä (kuvio. 1G). Sen sijaan SGC7901-Vector ja SGC7901 /ADR-siATF4 soluilla merkittävää apoptoosin, jossa useammin ulkonäköä tiivistettyä ja hajanainen ytimet ja DNA tikkaat muodostumista. Lisäksi selvempää pilkkominen prokaspaasi-3 havaittiin hoidon jälkeen CDDP in SGC7901-vektori ja SGC7901 /ADR-siATF4 soluja verrattuna SGC7901-ATF4 ja SGC7901 /ADR-SCR-soluissa, vastaavasti (Fig. 1 H).

yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ATF4 annetaan MDR fenotyyppi mahalaukun syövän soluja, ja että kohdistuksen ATF4 tarjoaa menetelmän herkistävät resistenttien solujen kemiallisella käsittelyllä.

ATF4 ajan säätelee ilmentymistä SIRT1, MDR1 Bcl-2, ja Bax mahalaukun syöpäsoluissa

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että solut yli-ilmentävät SIRT1 näkyy vähentynyt herkkyys kemoterapia useiden mekanismien [18], [19], [20], [21]. Olimme uteliaita onko SIRT1
, joka on stressiin liittyvän geenin kriittinen MDR kehitykseen, voi olla alavirtaan tavoite ATF4 vastaa välittämällä ATF4 aiheuttama MDR mahalaukun syöpäsoluja.

SIRT1 tasot LV-Vector ja LV-ATF4 siirretty stabiilisti SGC7901 solut määritettiin qPCR ja Western blot. Yli-ilmentyminen ATF4 liittyi lisääntynyt SIRT1 ilmentymisen sekä transkription (Fig. 2A, vasen) ja translaation tasolla (Fig. 2B, vasemmalla). Sen sijaan siRNA knockdovvn ATF4
in SGC7901 /ADR-solut johti merkittävään vähentämiseen endogeenisen SIRT1
lauseke (Fig. 2A ja 2B, oikea). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ATF4 ajan säätelee SIRT1
ilmentymistä mahasyövässä soluissa.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia molekyylitason mekanismeja ATF4 liittyviin MDR mahalaukun syövän, tutkimme myös MDR1, MRP, Bcl-2, ja Bax ekspressiotasot mahalaukun syövän solut, joita käytetään edellä. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, ATF4 taitava solut ilmensivät enemmän MDR1 verrattuna kontrollisoluihin. Samaan aikaan, ei ole selvää eroa MRP ekspressio havaittiin tahansa näistä solulinjoista. Mielenkiintoista, sekä Bcl-2: n ja Bax ekspressiotasot olivat säädellään ylöspäin ATF4-taitavia soluissa, verrattuna kontrolliryhmään solulinjojen, kun taas ilmaus Bax osoitti vain vähäisiä muutoksia, mikä osoittaa, että säätely ylöspäin Bcl-2 Bax suhde voisi estää lääkkeen aiheuttama apoptoosin ATF4 yli-ilmentäviä mahalaukun syöpäsoluja.

Nämä tulokset osoittavat, että ATF4 edistää MDR kyky mahalaukun syövän solujen läpi useita mekanismeja.

ATF4 transaktivoi SIRT1 promoottorin aktiivisuutta ja sitoutuu suoraan SIRT1 promoottorin

sen määrittämiseksi, onko ATF4 sovittelee SIRT1
geenin transkription, 293T-solut ko-transfektoitiin 1,2 kb SIRT1
promoottorin reportteriplasmidilla ja ATF4
ekspressioplasmidin. Lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti, että SIRT1
promoottorin aktiivisuus oli merkittävästi aktivoi ATF4 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3A).

Yrittäessään saada erityisiä käsityksen mekanismeista SIRT1
induktio, selvitimme mahdollisimman induktio tapoja valmistaa ATF4. Analysoimalla 5'-sivuavan sekvenssin SIRT1
geenin bioinformatiikan ohjelmistoja (Tfsitescan palvelu, TESS, ja Genomatix), kaksi ATF4 otaksuttu sitoutumiskohtien tunnistettiin sisällä -950--600 emäsparin alueella SIRT1
promoottori (Fig. 3B).

Voit selvittää SIRT1
on välittömänä kohteena ATF4, siru kanssa ATF4 vasta-aineeseen SGC7901-ATF4 soluista osoitti rikastumista molempien sitoutumiskohtien sisällä SIRT1
promoottorialueen, mikä osoittaa, että RNA: n ja myöhemmin proteiinin taso nousee ja SIRT1
in ATF4 ilmentäviä solulinjoja johtuvat todennäköisesti suoraa vuorovaikutusta ATF4 kanssa SIRT1
geenin promoottori (Fig. 3C).

roolin tutkimiseksi kahden ATF4 sitoutumiskohdat säätelyssä SIRT1 transaktivaatiota, kohdennettu mutageneesi käytettiin mutatoitua näillä paikoilla. Lusiferaasireporttiterilla testi osoitti, että joko mutatoimalla sitoutumiskohdan 1 tai sitoutumiskohta 2 vähensi SIRT1 promoottorin aktiivisuuden aiheuttamien ATF4. Lisäksi mutaatio sekä sitoutumiskohtien poisti SIRT1 promoottorin aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä ATF4 sitoutumiskohdat ovat mukana transaktivaatiota SIRT1 promoottorin (Fig. S1).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että SIRT1 on suora transkription kohteena ATF4.

SIRT1
esto siRNA osittain kääntää MDR fenotyyppi ATF4 yliekspressoivia mahalaukun syöpäsolujen

tunnistaminen ATF4 välittämän SIRT1
ilmentymisen taso kasvaa mahalaukun syöpäsoluja, pyydetään meitä analysoimaan roolia tämän reitin mahasyövän MDR. Tilanteen korjaamiseksi, vertasimme in vitro
huumeiden herkkyys ATF4 pysyvästi transfektoitu mahasyövän solujen transfektion jälkeen SIRT1
siRNA tai salattu siRNA pesäke muodostumista ja MTT määrityksissä. Knockdovvn SIRT1
siRNA in SGC7901-ATF4 solut johti > 40%: n vähennys pesäkeluvussa kun sitä käytetään yhdessä CDDP (Fig. 4A, ylempi). Tämä vaikutus havaittiin myös AGS-ATF4 soluja (Fig. 4A, alempi). Lisäksi tietoja MTT-määritystä osoitti myös, että knockdovvn SIRT1
voisi uudelleen herkistää SGC7901-ATF4 solujen kemiallisia huumeita, mutta tämä ei tapahdu salattu siRNA transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4B).

Voit selvittää SIRT1 suojaa soluja CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia, SGC7901-ATF4 transfektoiduissa soluissa SIRT1
siRNA tai salattu siRNA hoidettiin CDDP ja leimattu anneksiini V ja PI. Apoptoottisten solujen tunnistettiin anneksiini V merkintöjä. Apoptoottisen prosenttiosuus SIRT1 siRNA transfektoitujen SGC7901-ATF4 soluissa oli merkittävästi suurempi kuin kontrolli-soluissa (kuvio. 5A, 72,8% vs. 25,9%). Ulkonäkö kondensoidaan ja hajanaista ytimet lisääntyi myös SIRT1 siRNA transfektoiduissa soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio. 5B). Lisäksi pilkkominen prokaspaasi-3 havaittiin niinkin aikaisin kuin 12 h hoidon jälkeen 10 ug /ml CDDP in SIRT1 siRNA transfektoiduissa SGC7901-ATF4 soluja, mutta ei salattu siRNA käsitellyissä soluissa, vaikka 24 tunnin jälkeen CDDP hoidon (Fig. 5C ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SIRT1 yli-ilmentyminen estää CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia.

vaikutuksen tutkimiseksi alas-säätely SIRT1 siRNA MDR liittyy molekyyleihin, selvitimme MDR1, MRP, Bcl-2, ja Bax ekspressiotasot SGC7901-ATF4 soluissa transfektiota SIRT1 siRNA tai salattu siRNA. Down-regulation of MDR1 havaittiin SIRT1 siRNA-käsitellyt solut (Fig. 5D) kontrolliryhmään verrattuna soluihin. Sen sijaan ei ole selvää eroa MRP, Bcl-2, ja Bax ekspressiotasoja havaittiin näytteiden välillä.

Nämä havainnot viittaavat siihen, että SIRT1 välittää ATF4 aiheuttama MDR vaikutus mahalaukun syövän soluissa.

inhibitio SIRT1 toiminnan uudelleen herkistää ATF4 transfektoidut solut DNA: ta vaurioittavien aineiden

todisteita siitä, että SIRT1 katalyyttinen aktiivisuus on myös vastuussa ATF4 aiheuttama MDR, SGC7901-ATF4 soluja esikäsiteltiin EX-527 , uusi, tehokas ja spesifinen pienimolekyylinen inhibiittori SIRT1, ja jota seuraa käsittely eri kemiallisia huumeita. Ensin määritetään pohjapinta sytotoksisuutta EX-527 LV-vektori ja LV-ATF4 pysyvästi transfektoitu SGC7901 soluja. MTT-määritystä osoitti, että EX-527: n pitoisuuteen saakka 10gM ei estänyt, vaan pikemminkin hieman lisääntynyt, elinkelpoisuus molemmissa solulinjoissa (Fig. 6A). Seuraavaksi tarkastellaan SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, ja Bax ekspressiotasot 24 tunnin kuluttua inkubaation kanssa tai ilman osoitetun annokset EX-527 mahalaukun syövän solut, joita käytetään edellä. Vain ilmaus MDR1 olivat alas-säädellä EX-527 pitoisuutena riippuvalla tavalla (kuvio. 6B). Sitten me esi SGC7901-ATF4 solujen ajoneuvon tai EX-527 (0,5, 1, 2, 4, ja 10 uM) 24 tunnin ajan, ja sitten CDDP- ja 5-FU-välitteisen solukuoleman tarkkailtiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, EX-527 paransi merkittävästi sytotoksisuuden molempien lääkkeiden annoksesta riippuvalla tavalla. Olemme myös päättäneet mahdollista synergistinen vaikutus EX-527 eri annoksia CDDP- ja 5-FU-välitteisen soluproliferaation inhibointi in SGC7901-ATF4 soluja. Kuten odotettua, 10pM EX-527 riittää voimistaa sytotoksisuuden molempien lääkkeiden (Fig. 6D).

Nämä tulokset viittaavat siihen, että SIRT1 toiminta on myös ratkaiseva rooli ATF4 aiheuttama mahasyövässä MDR ja tämä rooli saattaa välittyä osittain MDR1 ilme.

keskustelu

MDR aiheuttaa merkittäviä kliinisiä haasteita tehokas kemoterapia moniin ihmisen syöpäsairauksia. Mekanismeja, joilla solut muuttuvat resistenteiksi ovat moninaiset ja monimutkaiset, joten laajempi ymmärrys niistä, sekä tunnistaminen uusia mekanismeja chemoresistance, on erityisen hyödyllistä antaa parempia hoitovaihtoehtoja. Tämä tutkimus on ensimmäinen raportti, että korkea ATF4, yleisesti nähtävissä kasvainsoluissa stressaavissa olosuhteissa antaa mahasyövän solut MDR fenotyyppi, ja se tunnistaa, että tämä vaikutus välittyy osittain transaktivaation SIRT1 ilmaisun.

ATF4
ja SIRT1
ovat evoluutiossa konservoituneita stressivasteeseen geenien laajan kirjon biologisia prosesseja, joista monet ovat hyödyllinen varten homeostaasiin ja solujen suoja [22], [23], [ ,,,0],24]. Molemmat geenit indusoituvat vasteena erilaisiin rasitukset, kuten hapenpuutteen (hypoksia /anoksian), oksidatiivisen stressin, DNA-vaurioita, ravitsemukselliset puutetta, ja chemotoxic stressiä. Levenson VV et al.
Ensimmäinen raportoitu, että muutokset ilmentyminen ATF4 voisi olla rooli pleiotrooppista vastustuskyvyn eri luokkiin DNA-kohdistaminen huumeita [16]. Viime vuosina useat tutkimukset oli todennut, että ATF4 oli mukana suoraan tai välillisesti lääkeresistenssin kehittymisen kautta autophagy, glutationi-riippuvaisten redox järjestelmä, ja DNA-vaurioiden korjaamiseen [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Tässä osoitamme, että suojaava kyky ATF4 todellakin välittää MDR fenotyypin ATF4-yliekspressoivassa mahasyövän solulinjoja vastauksena kemoterapiaa. Meidän tulokset osoittavat selvästi, että yliekspressio ATF4 mahalaukun syöpäsoluissa liittyi enemmän vastarintaa, kun taas knockdovvn ATF4 aiheuttama uudelleen herkistymisen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ATF4 on todennäköisesti tärkeä alavirtaan välittäjä aiheuttama vastus useita mekanismeja, ja se on näin ollen arvokas terapeuttinen kohde. Vielä yhtenä tärkeimmistä transkription välittäjäaineiden ISR, joka aktivoi eri kohdegeenien, jotka edistävät palauttaminen homeostaasin, ATF4 voi myös välittää resistenssin muilla mekanismeilla. Tutkimuksessamme SIRT1 havaittiin olevan säädellään ylöspäin ATF4 yli-ilmentäviä soluja verrattuna vektori transfektoidaan soluihin. Sen sijaan knockdovvn ATF4
kanssa ATF4 erityisiä siRNA johti alas-säätely SIRT1 MDR mahalaukun syöpäsoluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että SIRT1 voisi olla alavirran välittäjä ATF4 aiheuttaman mahalaukun syövän MDR.

jäsenenä ATF alaryhmään perus-alueen leusiinivetoketjun (bZIP) transkriptiotekijöitä [22], ATF4 on mahdollisuuksia toimia joko transkriptioaktivaattorina tai transkription repressori kautta ATF tai cAMP reagoivan elementin (CRE) sitoutumiskohtiin [22]. Konsensus sitoutumiskohdan ATF määriteltiin TGACGT (C /A) (G /A) [27], joka on identtinen CRE konsensus-elementin (TGACGTCA) [28]. Lisäksi, erittäin konservoituneen ydin motiivi - ACGT - useimmissa Crès [29] voi sitoutua eri bZIP tekijöistä riippuen ympäröivien emästen ydinaihe [22], [30], [31]. Tutkimuksessamme kahden mahdollisen ATF-CRE sitoutumiskohtia havaittiin 1,2 kb: SIRT1
promoottorialueen, ja ATF4 suoraan aktivoitu SIRT1
transkription sitoutumalla molempia sitovia osia. Kuitenkin, miten nämä kaksi sitoutumiskohtaa pelata roolinsa joiden yksityiskohtaisista stressin olosuhteissa ei edelleenkään tunneta ja vaatii lisätutkimuksia.

Nisäkkäiden SIRT1
on lähinnä homologi hiivan SIR2
ja laajimmin tutkituista SIRT perheenjäsen. Se on vahvasti osallisena säätelyyn soluprosesseihin jotka määräävät pitkäikäisyys, mukaan lukien anti-apoptoosin, hermosolujen suojaus ja solujen vanhenemista tai ikääntymisen [32]. Viime aikoina yhä useammat tutkimukset ovat osallisina lisääntyneen ilmentymisen SIRT1 resistenttejä kemoterapiaa ja ionisoivan säteilyn [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Esimerkiksi, SIRT1 yli-ilmentyminen on havaittu lääkeresistentin neuroblastooma, osteosarkooma, maitorauhasen, munasarja-, eturauhas-, paksusuoli-, ja keuhkosyövän solulinjat verrattuna huumeiden herkkä kanssa. Kaikki nämä lääkeresistenttien vaikutuksia SIRT1 voisi johtua sen anti-apoptoottinen vaikutus [37], [38] ja hiljentäminen tuumorisuppressorigeeneille [39]. Lopuksi voisi ennustaa, että jos SIRT1 on mukana ATF4 aiheuttama MDR inhibitio SIRT1 pitäisi vaikuttaa herkkyyteen ATF4 yli-ilmentäviä soluja vasteena kemoterapiaa. Odotetusti sekä siRNA ja farmakologinen esto SIRT1 voisi uudelleen herkistää ATF4 yli-ilmentäviä soluja kemiallisia huumeita. Lisäksi meidän tutkimus osoittaa, että SIRT1 suojaa soluja kuoleman osittain antiapoptoottisena vaikutus.

On raportoitu, että MDR1 oli säädellään ylöspäin solujen lisääntynyt SIRT1 ilme [18], [36]. Tässä tutkimuksessa olemme myös osoittaneet, että MDR1 on säädellään ylöspäin ATF4 yli-ilmentäviä soluja, ja knockdovvn SIRT1 kanssa SIRT1 erityisiä siRNA tai estämällä sen toimintaa EX-527 voisi johtaa alas-säätely MDR1, joka on yhdenmukainen huume kestävä rooliin SIRT1. Kuitenkin Bcl-2 /Bax suhde, joka oli ajan säännelty ATF4 yli-ilmentäviä soluja, oli SIRT1 riippumaton, mikä viittaa siihen, että SIRT1-riippumattomien mekanismien myös olla rooli ATF4 aiheuttaman MDR mahalaukun syöpäsoluja.

Yhteenvetona, me osoitamme, että ATF4 annetaan MDR fenotyyppi mahalaukun syövän soluja, ja tämä vaikutus on osittain välittyy transaktivaatiota SIRT1 yliekspression. Lisäksi ATF4 on voimassa tavoite lääkeresistentin mahalaukun kasvaimet ja kehittää tehokkaita inhibiittoreita ATF4 olisi otettava huomioon tulevaisuudessa. Nämä havainnot tarjoavat uusia oivalluksia rooliin ATF4 säätelyssä SIRT1 ilmaisun ja osaksi sen stressi-vastus ominaisuuksia kasvainten synnyssä ja kemoterapiaa. Tämä on erityisen tärkeää kliinisessä vastiketta, koska ATF4 voi olla ajan säädellään hapen puutteen, oksidatiivisen stressin, ravitsemukselliset puutteen ja lähes kaikki haitalliset stressitekijöitä kasvain mikroympäris-, joka voitaisiin kaapata syöpäsolujen kiertää leviämisen estäminen ja solukuoleman vastaus kemoterapiaa. Siksi interventiot nojautui häiritseviä stressistä johtuvaa ATF4 ilmentymistä syöpäsoluissa voi olla tehokas kiertämisessä tai kääntämään lääkeresistenssin mahasyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Yksityiskohtaisia ​​menetelmiä, katso teksti S1 .

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen mahalaukun adenokarsinooman solulinjoja SGC7901 (saatu Academy of Military Medical Science, Peking, Kiina) ja MDR-variantit, SGC7901 /ADR ja SGC7901 /videonauhuri (perustettu ja ylläpidetään laboratoriossamme), ja AGS (solusta saatu pankin Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, Kiina) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone) ja penisilliiniä /streptomysiiniä. 293T-solut (saatu myös solun pankin Kiinan Academy of Sciences) viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Ylläpitää MDR-fenotyyppi, adriamysiini (jonka lopullinen pitoisuus on 0,5 ug /ml) ja vinkristiinin (jonka lopullinen pitoisuus 1 ug /ml) lisättiin elatusaineet SGC7901 /ADR ja SGC7901 /VCR-soluissa, vastaavasti. EX-527 (Sigma) liuotettiin DMSO: hon ilmoitettuina pitoisuuksina. Adriamysiini (ADR), vinkristiini (VCR), sisplatiini (CDDP) ja 5-fluorourasiilin (5-FU) liuotettiin normaaliin suolaliuokseen pitoisuudessa ilmoitettuina pitoisuuksina.

Cell transfektio ja stabiilien solulinjojen

ihmisen ATF4
ekspressioplasmidin (pCMV5-ATF4) luovutti ystävällisesti professori Amy S. Lee [25]. Lentivirusvektori koodaus siRNA erityisiä ATF4
ja ohjaus siRNA muodostettiin käyttämällä PLKO.1-TRC (Addgene) ja nimettiin LV-siATF4 ja LV-SCR ohjaus, vastaavasti. Lentivirusvektori koodaa ihmisen ATF4 geeni rakennettiin FUW-teto (Addgene), nimetty LV-ATF4. Tyhjän vektorin käytettiin negatiivisena kontrollina, joka on nimetty LV-vektori. Stabiileja solulinjoja transfektoimalla osoitti lentiviruksen konstruktien seurasi valinta puromysiiniä tai zeosiinia (Invitrogen), vastaavasti. Solujen transfektio ja stabiilien solulinjojen suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Sekvenssit siRNA-rakenteet löytyvät teksti S1.

immunoblottauksella

kerääminen proteiinin tiivisteet ja immunoblottauksella analyysi suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Vasta-lähteet, katso teksti S1.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

pesäkemuodostusta suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [40], vähäisin muutoksin (Text S1).

anneksiini V värjäystä ja FACS-analyysiä

anneksiini V värjäystä ja FACS-analyysi suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Solut, jotka olivat negatiivisia PI ja anneksiini V-värjäys luokiteltiin elävät solut, solut, jotka värjättiin positiivisia anneksiini V vain luokiteltiin jo apoptoottisia soluja, ja PI-positiivisia ja anneksiini V-positiivisia soluja oli läpikäyvien solujen apoptoosin myöhäisissä vaiheissa.

DNA: n fragmentoituminen määrityksen

DNA-fragmentit uutetaan DNA Ladder Extraction Kit Spin Column (C0008, Beyotime Co., Peking, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. DNA-fragmentit erotettiin käyttämällä geelielektroforeesia 1% agaroosigeelillä, joka sisälsi 0,1 ug /ml etidiumbromidia.

Hoechst-värjäys

Hoechst Värjäys suoritettiin valmistajan protokollan (C0003, Beyotime Co. ). Soluja visualisoitiin DP70 inverttisokeri Immunofluoresenssitesti mikroskoopilla (Olympus). Solut tiivistetyn ja hajanaista tumat arvioitiin olevan apoptoottisia.

In vitro
huumeiden herkkyyden määritys

ADR, videonauhurin, CDDP, ja 5-FU olivat kaikki valmistettu juuri ennen kunkin kokeen. Drug herkkyys mitattiin käyttämällä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-liumbromidi (MTT) standardin mukainen protokolla (teksti S1).

Quantitative real -aika PCR (qPCR) B

Quantitative real-time PCR suoritettiin käyttäen LightCycler-480 II-järjestelmä (Roche) ja SYBR Green tunnistus (TaKaRa). Alukkeiden sekvenssit löytyvät Teksti S1.

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

ChIP määritykset suoritettiin valmistajan protokollan (P2078, Beyotime Co.) pienin muutoksin. Kromatiinin liuoksia sonikoitiin ja inkuboitiin anti-ATF4 tai kontrolli-IgG, ja pyöritetään yön yli 4 ° C: ssa. DNA-proteiini ristisidosten peruttiin ja chromatin DNA puhdistettiin ja alistettiin PCR-analyysillä. Alukkeilla 5'-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3 'ja 5'-TTT GGA GTC CTT CCT TTC-3' käytettiin monistamiseen SIRT1
distaalinen promoottorisekvenssin (A1, nukleotidit -974 ja - 843), ja alukkeita 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'ja 5'-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3' käytettiin monistamiseen SIRT1
proksimaalisen promoottorin sekvenssin (A2, nukleotidit -781--647). Alukkeet GAPDH
, 5'-TAC TAG CGG TTT TAC GGG CG-3 'ja 5'-TCG AAC AGG AGG AGC AGA GAG CGA-3', käytettiin negatiivisena kontrollina. Positiivisena kontrollina ATF4-DNA vuorovaikutus, alukkeita 5'- TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3 'ja 5'-CGC TTA TAC CGA CCT GGC TCC T-3', joka oli suunniteltu monistamaan asparagiini syntetaasin ( ASNS
) promoottorialueen, joka sisältää ainakin kaksi paikkaa raportoitu sitovan ATF4 [41], käytettiin myös. Monistamisen jälkeen PCR-tuotteet erotettiin 1,5% agaroosigeelillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä.

reportterigeenimäärityksessä

1,2 kb: n ihmisen SIRT1
promoottorisekvenssi (- 1100-100 bp) syntetisoitiin ja kloonattiin XhoI ja HindIII-kohtiin pGL3-Basic-vektoriin. Saatu konstrukti varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. 293T-solut ko-transfektoitiin SIRT1
promoottori reportteri plasmidi, PRL-TK-plasmidia (Promega, USA), ja pCMV5-ATF4 plasmidi käyttämällä Iipofectamine2000 (Invitrogen). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut pestiin kolme kertaa kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sitten solut hajotettiin 100 ul: ssa Passive Lysis Buffer (Promega) ja ravisteltiin 15 minuutin ajan. Tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), jonka Varioskan Flash mikrolevylukijalla (Thermo Scientific). "Suhteellinen aktiivisuus" määriteltiin suhde tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden Renilla lusiferaasiaktiivisuus ja laskettiin jakamalla luminesenssin intensiteetti saatu testiin tulikärpäsen lusiferaasi tarvitaan myös Renilla lusiferaasin. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja määritykset toistettiin kolme kertaa 293-T-solut.

Tilastollinen analyysi

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± S.D. Erotus avulla analysoitiin Studentin t-testiä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS16.0 ohjelmistoa (Chicago, IL). Merkitys asetettiin 5% tasolla.

tukeminen Information
Kuva S1.
vaikutus mutatoidun ATF4 sitoutumiskohtiin aktiivisuutta SIRT1 promoottorin. 293T-solut ko-transfektoitiin pCMV-ATF4 ja villityypin SIRT1, SIRT1-Mut1, SIRT1-Mut2, tai Mut1 + Mut2 toimittaja, ja suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus määritettiin. Lusiferaasiaktiivisuutta mock pCMV-Taq ryhmä nimettiin 1,00. Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. kolmesta kokeesta suoritettiin kaksinkertaisina. *, P < 0,05. Vasemmalla puolella on kaavamainen esitys reportterigeenirakenteilla. Pylväiden, oikealla puolella ovat suhteellisia tasoja lusiferaasiaktiivisuuden kussakin transfektoiduissa näytteissä.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
teksti S1.
Täydentävät Materiaali ja menetelmät.
doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme professori Amy S. Lee ystävällisesti antaa meille pCMV5-ATF4 plasmidin . Kiitämme myös herra Taidong Qiao ja Zheng Chen erinomaisesta teknisestä avusta.

• PLoS ONE: geneettinen alttius on CagA-Interacting molekyylit ja Gene-Environment Vuorovaikutusta Phytoestrogens: oletetun Risk Factor mahasyövän
• PLoS ONE: S100A6 proteiini säätelee negatiivisesti CacyBP /SIP-estoa mahasyövän Cell Proliferation ja Tumorigenesis