PLOS ONE: Down-Regulação da Claudina-18 está associado com a proliferativa e potencial invasivo do câncer gástrico na frente invasiva

Abstract

Fundo

claudinas são conhecidas como proteínas de junções apertadas, e seu padrão de expressão no câncer gástrico ainda é controversa. A relação entre os padrões de proteínas de junções apertadas e proliferação do tumor expressão no câncer gástrico precoce ainda está longe de ser clara.

Objectivos

Para investigar os padrões de claudina-18 e Ki-67 em câncer gástrico precoce na frente invasiva e mucosa gástrica normal ao redor e investigar a função biológica da claudina-18 na proliferação e invasão das células cancerosas.

Métodos

setenta e cinco câncer gástrico precoce foram avaliadas lesões removidas através de ressecção endoscópica da mucosa ou ressecção submucosa endoscópica. Todas as lesões de câncer gástrico foram diagnosticados como adenocarcinoma diferenciado utilizando a Classificação japonesa de carcinoma gástrico. Para avaliar a proliferação epitelial, imunomarcação com Ki-67 foi realizada, e foi calculado o índice de marcação. Para avaliar a expressão de proteínas de junções apertadas epiteliais, foi realizada a coloração imunofluorescente de claudina-18. A imunorreactividade de claudina-18 foi graduada de acordo com o número de células coradas. análise de correlação foi realizada pelo coeficiente de correlação de Spearman. A transfecção de claudina-18 pequeno ARN interferente (siRNA) foi realizada em MKN74, uma linha celular de cancro gástrico claudina-18-positivas, para investigar o efeito da claudina-18 sobre a proliferação e invasão de células cancerosas.

resultados

Claudina-18 foi significativamente regulada no câncer gástrico em comparação com circundante mucosa normal gástrica ou metaplasia intestinal. O Ki-67 índice de marcação de câncer gástrico na frente invasiva foi inversamente correlacionado com o nível claudin-18, mas que, na lesão da mucosa não se correlacionou. Claudina-18 knockdown promoveu significativamente a proliferação de células MKN74 comparação com transfectadas com ARNsi de controlo. MKN74 invasão aumentou significativamente com claudina-18 siRNA transfecção comparação com transfecção de controle de siRNA.

Conclusões

Down-regulação da claudina-18 está associado com o potencial proliferativo na frente invasiva do câncer gástrico, sugerindo que tem um papel essencial na progressão do cancro gástrico

citação:. Oshima t, J Shan, Okugawa t, Chen X, Hori K, Tomita T et al. (2013) Down-Regulação da Claudina-18 está associado com a proliferativa e invasiva Potencial de câncer gástrico na frente invasiva. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10.1371 /journal.pone.0074757

editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de maio de 2013; Aceito: 06 de agosto de 2013; Publicação: 20 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Oshima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão através de um Grant-in-Aid para a Investigação científica (C) 2010-2012 (No. 22.590.691). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a quarta neoplasia mais comumente diagnosticado ea segunda causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1], [2]. Intramucosal GC pode ser tratado por tratamento curativo endoscópica. Além disso, o endoscópica da submucosa dissecção (ESD) técnica expandiu as indicações para o tratamento endoscópico e permitiu a ressecção em bloco de intramucoso grande e submucoso pouco invasiva precoce GCs [3]. Uma ressecção em bloco por ESD permite diagnóstico preciso da profundidade câncer [4].

junções apertadas (TJS) são domínios de membrana especializados na região mais apical do epitélio polarizado e células endoteliais [5]. Claudinas são as principais proteínas TJ; eles consistem de pelo menos 27 proteínas membros e são expressas de uma forma específica de tecido [6], [7]. Regulam permeabilidade paracelular e estabelecer polaridade celular epitelial, pela sua função vedação [6], [8]. Um crescente corpo de evidências recentes sugerem que claudinas são componentes estruturais e funcionais chave de fios TJ [6], [9], e eles podem desempenhar um papel crucial na tumorigênese e inflamação [10], [11].

O epitélio gástrico apresenta uma série de mudanças na expressão claudin de mucosa normal para metaplasia intestinal e adenocarcinoma. Embora GCs foram recentemente classificados pela expressão à base de mucina [12], [13], uma classificação com base GC-claudina tem também sido propostos [14]. Nós também têm relatado que a sub-regulação de claudina-3 foi relacionada com a proliferação de intramucosal GC [15]. Recentemente, camundongos knock-out claudin-18 foram mostrados para ter atrofia da mucosa gástrica e paracelular H ^{+ ion fugas [16]. Claudina-18a2 mostrou-se frequentemente regulados negativamente em GC de um fenótipo intestinal, sugerindo que claudina-18a2 seria um bom marcador para a GC [17]. No entanto, a função biológica de claudina-18, que pode estar envolvido no comportamento de células de cancro, nunca foi examinado. Além disso, não é claro qual a característica de células GC na frente invasiva está relacionada com o crescimento rápido ou agressividade de invasão.}

No presente estudo, o nível de expressão da claudina-18 em GC na frente invasiva e mucosa gástrica foi examinada circundante, pela primeira vez, e a correlação entre o nível de claudina-18 e o Ki-67 o índice de marcação (LI) em GC foi avaliada. O efeito da claudina-18 sobre a proliferação e invasão in vitro
foi também examinada.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Uma série consecutiva de 74 pacientes GC com início foram estudados (Tabela 1). Foram avaliadas as lesões GC (= 75 n), que haviam sido submetidos a curativa EMR ou ESD. GCs com invasão de submucosa (n = 31) foram incluídos neste estudo. cancros duplas foram detectadas em apenas um paciente do sexo masculino. Todo o GC foram classificados como adenocarcinoma diferenciadas usando a Classificação japonesa de carcinoma gástrico [18]. anonimato paciente foi preservada. Este estudo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo comitê de Ética /Institutional Review Board de Hyogo College of Medicine. O sujeito deu consentimento informado por escrito.

Imunohistoquímica

As amostras foram fixados com solução de formol a 10% e embebidos em parafina. Seções foram cortados a 3 mm de espessura e corados com hematoxilina e eosina (HE). Para avaliar a proliferação epitelial, as amostras foram incubadas com o anticorpo monoclonal Ki-67 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA), seguido por incubação com anticorpo secundário biotinilado cavalo anti-ratinho (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). O método do complexo de estreptavidina-biotina (Vector Laboratories) foi usado para visualizar a imunorreactividade. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina.

imunofluorescente Coloração de proteínas juncional
anti-claudina 18-anticorpo

policlonal de coelho (Invitrogen) e IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, EUA), anticorpo secundário foram usadas para visualizar imunorreactividade. A especificidade da reacção foi testada por incubação com soro de coelho não-imune (Dako, Glostrup, Dinamarca).

A pontuação da coloração imunológica de Claudina-18 e Ki-67

A imunorreactividade foi avaliada pela dois observadores independentes (T.Ok., XC), e ambos eram cegos às características clínicas e os resultados clínicos associados com cada amostra. mucosa gástrica não neoplásicas sem a metaplasia intestinal (não-MI) e a metaplasia intestinal (GI) e regiões de cancro foram avaliadas. A imunorreatividade da claudina-18 foi graduada utilizando os seguintes critérios: 0, ausência de coloração da membrana; 1+, menos de 10% das células tumorais com mancha da membrana completa; 2+, 10% a 50% das células tumorais com coloração da membrana completa; 3+, mais do que 50% a 75% de células tumorais com coloração da membrana completa, forte; e 4+, mais do que 75% de células com coloração da membrana completa, muito forte. Cinco campos de alta potência foram analisados ​​de cada região dos casos e a pontuação média foi calculada. Todas as secções foram contadas duas vezes para confirmar a reprodutibilidade dos resultados. O Ki-67 LI foi calculado após a contagem de 1000 células cancerosas.

pequeno RNA de interferência (siRNA) Experimentos Knockdown

Para siRNA silenciamento de claudina-18 humana, em-alvo mais SmartPool e um não siRNA controlo espec�ico foi comprado de Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EUA). A linha de células MKN74 (Coleção japonesa dos recursos biológicos de Pesquisa Cell Bank, Osaka, Japão), que é CLDN18
-positivo, foi selecionado para estudar os efeitos da claudina-18 knockdown na proliferação e invasão propriedades das células GC . As células foram transfectadas com 25 nM de ARNsi utilizando DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Grupos de controlo e de ARNip de controlo foram tratadas com os reagentes de transfecção sem siARN e os reagentes de transfecção com o controlo não-específica siRNA, respectivamente,. Os ensaios foram realizados após 3 dias as células foram transfectadas MKN74.

Ensaio de Proliferação Celular

A proliferação celular foi determinada por um ensaio colorimétrico de viabilidade celular baseado na clivagem do sal de tetrazólio WST-1 por desidrogenases mitocondriais (Takara Bio Inc., Otsu, Japão). A absorvância do corante formazano formado, que se correlaciona com o número de células metabolicamente activas na cultura, foi medida a 450 nm 1 h após a adição do reagente.

Invasão Ensaio

invasão de células MKN74 foi ensaiada em 24 poços câmaras Biocoat Matrigel invasão (8 m; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As câmaras inferiores foram cheias com RPMI 1640 com 10% de FBS, e células (2 x 10 ^{5) foram colocados em câmaras de inserção, que continham RPMI 1640 sem FBS. Após 24 h de incubação, as células não-invasivos foram removidos com um cotonete. As células que migraram através da membrana e coladas à superfície inferior da membrana foram fixadas com formalina a 10% e coradas com hematoxilina. Para quantificação, as células foram contadas sob um microscópio em cinco campos aleatórios de alta potência. Os ensaios foram realizados em triplicado. Calculou-se a razão de invasão para controlar médio.}

Análise Estatística

A avaliação estatística foi realizada utilizando SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). análise de correlação foi realizada pelo coeficiente de correlação de Spearman (rs). As comparações múltiplas foram realizadas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Scheffe. comparações individuais foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. P
. ≪ 0,05 foi considerado significativo

Resultados

A expressão de Claudina-18 em Mucosa Gástrica e Carcinoma

Um total de 75 casos de GC diferenciadas foram analisadas neste estudo. Os cortes foram corados com claudina-18, eo nível de coloração foi classificada. Claudina-18 foi detectada em níveis elevados em células epiteliais gástricas nas fronteiras lado apical e lateral em não-MI, mas não em células de adenocarcinoma primário ou diferenciados (Fig. 1A). Os níveis de claudina-18 foram significativamente mais baixos em células cancerosas do que em não-IM e IM, bem como significativamente menor no IM em comparação aos não-IM (Fig. 1B).

Detecção de Claudina-18 em GCs com submucosa Invasion

casos GC representativos com invasão de submucosa mostrou que densa claudin-18 coloração foi evidente na frente invasiva de células submucosa invadiu-câncer, e Ki-67 LI foi baixa na lesão (Fig. 2A ). Em um caso com baixa claudin-18 coloração na frente invasiva de células submucosa invadiu-câncer, Ki-67 LI foi elevada na lesão (Fig. 2A).

Correlação da Claudina-18 Nível e Ki -67 LI

o Ki-67 LI de GC na mucosa e submucosa foi determinada pela percentagem de núcleos Ki-67-positivas. Para determinar a correlação entre o Ki-67 LI eo nível claudin-18, foi realizada análise de correlação. O nível de claudina-18 expressão da mucosa não foi significativamente correlacionada com o Ki-67 LI (rs = 0,07, P =
0,60). Por outro lado, o nível de expressão da submucosa claudina-18 estava significativamente correlacionada inversamente com a submucosa Ki-67 LI (RS = -0,550, P
= 0,0010) (Fig. 2B).

Efeito da claudina-18 siRNA na proliferação e invasão das células GC

a linha de GC celular, MKN74, constitutivamente expresso claudin-18, eo nível de mRNA de claudina-18 foi significativamente reduzida em siRNA contra claudin- 18 (Fig. 3A). imunofluorescência com claudina-18 também diminuiu após a transfecção (fig. 3B). Em claudina-18 regulada para baixo MKN74, o crescimento celular foi aumentada significativamente (Fig. 4A), e a invasão de células foi significativamente aumentada (Fig. 4B).

Discussão

expressão alterada de claudinas na submucosa frente invasiva pode estar relacionada com a progressão da GC. Estudos recentes sugerem que mesmo em pouco submucosa GC invasiva, sem linfático e vascular, a ESD pode ser viável como uma operação curativa [19]. No entanto, ainda não está claro qual os casos de submucosa ligeiramente GC invasiva pode ser seguido sem nova cirurgia após ESD. No presente estudo, verificou-se que houve uma correlação inversa entre o nível de claudina-18 e Ki-67 positividade na frente invasiva da submucosa GC invasivo, e que claudin-18 invasão celular GC regulamentado e proliferação. Ki-67 imuno-histoquímica foi substituído por contagem mitótica na avaliação da proliferação de células tumorais. Estudos têm demonstrado que o Ki-67 correlaciona-se com as células indiferenciadas e em doenças malignas metastáticas [20]. Neste estudo, GC, o EMR /ressecado ESD em que a indicação é limitada ao tipo diferenciado de GC foi estudada. Portanto, estes dados indicaram que o nível de Ki-67 na frente invasiva estava relacionado com células metastáticas em malignidades, e que a perda de claudina-18 foi um dos marcadores de agressividade GC e pode estar relacionada com o desenvolvimento de metástases, o que exige cirurgia adicional após o tratamento ESD

claudinas são anormalmente regulada numa variedade de tumores malignos, tais como a CG, carcinoma hepatocelular, carcinoma do trato biliar, cancro da mama, carcinoma de células renais, e mesotelioma [15], [21] -. [ ,,,0],25]. A mudança na claudinas nas junções está associada com a perda de aderência apertada e polaridade no epitélio. A perda de polaridade está associada com o aumento da proliferação epitelial e celular para mesenquimal, ao passo que as interrupções em complexos de junção apertados alterar as interacções célula-célula, que estão relacionados com a invasão e metástase [23], [26], [27]. Em estudos de observação, a diminuição da claudina-3 e -4 têm sido relatados em células GC na frente invasiva e foram correlacionadas com a progressão e metástase [14] do cancro. A sub-regulação de claudinas Também foi relatado em alguns outros tumores epiteliais, incluindo a perda de claudina-1 no cancro da mama [28] e o cancro do cólon [29], bem como a perda de claudina-7 no cancro da mama [30] e cabeça e pescoço câncer [31]. Em relação à invasão de células tumorais, a expressão reduzida de claudina-7 na frente invasiva foi encontrado para ser correlacionado com a profundidade de invasão e linfática em carcinoma de células escamosas do esôfago [32]. Embora claudin-3 e claudina-7 expressões eram mais baixos na frente invasiva do submucosa do que em lesões mucosas em nosso estudo anterior, claudin-3 e claudina-7 níveis na frente invasiva não se correlacionaram com o Ki-67 LI [15]. Por outro lado, claudina-18 na frente invasiva foi inversamente correlacionado com o Ki-67 LI no presente estudo. Estes dados podem ser relacionadas com os resultados que claudin-3 e claudin-4 não foram relacionadas com metástase ganglionar [33]. Além disso, estes estudos observacionais não pode explicar se essas mudanças afetam diretamente a invasão tumoral e metástase.

-Claudin 18 é expresso principalmente no estômago e células epiteliais do pulmão. Claudina-18a2 é o formulário para o estômago, e as isoformas são ligeiramente diferentes. Em um relatório anterior, tipo gástrico claudin-18 foi perdido em GCs [17]. No entanto, durante a metaplasia intestinal, o padrão de expressão claudinas já que difere da do epitélio gástrico normais. O desaparecimento da claudina-18 foi encontrado para ser associado com metaplasia intestinal no estômago [17]. Portanto, a perda de claudina-18 de expressão em GC avançada [17] não pode simplesmente demonstrar o carácter do cancro. Mesmo no processo de progressão GC, o nível de expressão pode mudar. Para explorar a função destas moléculas-alvo, nós pensamos que era importante examinar tumores na mesma fase, e avaliou o nível de claudina-18, o que pode afetar a invasão e metástase, na submucosa ligeiramente lesões GC invasivos. Além disso, a mucosa gástrica claudina-18 pode não funcionar apenas em TJs, porque a localização expressa na superfície da célula não foi apenas a TJs. Investigações adicionais são necessárias para analisar expressões de proteínas TJ fisiológicos e fisiopatológicos na membrana lateral.

Para verificar se as alterações nos níveis claudina-18 na frente invasiva do submucosa contribuiu para a proliferação e invasão das células cancerosas, um siRNA abordagem foi usada para knockdown da proteína na linha celular MKN74 de GC, o que é positivo para claudina-18. Assim, o presente estudo mostrou pela primeira vez a função de claudina-18 no GC usando uma abordagem genética e que a perda de claudina-18 estava envolvido em ambos proliferação e invasão das células GC. Juntamente com esses dados, perda de claudina-18 na frente invasiva do submucosa indicou a aquisição de características mais agressivas e poderá permitir a dissociação-célula durante a invasão. No entanto, uma limitação do estudo foi que apenas MKN74 poderia ser examinada, porque era a única linha de células de câncer gástrico diferenciada que expressa claudin-18, tanto quanto nós examinamos. Portanto, fenômenos semelhantes não pode ser reproduzido com outras linhas celulares de cancro gástrico.

Ambos up-regulação e infra-regulação da claudinas foram relatados para ser envolvido no processo de câncer [34], [35]. Para a análise da função de claudinas em células cancerosas, as abordagens genéticas para claudinas também têm sido relatadas em várias células de cancro. Knockdown da claudina-1 por siRNA resultou na inibição da migração de células de cancro do cólon em [36]. A sobre-expressão da claudina-6, claudina-7, ou claudina-9 aumentaram o potencial invasivo de uma linha celular de adenocarcinoma gástrico [37]. Tal proliferação induzida por claudina invasão e pode parecer um paradoxo, porque claudinas são conhecidos por estar envolvidos na selagem junções epiteliais. Estes dados controversos sugerem que as funções de claudinas são ambos subtype- e células de tipo específico.

Como limitação deste estudo, ainda não é claro que esta diminuição claudin-18 nível na submucosa frente invasiva é realmente envolvido na metástase do cancro, porque é difícil de seguir a história natural do início de GCs. No entanto, os dados deste estudo indicou que um menor nível de claudina-18 na frente invasiva foi associado com maior tendência proliferativa. É necessário avaliar prospectivamente se esta diminuição do nível de claudina-18 pode ser utilizado como um biomarcador prognóstico metastático e após a ressecção endoscópica num futuro estudo.

Em resumo, foi demonstrado pela primeira vez que claudina-18 é expressa heterogeneamente em frente da submucosa invasiva de GC no início, e a sub-regulação de claudina-18 está associada com o potencial proliferativo e invasivo da GC. Estes resultados indicam que claudina-18 tem um papel fundamental na progressão da GC e pode ser um candidato biomarcador da progressão da doença. A claudina-18 experimento knockdown confirmou que a supressão da juncional claudin-18 promoveu a proliferação e invasão das células GC.

Reconhecimentos

Agradecemos Ms. Noriko Kamiya para assistência técnica.

• PLOS ONE: tetrandrina Induz mitocôndrias Mediada por apoptose in Human câncer gástrico BGC-823 Cells
• PLOS ONE: Helicobacter pylori Infecção synergizes com três Inflamação Relacionada com variantes genéticas na GWASs para aumentar o risco de câncer gástrico em um chinês Population