Абстрактный
Фон
Claudins известны как плотных соединений белков, и их характер экспрессии при раке желудка остается спорным. Отношения между паттернов экспрессии белков плотных соединений и пролиферации опухоли в ранних стадиях рака желудка еще далека от ясности.
Методы
Семьдесят пять ранних стадий рака желудка повреждения удалены с помощью эндоскопической резекции слизистой оболочки или эндоскопической подслизистой резекции были оценены. Все поражения желудка рак были диагностированы как дифференцированной аденокарциномы с использованием японской классификации Желудочный карцинома. Для оценки эпителиальной пролиферации, иммунным окрашиванием с Ki-67 была выполнена, и индекс мечения рассчитывалась. Для оценки экспрессии эпителиальных плотных соединений белков, проводили иммунофлуоресцентного окрашивания Claudin-18. Иммунореактивность клаудин-18 оценивалась по числу окрашенных клеток. Корреляционный анализ проводили с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Трансфекция Claudin-18 малых интерферирующих РНК (миРНК) была выполнена в MKN74, в Claudin-18-позитивных клеток рака желудка линии, чтобы исследовать влияние Claudin-18 на пролиферацию и инвазии раковых клеток.
Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии через дотация для научных исследований (C) 2010-2012 (№ 22590691). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Пациенты Результаты Выражение Claudin-18 в слизистой оболочке желудка и карцинома
<р> рак желудка (GC) является четвертым наиболее часто диагностируется злокачественная опухоль, а второй наиболее распространенной причиной, связанной с раком смертности во всем мире [1], [2]. Intramucosal GC может быть целебно лечить эндоскопического лечения. Кроме того, эндоскопическая подслизистая диссекция (ESD) техника расширило показания к эндоскопического лечения и позволило единым блоком резекции intramucosal большой и слегка подслизистых инвазивный ранний ШС [3]. Гуртом резекция по ОУР позволяет поставить точный диагноз глубины рака [4].
<Р> Плотные соединения (TJS) представляют собой специализированные мембранные домены в наиболее апикальной области поляризованных эпителиальных и эндотелиальных клеток [5]. Claudins являются основными TJ белки; они состоят из, по меньшей мере 27 белков-членов и выражаются в манере, тканесецифического [6], [7]. Они регулируют проницаемость парацеллюлярного и установить полярность эпителиальных клеток их функцией забора [6], [8]. Все больше последние данные свидетельствуют о том, что claudins являются ключевыми структурными и функциональными компонентами нитей TJ [6], [9], и они могут играть решающую роль в онкогенеза и воспаления [10], [11].
<Р> эпителий желудка обнаруживает ряд изменений в Claudin экспрессии от нормальной слизистой оболочки кишечной метаплазии и аденокарциномы. Хотя ШС недавно были классифицированы по муцина на основе выражения [12], [13], также был предложен клаудин на основе классификации GC [14]. Мы также сообщали, что понижающего регулирование Claudin-3 был связан с распространением intramucosal GC [15]. В последнее время были показаны клаудин-18 мышей выбивания иметь слизистой оболочки желудка атрофии и парацеллюлярная H + ион утечки [16]. Claudin-18a2 было показано, что часто вниз регулируется в GC кишечной фенотип, предполагая, что Claudin-18a2 будет хорошим маркером для GC [17]. Тем не менее, биологическая функция клаудин-18, которые могут быть вовлечены в поведении раковых клеток, никогда не был рассмотрен. Кроме того, не ясно, какая характеристика GC клеток на инвазивный фронте связана с быстрым ростом или агрессивности вторжения.
<Р> В настоящем исследовании, уровень экспрессии Claudin-18 в GC при инвазивной фронте и окружающая слизистая оболочка желудка исследовали впервые, а корреляция между уровнем клаудин-18, и индекс Ki-67 маркировка (LI) в GC оценивали. Эффект Claudin-18 на пролиферацию и инвазивность в пробирке
был также рассмотрен.
Материалы и методы
<р> последовательной серии из 74 пациентов с раннего ГХ были изучены (таблица 1). GC повреждения (п = 75), которые подверглись целебное ЭМИ или ОУР были оценены. ШС с подслизистой инвазии (п = 31) были включены в данное исследование. Двойные раки были обнаружены только в одном пациента мужского пола. Все ГК были классифицированы как дифференцированной аденокарциномы с использованием японской классификации карциноме желудка [18]. Анонимность пациента была сохранена. Это исследование было выполнено в соответствии с Хельсинской декларацией и было одобрено комитетом по этике /Institutional совета по рассмотрению действия Хёго медицинский колледж. Субъект дали письменное информированное согласие.
Immunohistochemistry
<р> Образцы фиксировали 10% -ным раствором формалина и заливали в парафин. Срезы толщиной 3 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (HE). Для оценки эпителиальной пролиферации, образцы инкубировали с Ki-67 моноклонального антитела (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), с последующей инкубацией с биотинилированным конский против мышиного антитела (вторичного Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Комплексный метод стрептавидин-биотин (Vector Laboratories) использовали для визуализации иммунореактивности. Ядра контрастному окрашиванию гематоксилином.
Иммунофлуоресцентного Окрашивание Junctional белков
<р> кроличьего анти-клаудин-18 поликлонального антитела (Invitrogen) и Cy-3 конъюгированный козий анти-кроличий IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Вест-Гроув , штат Пенсильвания, США) вторичные антитела были использованы для визуализации иммунореактивности. Специфичность реакции была проверена путем инкубации с неиммунная кроличьей сыворотки (Dako, Glostrup, Дания).
озвучивание иммунное клаудин-18 и Ki-67
<р> иммунореактивности оценивали с помощью два независимых наблюдателя (T.Ok., XC), и оба были слепыми к клинико-патологическими особенностями и клинических исходов, связанных с каждым образцом. были оценены Non опухолевое слизистой оболочки желудка без кишечной метаплазии (без IM) и с кишечной метаплазией (IM) и регионах рака. Иммунореактивности Claudin-18 оценивали с использованием следующих критериев: 0, отсутствие мембранного окрашивания; 1+, менее чем 10% опухолевых клеток с помощью полной мембраны пятна; 2+, от 10% до 50% опухолевых клеток с помощью полного окрашивания мембраны; 3 +, более чем 50% до 75% опухолевых клеток с полным, сильным мембранным окрашиванием; и 4 +, более чем 75% клеток с полным, очень сильным мембранным окрашиванием. Пять полей высокой мощности были проанализированы в каждом регионе случаев и средний балл был рассчитан. Все секции были забиты два раза, чтобы подтвердить воспроизводимость результатов. Ki-67 LI рассчитывали после подсчета 1000 раковых клеток.
Малые РНК интерферирующих (миРНК) Нокдаун Эксперименты
<р> Для миРНК глушителей человека Claudin-18, ПО-TARGET плюс SMARTpool и неустановленным -специфический контроль миРНК был приобретен у фирмы Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, США). Клеточная линия MKN74 (японский язык сборник научных биоресурсам Cell Bank, Осака, Япония), что CLDN18
-положительным, был выбран для изучения влияния Claudin-18 нокдауна на пролиферацию и инвазионных свойств GC клеток , Клетки трансфицировали 25 нМ миРНК с использованием DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Контроль и управление миРНК группы обрабатывали с реагентами без трансфекции миРНК и реагентов трансфекции с неспецифическим управления миРНК, соответственно. Эксперименты были проведены 3 дня после того, как MKN74 клетки трансфицировали.
пролиферации клеток Анализ
<р> пролиферации клеток определяли с помощью колориметрического анализа жизнеспособности клеток на основе расщепления соли тетразолия WST-1 по митохондриальных дегидрогеназ (Takara Bio Inc., Оцу, Япония). Оптическую плотность формазана красителя образуется, который коррелирует с количеством метаболически активных клеток в культуре, измеряли при длине волны 450 нм через 1 ч после добавления реагента.
нашествие Анализ
<р> MKN74 клеток вторжения анализировали в 24-луночных Biocoat Матригель вторжения камер (8 мкм, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) в соответствии с протоколом производителя. Нижние камеры были заполнены RPMI1640 с 10% FBS, и клетки (2 × 10 5) были помещены в вставных камерах, в которых содержались RPMI1640 без FBS. После 24-часовой инкубации, неинвазивного клетки удаляли с помощью ватного тампона. Клетки, которые мигрировали через мембрану и прилипла к нижней поверхности мембраны, фиксировали 10% -ным формалином и окрашивали гематоксилином. Для количественного определения, клетки подсчитывали под микроскопом в пяти случайных полей высокой мощности. Эксперименты были проведены в трех экземплярах. Отношение вторжения контролировать среду рассчитывали.
Статистический анализ
<р> Статистическая оценка была выполнена с использованием SPSS13.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Корреляционный анализ проводили с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Rs). Множественные сравнения проводились с использованием теста Крускала-Уоллиса с последующим тестом Шеффе. Одиночные сравнения проводились с помощью теста Манна-Уитни. P
&л;. 0,05 считали значимым
<р> В общей сложности 75 случаев дифференцированной GC были проанализированы в данном исследовании. Срезы окрашивали клаудин-18, а уровень окрашивания классифицировали. Claudin-18 был обнаружен в высоких концентрациях в эпителиальных клеток желудка в верхушечных и боковых боковых границ в не-IM, но не в IM или дифференцированных клеток аденокарциномы (рис. 1А). Уровни клаудин-18 были значительно ниже в раковых клетках, чем в не-IM и IM, а также значительно ниже в IM по сравнению с не-IM (рис. 1В).
Обнаружение клаудин-18 в ШС с подслизистых Invasion
<р> Типичные случаи GC с подслизистой вторжения показали, что плотные клаудин-18 окрашивание было видно на инвазивной перед подслизистого вторгся-раковых клеток, и Ki-67 LI был низким на поражение (рис. 2А ). В случае с низкой клаудин-18 окрашивания при инвазивной перед подслизистого вторгся-раковых клеток, Ki-67 LI был высоким на поражения (рис. 2А).
Корреляция уровня Claudin-18 и Ki -67 LI
<р> Ki-67 LI ГК в слизистой оболочке и подслизистой определяли процент Ki-67-положительных ядер. Для того, чтобы определить корреляцию между Ki-67 LI и уровень клаудин-18, корреляционный анализ был проведен. Уровень экспрессии через слизистую оболочку из Claudin-18 не был достоверно коррелирует с Ki-67 LI (Rs = 0,07, P =
0,60). С другой стороны, уровень экспрессии подслизистой клаудин-18 была значительно обратно пропорциональна подслизистую Ки-67 LI (Rs = -0,550, <ЕМ> P
= 0,0010) (рис. 2в).
<Н3> Влияние Claudin-18 миРНК на пролиферацию и инвазии клеток GC
<р> линия GC клеток, MKN74, конститутивно экспрессируется клаудин-18, а уровень мРНК Claudin-18 была значительно снижена миРНК против claudin- 18 (рис. 3А). Иммунофлуоресцентное окрашивание с клаудин-18 также снизились после трансфекции (фиг. 3б). В клаудин-18-саморегулируемый MKN74, рост клеток была значительно увеличена (рис. 4, а), и вторжение клеток была значительно увеличена (рис. 4В).
Обсуждение
<р> измененную экспрессию из claudins на подслизистой инвазивная фронт может быть связано с прогрессированием GC. Недавние исследования показывают, что даже в слегка подслизистых инвазивной GC без лимфатической и сосудистой инвазией, ESD может быть осуществимо в качестве лечебной работе [19]. Тем не менее, до сих пор не ясно, какие случаи слегка подслизистых инвазивной GC может следовать без дальнейшей операции после ОУР. В настоящем исследовании было установлено, что существует обратная связь между уровнем клаудин-18 и Ki-67 позитивности при инвазивном перед подслизистой инвазивной GC, и что клаудин-18 регулируемых вторжение ГХ и пролиферации клеток. Ki-67 иммуногистохимии был заменен на митотическую подсчета при оценке пролиферации опухолевых клеток. Исследования показали, что Ki-67 коррелирует с недифференцированными и метастатических клеток в злокачественных опухолях [20]. В этом исследовании было изучено только ЭМИ /ESD-иссекают GC, в котором показание ограничивается дифференцированного типа GC. Таким образом, эти данные указывают на то, что уровень Ki-67 при инвазивном фронте было связано с метастатических клеток в злокачественных опухолях, и что потеря клаудин-18 был одним из маркеров GC агрессивностью и могут быть связаны с развитием метастаз, что обусловливает необходимость дополнительные операции после обработки ESD
<р> Claudins ненормально регулируется в различных злокачественных опухолей, таких как GC, печеночно-клеточной карциномы, карциномы желчных путей, рак молочной железы, почечно-клеточного рака, и мезотелиомы [15], [21] -. [ ,,,0],25]. Изменение в claudins на перекрестках связано с потерей плотного сцепления и полярности в эпителии. Потеря полярности связано с увеличением клеточной пролиферации и эпителиальные к мезенхимальных перехода, в то время как нарушения в плотных соединений комплексов изменяют межклеточных взаимодействий, которые связаны с инвазии и метастазированию [23], [26], [27]. В наблюдательных исследованиях, уменьшается в клаудин-3 и -4 сообщили в GC клетки при инвазивном фронте и было обнаружено, коррелирует с опухолевой прогрессии и метастазирования [14]. Понижающую регуляцию claudins также сообщалось в некоторых других эпителиальных опухолей, в том числе потерю клаудин-1 при раке молочной железы [28] и рака толстой кишки [29], а также к потере клаудин-7 рака молочной железы [30] и рак головы и шеи [31]. Что касается вторжения опухолевых клеток, пониженную экспрессию Claudin-7 на инвазивной фронте было установлено, что коррелирует с глубиной инвазии и лимфатического участия в плоскоклеточного рака пищевода [32]. Хотя клаудин-3 и Claudin-7 выражения были в подслизистом инвазивного перед ниже, чем в слизистой оболочке поражений в нашем предыдущем исследовании, клаудин-3 и клаудин-7 уровней на инвазивной фронте не были соотнесены с Ki-67 LI [15]. С другой стороны, клаудин-18 при инвазивном фронте было обратно пропорционально коррелирует с Ki-67 LI в настоящем исследовании. Эти данные могут быть связаны с выводами, которые клаудин-3 и клаудин-4 не были связаны с метастазов в лимфатических узлах [33]. Кроме того, эти наблюдательные исследования не могут объяснить, являются ли эти изменения непосредственно влияют на опухолевой инвазии и метастазированию.
<Р> Claudin-18 в основном выражается в желудке и легких эпителиальных клеток. Claudin-18a2 является формой для желудка, и изоформы немного отличаются. В предыдущем докладе, тип желудка клаудин-18 был потерян в ГКС [17]. Тем не менее, во время кишечной метаплазией, паттерн экспрессии claudins уже отличается от нормального желудка эпителии. Было обнаружено, что исчезновение клаудин-18, связаны с кишечной метаплазией в желудке [17]. Таким образом, потеря экспрессии клаудин-18 в пожилом GC [17] не может просто продемонстрировать характер рака. Даже в процессе прогрессии GC, уровень экспрессии может измениться. Чтобы изучить функцию этих молекул-мишеней, мы думали, что это было важно исследовать опухоли на той же стадии, и мы оценили уровень Claudin-18, которые могут повлиять на инвазию и метастазирование, в слегка подслизистых инвазивные GC поражений. Кроме того, через слизистую оболочку желудка клаудин-18 не может работать только при TJs, так как выраженная локализация на поверхности клетки, а не просто на TJs. Дальнейшие исследования необходимы для изучения физиологических и патофизиологических выражений TJ белка на боковой мембране.
<Р> Чтобы проверить ли изменения в уровнях Claudin-18 в подслизистом инвазивной фронта способствовали распространению и инвазии раковых клеток, миРНК подход был использован для нокдаун белка в клеточной линии MKN74 GC, который является положительным для Claudin-18. Таким образом, данное исследование показало, впервые функцию Claudin-18 в ГХ с использованием генетического подхода, и что потеря Claudin-18 принимал участие как в пролиферации и инвазии GC клеток. Вместе с этими данными, потеря Claudin-18 в подслизистую инвазивного перед указывало на приобретение более агрессивных характеристик и может позволить межклеточную диссоциации во время вторжения. Тем не менее, ограничение этого исследования состояла в том, что только MKN74 можно было бы изучить, потому что это был единственный дифференцированная клетку рака желудка линии, которая выражается клаудин-18, насколько мы рассмотрели. Таким образом, подобные явления не могут быть воспроизведены с другими желудочными линий раковых клеток.
<Р> И повышающей регуляции и понижающей регуляции claudins было сообщено быть вовлечены в процесс рака [34], [35]. Для анализа функции claudins в раковых клетках, генетические подходы к claudins также сообщалось в различных раковых клетках. Нокдаун клаудин-1, т.е. миРНК приводит к ингибированию миграции в раковых клетках ободочной кишки [36]. Избыточная экспрессия Claudin-6, клаудин-7 или Claudin-9 усиливает инвазивный потенциал желудка линии клеток аденокарциномы [37]. Такое клаудин-индуцированной пролиферации и инвазии может показаться парадоксальным, так как claudins, как известно, участвует в герметичном эпителиальные перекрестки. Эти противоречивые данные свидетельствуют о том, что функции claudins оба subtype- и типа клеток специфичны.
<Р> В качестве ограничения данного исследования, она до сих пор не ясно, что это снижение уровня клаудин-18 в подслизистой инвазивная фронтом является на самом деле участвует в метастазирования рака, потому что трудно следовать естественной истории раннего ШС. Однако данные, приведенные в данном исследовании показали, что более низкий уровень клаудин-18 при инвазивном фронте было связано с большей пролиферативной тенденцией. Необходимо рассмотреть перспективно ли это снижение уровня клаудин-18 может быть использован в качестве метастатический и прогностическую биомаркера после эндоскопического резекции в будущем исследовании.
<Р> Таким образом, было показано, в первый раз, что клаудин-18 гетерогенно выраженный в подслизистую инвазивного перед ранней GC, и понижающую регуляцию клаудин-18 связан с пролиферативной и инвазивной потенциал GC. Эти данные показывают, что клаудин-18 играет ключевую роль в прогрессировании GC и может быть кандидатом биомаркеров прогрессирования заболевания. Клаудин-18 нокдаун эксперимент подтвердил, что подавление Claudin-соединительного 18 способствует пролиферации и вторжение в GC клетки.
Выражение признательности
<р> Мы благодарим г-жу Норико Камия за техническую помощь.
Пептид паучьего яда может помочь снять боль при синдроме раздраженного кишечника
Язвенный колит и отсутствие микробов в кишечнике
Ученые превращают кровь группы A в универсальную кровь типа O,
Аллергии, связанные с повышенным потреблением нездоровой пищи,
Анализ крови на микробную ДНК может предупредить о раке
Проблемы роста у недоношенных детей, связанные с измененными кишечными бактериями
Болезнь Паркинсона можно предотвратить с помощью кишечных микробов
Один из распространенных кишечных организмов, который помогает нам лучше переваривать пищу, также может быть мощным инструментом в предотвращении или обращении симптомов болезни Паркинсона (БП). согла
Бактериофаги могут лечить кишечную палочку, не повреждая кишечник,
новое исследование говорит Исследователи из США разработали новую терапию, в которой для лечения инфекций, вызванных кишечной палочкой, используется уникальный бактериофаг. Было обнаружено, что бактер
Инфекция SARS-CoV-2 продлевает выделение вируса и потерю лимфоцитов у онкологических больных
Пациентам с онкологическими заболеваниями труднее переносить инфекции во время прохождения лечения, что подвергает их высокому риску тяжелого заболевания и смерти от COVID-19. Тем не мение, Как корона