PLoS One: leszabályozza a claudin-18 társított proliferatív és inváziós potenciált a gyomorrák a Invazív Front

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A claudinok ismert tight junction fehérjék, és expressziós mintázatot gyomorrák továbbra is ellentmondásos. A kapcsolat a expressziós mintázata tight junction fehérjék és a daganatos burjánzását korai gyomorrák még távolról sem egyértelmű. Katalógusa

Célok katalógusa

Annak vizsgálatára expressziós mintázatát a claudin-18 és a Ki-67 korai gyomorrák az invazív első és a környező normális gyomor nyálkahártyáját, és vizsgálja a biológiai funkcióját claudin-18 proliferációs és invázió a rákos sejteket. katalógusa

módszerek katalógusa

hetvenöt korai gyomorrák elváltozások keresztül eltávolítható endoszkópos nyálkahártya reszekció vagy endoszkópos nyálkahártya alatti reszekció értékeltük. Minden gyomor rákos elváltozást diagnosztizáltak a differenciált adenocarcinoma a japán osztályozása gyomorrák. Annak megállapítására, hámsejtek szaporodását, immunfestés Ki-67 hajtottunk végre, és a címkézés indexet. Annak megállapítására, a kifejezés epithelialis tight junction fehérjék immunfluoreszcens festését claudin-18 végeztünk. Immunreaktivitására claudin-18 szerint osztályozzák száma festett sejtek. Korreláció analízist Spearman korrelációs együttható. Transzfekció claudin-18 kis interferáló RNS (siRNS) sikerült elérni MKN74, a claudin-18-pozitív gyomorrák sejtvonal, hogy vizsgálja meg a hatását a claudin-18 szaporodási és invázió a rákos sejteket. Katalógusa

Eredmények

a claudin-18 szignifikánsan lefelé szabályozni a gyomorrák képest környező gyomor nyálkahártya normális vagy intestinalis metaplasia. A Ki-67 index a gyomorrák, a invazív elülső fordítottan korrelált a claudin-18 szinten, hanem hogy a nyálkahártya-elváltozás nem korrelált. A claudin-18 knockdown jelentősen elősegítette elterjedése MKN74, mint a kontroll siRNS-transzfektált sejtekben. MKN74 invázió jelentősen nőtt a claudin-18-siRNS transzfekció, mint a kontroll siRNS transzfekció.

Következtetések

down-regulációja claudin-18 kapcsolatban van a proliferatív potenciállal az invazív elülső gyomorrák, ami arra utal, hogy van egy központi szerepet gyomorrák progresszióját.

bevezető hivatkozás: Oshima T, Shan J, Okugawa T, Chen X, Hori K, Tomita T., et al. (2013), leszabályozza a claudin-18 társított proliferatív és inváziós potenciált a gyomorrák a Invazív Front. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10,1371 /journal.pone.0074757 katalógusa

Szerkesztő: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: 2013. május 28; Elfogadva: augusztus 6, 2013; Megjelent: szeptember 20, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Oshima és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta az Oktatási Minisztérium, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai Japán keresztül Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 2010-2012 (No. 22590691). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a negyedik leggyakrabban diagnosztizált rosszindulatú daganat, és a második leggyakoribb oka a rákhoz kapcsolódó mortalitás világszerte [1], [2]. Intramucosalis GC lehet kuratív kezelni endoszkópos kezelés. Továbbá az endoszkópos nyálkahártya alatti boncolás (ESD) technikával bővült a jelzéseket az endoszkópos kezelés és lehetővé en bloc rezekció intramucosalis nagy és kis nyálkahártya alatti invazív korai GC [3]. En bloc reszekciós ESD lehetővé teszi a pontos diagnózis rák mélység [4]. Katalógusa

Tight junction (TJs) szakosodott membrán domének leginkább apikális régióban polarizált epitheliális és az endothel sejtek [5]. Claudin a fő TJ fehérjék; Ezek közé tartozik a legalább 27 tag fehérjék és vannak kifejezve, szövet-specifikus módon [6], [7]. Szabályozzák paracelluláris permeabilitás és létrehozza a hámsejtek polaritás által kerítés funkció [6], [8]. Egyre több újabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a claudin kulcsfontosságú strukturális és funkcionális elemei TJ szálak [6], [9], és ők is döntő szerepet játszanak a tumorok és gyulladásos [10], [11]. Katalógusa

A gyomornyálkahártya mutat sor változás claudin a normál nyálkahártya intestinalis metaplasia és adenocarcinoma. Bár GC nemrégiben sorolják mucin alapú expressziós [12], [13], a claudin-alapú GC besorolás is javasolták [14]. Azt is jelentették, hogy leszabályozza claudin-3 kötődött elterjedése intramucosalis GC [15]. Nemrégiben claudin-18 knock-out egerekben kimutatták, hogy a gyomor nyálkahártya sorvadás és paracelluláris H ^{+ ionkiáramlási [16]. Claudin-18a2-ben kimutatták, hogy gyakran le-szabályozott GC egy bél fenotípust, ami arra utal, hogy a claudin-18a2 lenne jó markere GC [17]. Azonban a biológiai funkciója claudin-18, amely érintett lehet a rákos sejtek viselkedésének, még soha nem vizsgálták. Továbbá, hogy nem egyértelmű, hogy melyik jellemző GC sejtek invazív elülső kapcsolódik a gyors növekedés vagy agresszivitása invázió.}

A jelen vizsgálatban az expressziós szint a claudin-18 GC az invazív elülső és a környező gyomornyálkahártya vizsgáltuk először, és a korreláció a claudin-18 szint és a Ki-67-index (LI) GC értékeltük. A hatás a claudin-18 proliferációs és invazív in vitro katalógusa is vizsgálták. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

A betegek katalógusa

A egymást követő sorozata 74 beteg korai GC vizsgálták (1. táblázat). GC elváltozások (n = 75) átesett gyógyító EMR vagy ESD értékeltük. GC a nyálkahártya alatti invázió (n = 31) vontunk be a vizsgálatba. Dupla rákos elváltozást észlelt csak egy férfi beteg. Mind a GC sorolták differenciált adenocarcinoma a japán osztályozása gyomor karcinóma [18]. Beteg anonimitás megőrizte. Ezt a vizsgálatot végeztek összhangban nyilatkozatot Helsinki és hagyta jóvá az etikai bizottság /Intézményi Review Board Hyogo College of Medicine. A téma adott írásos beleegyezését. Katalógusa

Az immunhisztokémiai katalógusa

A mintákat fixáltuk 10% -os formalin oldatban és paraffinba ágyaztuk. Metszeteket vágtunk a 3 um vastagságú és megfestjük hematoxilinnel és eozinnal (HE). Annak megállapítására, epiteliális proliferáció, a mintákat inkubáltuk Ki-67 monoklonális antitest (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), majd inkubálás biotinilezett ló-anti-egér szekunder antitesttel (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A streptavidin-biotin komplex módszer (Vector Laboratories) használtunk, hogy szemléltesse a immunreaktivitást. A sejtmagokat hematoxilinnel ellenfestettük.

immunfluoreszcens festése junkcionális fehérjék

nyúl anti-claudin-18 poliklonális antitest (Invitrogen), és Cy3-konjugált kecske anti-nyúl IgG-t (Jackson Immuno Laboratories, West Grove , PA, USA) másodlagos antitestet használtunk láthatóvá immunreakció. A reakció specificitásának úgy vizsgáltuk, inkubálás nem-immun nyúl szérummal (Dako, Glostrup, Dánia).

Scoring immunfestés claudin-18 és a Ki-67

immunreaktivitást értékeltük két független megfigyelő (T.Ok., XC), és a két vak volt klinikopatológiai jellemzők és klinikai eredmények, melyek az egyes mintát. Nem daganatos gyomornyálkahártya nélkül intestinalis metaplasia (nem IM) és az intestinalis metaplasia (IM) és a rák régiók értékelték. Immunreaktivitására claudin-18 osztályozás a következő kritériumok alapján: 0, nincs membránfestôdés; 1+, kevesebb, mint 10% a tumorsejtek teljes membrán folt; 2+, 10% és 50% tumor sejtek teljes membránfestődés látható; 3+, több mint 50% -ról 75% tumorsejtek teljes, erős membrán festődés; és 4+, több mint 75% a sejtek teljes, nagyon erős membrán festődést. Öt nagy teljesítményű területeken elemeztük az egyes régiókban az esetek és az átlagos pontszám számítottuk. Az összes szakasz pontoztuk kétszer megerősíteni a reprodukálhatósága az eredményeket. A Ki-67 index számítottuk után számítva 1000 rákos sejteket. Katalógusa

kis interferáló RNS (siRNS) Kiütés kísérletek katalógusa

A siRNS elnémítása emberi claudin-18, ON-cél plusz SMARTpool és egy nem specifikus kontroll siRNS-t vásárolt Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). A MKN74 sejtvonal (japán Collection of Research Bioresources Cell Bank, Osaka, Japán), amely CLDN18 katalógusa-pozitív, került kiválasztásra hatásának vizsgálata claudin-18 knockdown a proliferáció és invázió tulajdonságait GC sejtek . A sejteket transzfektáltuk 25 nM siRNS felhasználásával DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Kontroll és kontroll siRNS csoportot kezeltünk a transzfekciós reagensek nélkül siRNS és a transzfekciós reagensek nem-specifikus kontroll siRNS, ill. A vizsgálatokat végeztük 3 napon belül a MKN74 sejteket transzfektáltuk.

Cell Proliferation Assay

A sejtproliferációt úgy határoztuk meg, kolorimetriás vizsgálattal a sejtek életképességének alapuló hasítása a tetrazólium-só WST-1 által mitokondriális dehidrogenázok (Takara Bio Inc., Otsu, Japán). Abszorpciós formazán festék képződik, amely korrelál a számát metabolikusan aktív sejtek a tenyészetben mértük 450 nm-en 1 órán hozzáadása után a reagenst.

Invasion Assay

MKN74 sejtek invázióját vizsgáltuk a 24-lyukú Biocoat Matrigel inváziós kamrák (8 jim; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Az alsó kamrák tele voltak RPMI1640 10% FBS-sel, és a sejteket (2 × 10 ^{5) helyeztünk a betét kamrák, amely tartalmazta RPMI1640 FBS nélküli. Miután 24 óra inkubáció után a sejteket eltávolítottuk noninvazív egy vattacsomót. A sejtek, amelyek vándorolt ​​a membránon keresztül, és beragadt az alsó felület a membrán fixáltuk 10% -os formalin és megfestettük hematoxilinnal. A mennyiségi meghatározás a sejteket mikroszkóp alatt megszámoltuk az öt random nagy teljesítményű területeken. A vizsgálatokat három párhuzamosban hajtjuk végre. Az invázió arány vezérlésére közepes számítottuk.}

Statisztikai elemzés

A statisztikai kiértékelést végeztünk SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Korreláció analízist Spearman korrelációs koefficiens (rs). Többszörös összehasonlítást végeztünk a Kruskal-Wallis-teszt majd Scheffe-teszt. Egységes összehasonlítást végeztünk a Mann-Whitney tesztet. P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Expression of claudin-18 gyomornyálkahártya és karcinóma katalógusa

Az összesen 75 differenciált GC esetekben elemeztük ebben a vizsgálatban. A metszeteket festettük claudin-18, és a szint a festést osztályozni. A claudin-18 volt kimutatható magas szinten gyomornyálkahártya sejtek apicalis és oldalsó határai nem IM de nem IM vagy differenciált adenocarcinoma sejtek (1A.). A szinteket a claudin-18 szignifikánsan alacsonyabbak voltak a rákos sejtekben, mint a nem-IM és IM, valamint jelentősen alacsonyabb, mint a PM nem IM (ábra. 1B). Katalógusa

kimutatása claudin-18 GC és a nyálkahártya alá Invasion katalógusa

képviselő GC esetben a nyálkahártya alatti invázió megmutatta, hogy sűrű claudin-18 festés nyilvánvaló volt az invazív előtt submucosalis megszállták rákos sejteket, és a Ki-67 index alacsony volt az elváltozás (2A. ). Abban az esetben, alacsony claudin-18 festődés az invazív elülső nyálkahártya alatti megszállták-rákos sejtek, Ki-67 LI magas volt, az elváltozás (ábra. 2A).

korrelációja claudin-18 szint és a Ki -67 LI

a Ki-67 LI GC a nyálkahártya és a nyálkahártya alatti szövetre úgy határozzuk meg, a százalékos Ki-67-pozitív magok. Annak megállapításához, a korreláció a Ki-67 index és a claudin-18 szintjén, korrelációs analízist végeztünk. A nyálkahártya expressziós szintje a claudin-18 nem volt szignifikáns korrelációt mutatott a Ki-67 index (rs = 0,07, P = 0,60 katalógusa). Másrészt, a nyálkahártya alatti claudin-18 expressziós szintje szignifikánsan fordítottan korrelált a nyálkahártya alatti Ki-67 LI (RS = -0,550, P
= 0,0010) (ábra. 2b).

Effect claudin-18 siRNS a proliferáció és invázió GC Cells katalógusa

a GC sejtvonal MKN74, konstitutív kifejezett claudin-18, és az mRNS szinten claudin-18 szignifikánsan csökkentette elleni siRNS claudin- 18 (3A.). Immunfluoreszcens festés claudin-18 is csökkent transzfekció után (ábra. 3B). A claudin-18 alulszabályozott MKN74, sejtnövekedés szignifikánsan emelkedett (4A.), És az invázió a sejtek szignifikánsan emelkedett (ábra. 4B).

Discussion

megváltozott expressziója claudin a nyálkahártya alatti invazív első összefüggésben lehet a progresszió GC. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy még a kissé submucosalis invazív GC nélkül nyirok- és vaszkuláris invázió, ESD lehetséges lenne, mint egy gyógyító működés [19]. Azonban még mindig nem világos, hogy mely esetekben kissé nyálkahártya alatti invazív GC lehet követni minden további nélkül a műtét után ESD. A jelen vizsgálatban azt találták, hogy volt egy fordított korrelációt claudin-18 szint és a Ki-67 pozitivitás az invazív elülső nyálkahártya alatti invazív GC, és hogy a claudin-18 szabályozott GC sejtek invázióját és proliferációját. Ki-67 immunhisztokémia szubsztituálva lett mitotikus számlálás értékelésekor a tumorsejtek proliferációját. Vizsgálatok kimutatták, hogy a Ki-67 összefüggésben van differenciálatlan és metasztázisos sejtek malignus [20]. Ebben a vizsgálatban csak EMR /ESD-kimetszett GC, amelyben a jelzés arra korlátozódik, hogy a differenciált típusú GC vizsgáltuk. Ezért ezek az adatok azt mutatták, hogy a Ki-67 szintet invazív elülső volt kapcsolatos metasztázisos sejtek rosszindulatú folyamatok, és hogy a veszteség a claudin-18 volt az egyik marker GC agresszivitás és összefüggésben lehet a fejlesztés a metasztázis, ami szükségessé további műtét után ESD kezelést.

claudinok abnormálisan szabályozott a különböző rosszindulatú folyamatok, például GC, hepatocelluláris karcinóma, epevezeték karcinóma, emlőrák, vesesejt-karcinóma, és mesothelioma [15], [21] - [ ,,,0],25]. A változás a claudin csomópontoknál társul elvesztése szoros tapadás és polaritás hámban. Elvesztése polaritás esetén növekszik a sejt proliferáció és epithelialis-mesenchymalis az átmenet, míg zavarok tight junction komplex változtatja a sejt-sejt kölcsönhatások, amelyek kapcsolódnak az invázió és metasztázis [23], [26], [27]. A megfigyeléses vizsgálatok, csökken a claudin-3 és -4 számoltak be GC sejtek invazív elöl és korrelációt mutatnak a rák kifejlődésének és metasztázis [14]. Down-regulációja claudinok is beszámoltak néhány más epiteliális tumorok, beleértve az elmaradt claudin-1 emlőrák [28] és a vastagbél rák [29], valamint a veszteség a claudin-7 emlőrákos [30] és fej-nyak rák [31]. Ami az invázió tumorsejtek, csökkent expressziója claudin-7-ben a invazív elülső megállapították, hogy korrelál a mélysége invázió és nyirokrendszeri bevonása laphámsejtes karcinóma, a nyelőcső [32]. Bár a claudin-3 és claudin-7 kifejezések alacsonyabb volt a nyálkahártya alatti invazív előtt, mint a nyálkahártya elváltozások a korábbi vizsgálatban, claudin-3 és claudin-7 szinten az invazív előtt nem korrelált a Ki-67 index [15]. Másrészt, a claudin-18 az invazív elülső fordítottan korrelált a Ki-67 LI a jelen tanulmányban. Ezek az adatok lehetnek kapcsolatban a megállapítást, hogy a claudin-3 és claudin-4-et nem kapcsolódó nyirokcsomómetastasis [33]. Ráadásul ezek a megfigyeléses vizsgálatok nem tudja megmagyarázni, hogy ezek a változások közvetlenül érintik a tumor invázió és metasztázis. Katalógusa

A claudin-18 elsősorban kifejezni gyomor és tüdőhámsejtekhez. A claudin-18a2 az űrlapot a gyomor és a izoforma kissé eltérő. Egy korábbi jelentés, gyomor típusú claudin-18 elveszett GC [17]. Során azonban a bél metaplázia, expressziós mintázata claudinok már eltér a normál gyomor hámban. Az eltűnése claudin-18 Azt találtuk, hogy társítható intesztinális metaplázia a gyomorban [17]. Ezért a veszteség a claudin-18 expresszió fejlett GC [17] nem egyszerűen mutatják a karakter a rák. Még a folyamat a GC progresszió, az expressziós szintje változhat. Felfedezni a funkciója a cél molekulák, úgy gondoltuk, fontos megvizsgálni daganatok ugyanazon szakaszában, és értékeltük a szint claudin-18, amely érintheti invázió és metasztázis, enyhén nyálkahártya alatti invazív GC elváltozások. Továbbá, a gyomor nyálkahártya claudin-18 nem működnek éppen TJs, mert az expresszált lokalizáció a sejtfelszínen volt nem csak TJs. További vizsgálatok szükségesek, hogy vizsgálja élettani és kórélettani TJ fehérjék expressziója az oldalsó membrán. Katalógusa

Annak vizsgálatára, hogy a változások a claudin-18 szint a nyálkahártya alatti invazív első hozzájárult a proliferáció és invázió a rákos sejtek egy siRNS megközelítést alkalmaztunk a knockdown a fehérje a MKN74 GC sejtvonal, ami pozitív claudin-18. Így a jelen tanulmány azt mutatta, az első alkalommal a funkció a claudin-18 GC készülékkel genetikai megközelítés, hogy a veszteség a claudin-18-ben részt vevő mindkét proliferációját és invázióját GC sejteket. Együtt ezek az adatok elvesztése claudin-18 a nyálkahártya alatti invazív előtt jelezte a megszerzése agresszívabb jellemzők és lehetővé teheti, hogy a sejt-sejt disszociációs alatt invázió. Ugyanakkor a korlátozás az volt, hogy csak a MKN74 lehetne megvizsgálni, mert ez volt az egyetlen differenciált gyomorrák sejtvonalon kifejezett claudin-18, amennyire azt vizsgáltuk. Ezért hasonló jelenséget nem lehet reprodukálni más gyomor rákos sejtvonalak. Katalógusa

Mindkét up-szabályozás és leszabályozza claudin leírták, hogy részt vesz a daganatos folyamatban [34], [35]. Az elemzéshez a függvény claudinok a rákos sejtekben, a genetikai megközelítések claudinok is beszámoltak a különböző rákos sejteket. Kiütése claudin-1 által siRNS eredményezte a gátlás a migráció vastagbél rákos sejtekben [36]. A túlzott mértékű expressziója a claudin-6, claudin-7, vagy claudin-9 fokozott invazív potenciálját egy gyomor adenokarcinóma sejtvonal [37]. Ilyen claudin-indukálta proliferáció és invázió tűnhet paradox, mert a claudin ismert, hogy részt vesz a tömítő epithelialis csomópontokban. Ezek ellentmondásos adatok arra utalnak, hogy a funkciók claudin egyaránt subtype- és sejttípus-specifikus. Katalógusa

Mivel a korlátozás a jelen tanulmány, még mindig nem világos, hogy ez a csökkent claudin-18 szintjén a nyálkahártya alatti invazív front valóban szerepet játszanak a rák áttétek, mert nehéz követni a természetrajzi korai GC. Ugyanakkor az adatok ebben a tanulmány kimutatta, hogy egy alacsonyabb claudin-18 szintet invazív elülső társult nagyobb proiiferatív tendencia. Meg kell prospektív vizsgálata, hogy ez a csökkenés a claudin-18 szint lehet használni, mint egy áttétes és prognosztikai biomarker után endoszkópos reszekció egy jövőbeli tanulmány.

Összefoglalva, kimutatták az első alkalom, hogy claudin-18-heterogén módon expresszálódik a nyálkahártya alatti invazív elülső korai GC, és down-regulációja claudin-18 kapcsolatban van a proliferatív és invazív potenciálját GC. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a claudin-18 rendelkezik egy központi szerepet a progressziót GC, és lehet egy jelölt biomarker a betegség progresszióját. A claudin-18 knockdown kísérlet megerősítette, hogy elnyomása junctionalis claudin-18 elősegítette a proliferáció és invázió GC sejteket. Katalógusa

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönjük Ms. Noriko Kamiya a technikai segítségnyújtás. Katalógusa

• PLoS One: Tetrandrine indukál mitokondriumok által közvetített apoptózist Emberi gyomorkarcinóma BGC-823 sejteket
• PLoS One: Helicobacter pylori fertőzés szinergista Három gyulladással kapcsolatos genetikai variánsai a GWASs növeli a kockázatot a gyomorrák a kínai népesség