PLoS ONE: Down-Regulation der Claudin-18 ist im Zusammenhang mit der proliferativen und Invasionspotential von Magenkrebs in der invasiven Front

Abstrakt

Hintergrund

Claudins als tight junction-Proteine ​​bekannt sind, und deren Expressionsmuster bei Magenkrebs ist nach wie vor umstritten. Die Beziehung zwischen den Expressionsmuster von Tight-Junction-Proteine ​​und Tumorproliferation in der frühen Magenkrebs ist bei weitem noch nicht klar.

Ziele

die Expressionsmuster von Claudin-18 und Ki-67 zu untersuchen, in Magenfrühkarzinomen bei der invasiven Front und umgebenden normalen Magenschleimhaut und die biologische Funktion von Claudin-18 in der Proliferation und Invasion von Krebszellen zu untersuchen.

Methoden

Fünfundsiebzig Magenfrühkarzinomen Läsionen über EMR oder endoskopische Submukosa-Resektion entfernt wurden ausgewertet. Alle Magenkrebs Läsionen wurden als differenziertes Adenokarzinom mit der japanischen Klassifikation von Magenkarzinom diagnostiziert. Zur Beurteilung Epithelproliferation, Immunfärbung mit Ki-67 wurde durchgeführt, und der Markierungsindex wurde berechnet. Um die Expression von epithelialen tight junction-Proteine, Immunfluoreszenzfärbung von claudin-18 Beurteilung wurde durchgeführt. Die Immunreaktivität von claudin-18 wurde nach der Anzahl der gefärbten Zellen sortiert. Die Korrelationsanalyse wurde von Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten durchgeführt. Die Transfektion von Claudin-18 small interfering RNA (siRNA) in MKN74, einem Claudin-18-positiven Magenkrebs-Zelllinie durchgeführt, um die Wirkung von Claudin-18 auf die Proliferation und Invasion von Krebszellen zu untersuchen.

Ergebnisse

Claudin-18 war signifikant herunterreguliert bei Magenkrebs im Vergleich zu Magen normalen Schleimhaut oder intestinale Metaplasie umgibt. Der Ki-67 Markierungsindex von Magenkrebs bei der invasiven Front wurde umgekehrt mit dem Claudin-18-Ebene korreliert sind, sondern dass an der Schleimhaut Läsion wurde nicht korreliert. Claudin-18 Zuschlags gefördert signifikant die Proliferation von MKN74 verglichen mit Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen. MKN74 Invasion stieg signifikant mit Claudin-18 siRNA-Transfektion verglichen mit Kontroll-siRNA-Transfektion.

Schlussfolgerungen

Die Herunterregulierung von Claudin-18 mit dem proliferativen Potential an der invasiven Front von Magenkrebs assoziiert ist, was darauf hindeutet, dass es eine zentrale Rolle bei Magenkrebs Progression hat

Citation:. Oshima T, Shan J, Okugawa T, Chen X, Hori K, Tomita T, et al. (2013) Down-Regulation der Claudin-18 ist im Zusammenhang mit der proliferativen und Invasionspotential von Magenkrebs in der invasiven Front. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10.1371 /journal.pone.0074757

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 28. Mai 2013; Akzeptiert: 6. August 2013; Veröffentlicht: 20. September 2013

Copyright: © 2013 Oshima et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan durch einen Zuschuss-in-Aid for Scientific Research (C) 2010-2012 (Nr 22590691) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die am vierthäufigsten diagnostizierte Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1], [2]. Intramuköser GC kann kurativ durch endoskopische Behandlung behandelt werden. Darüber hinaus hat die endoskopische Submukosa-Dissektion (ESD) Technik, um die Indikationen für die endoskopische Behandlung erweitert und en bloc Resektion von intramukosalen groß aktiviert und submuköse leicht invasive frühe GCs [3]. Ein en-bloc-Resektion durch ESD ermöglicht eine genaue Diagnose von Krebs Tiefe [4].

Tight Junctions (TJs) sind spezialisierte Membrandomänen am meisten Apikalbereich polarisierten Epithel und Endothelzellen [5]. Claudins sind die wichtigsten TJ-Proteine; sie bestehen aus mindestens 27 Element Proteine ​​und werden in einer gewebespezifischen Weise exprimiert [6], [7]. Sie regulieren die parazelluläre Permeabilität und etablieren epithelialen Zellpolarität durch ihre Zaunfunktion [6], [8]. Eine wachsende Zahl von jüngsten Anzeichen dafür, dass Claudine sind wichtige strukturelle und funktionelle Komponenten von TJ-Stränge [6], [9], und sie können eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung und Entzündungen [10], [11].

Die Magenepithel weist eine Reihe von Veränderungen in claudin Expression von normalen Schleimhaut intestinale Metaplasie und Adenokarzinom. Obwohl GCs kürzlich von Mucin-basierte Expressions klassifiziert wurden [12], [13], einem claudin basierte Klassifizierung GC wurde ebenfalls vorgeschlagen [14]. Wir haben auch berichtet, dass die Herunterregulierung von claudin-3 auf die Proliferation von intramuköse GC verbunden war [15]. Vor kurzem Claudin-18-Knock-out-Mäuse wurden Magenschleimhaut Atrophie und parazellulär H ^{+ -Ionen Leckage [16] haben gezeigt. Claudin-18A2 wurde gezeigt, häufig herunterreguliert in GC eines Darm-Phänotyp zu sein, dass Claudin-18A2 was darauf hindeutet, wäre ein guter Marker für GC sein [17]. Die biologische Funktion von claudin-18, die in Krebszellverhalten beteiligt sein könnten, wurde untersucht, nie jedoch wurde. Darüber hinaus ist es nicht klar, welche charakteristisch für GC-Zellen an der invasiven Front des schnellen Wachstums oder Aggressivität der Invasion in Zusammenhang steht.}

In der vorliegenden Studie wurde die Expression von Claudin-18 im GC an der invasiven Front und die umliegenden Magenschleimhaut wurde zum ersten Mal untersucht, und die Korrelation zwischen dem Claudin-18-Ebene und der Ki-67-Markierungen-Index (LI) in GC bewertet. Die Wirkung von Claudin-18 auf die Proliferation und Invasivität In-vitro-
wurde ebenfalls untersucht.

Materialien und Methoden

Patienten

Eine konsekutive Serie von 74 Patienten mit frühen GC wurden untersucht (Tabelle 1). GC-Läsionen (n = 75), die kurative EMR oder ESD unterzogen hatten, wurden ausgewertet. GCs mit submucosalem invasion (n = 31) wurden in die Studie einbezogen. Doppelkrebserkrankungen wurden nur in einem männlichen Patienten nachgewiesen. Alle von der GC wurden als differenziertes Adenokarzinom mit der japanischen Klassifikation von Magenkarzinom [18] eingestuft. Patienten Anonymität blieb erhalten. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki durchgeführt und wurde von der Ethikkommission /Institutional Review Board von Hyogo College of Medicine zugelassen. Das Thema gab informierte Zustimmung geschrieben.

Immunhistochemie

Die Proben wurden mit 10% Formalin-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte wurden zu 3 &mgr; m Dicke geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Zur Beurteilung Epithelproliferation wurden Proben mit Ki-67 monoklonaler Antikörper (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), gefolgt von einer Inkubation mit biotinyliertem Pferd-anti-Maus-Sekundärantikörper (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) inkubiert. Die Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode (Vector Laboratories) wurde verwendet, um die Immunreaktivität zu visualisieren. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.

Immunofluoreszenzfärbung von Junctional Proteine ​​

Rabbit anti-claudin-18 polyklonaler Antikörper (Invitrogen) und Cy3-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, USA) sekundäre Antikörper wurden verwendet, Immunreaktivität zu visualisieren. Die Spezifität der Reaktion wurde durch Inkubation getestet mit nicht-immunem Kaninchenserum (Dako, Glostrup, Dänemark).

Scoring von Immunfärbung von Claudin-18 und Ki-67

Immunreaktivität wurde bewertet, indem zwei unabhängige Beobachter (T.Ok., XC), und beide waren blind für die klinisch-pathologischen Eigenschaften und klinische mit jeder Probe assoziiert Ergebnisse. Nicht neoplastischen Magenschleimhaut ohne intestinale Metaplasie (non-IM) und mit intestinalen Metaplasie (IM) und Krebs Regionen wurden beurteilt. Die Immunreaktivität von Claudin-18 wurde anhand der folgenden Kriterien bewertet: 0, das Fehlen von Membranfärbung; 1+, weniger als 10% der Tumorzellen mit kompletten Membran-Färbung; 2 +, 10% bis 50% der Tumorzellen mit kompletten Membranfärbung; 3+, mehr als 50% bis 75% der Tumorzellen mit vollständiger, starke Membranfärbung; und 4+, mehr als 75% der Zellen mit kompletten, sehr starke Membranfärbung. Fünf Hochleistungsfeldern wurden in jeder Region der Fälle und der Mittelwert analysiert wurde berechnet. Alle Abschnitte wurden zweimal erzielte die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu bestätigen. Der Ki-67 LI wurde nach dem Zählen 1000 Krebszellen berechnet.

small interfering RNA (siRNA) Knockdown Experimente

Für siRNA-Silencing des menschlichen Claudin-18, On-Target und Smartpool und einem nicht -spezifische Kontrolle siRNA wurde von Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA) erworben. Die MKN74 Zelllinie (japanische Sammlung von Forschung Bioresources Cell Bank, Osaka, Japan), die CLDN18
-positiver wurde die Wirkung von Claudin-18 Zuschlags auf die Proliferation und Invasion Eigenschaften von GC-Zellen zu studieren ausgewählt . Die Zellen wurden mit 25 nM siRNA unter Verwendung von DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.) transfiziert. Steuerung und Kontrolle siRNA Gruppen wurden mit den Transfektionsreagenzien ohne siRNA und den Transfektionsreagenzien mit unspezifischen Kontroll-siRNA bzw. behandelt. Assays wurden 3 Tage durchgeführt, nachdem die MKN74-Zellen transfiziert wurden.

Cell Proliferation Assay

Die Zellproliferation wurde durch einen kolorimetrischen Test der Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt, basierend auf der Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 durch mitochondriale Dehydrogenasen (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Die Extinktion des Formazan-Farbstoff gebildet wird, die mit der Zahl metabolisch aktiver Zellen in der Kultur korreliert, wurde bei 450 nm 1 h gemessen wird, nachdem das Reagenz hinzugefügt wird.

Invasion Assay

MKN74 Zellinvasion gemäß dem Protokoll des Herstellers, wurde in 24-Well-Biocoat Matrigel Invasionskammern (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 8 um) untersucht. Die unteren Kammern wurden mit RPMI1640 mit 10% FBS gefüllt, und die Zellen (2 × 10 ^{5) wurden in den Einlegekammern angeordnet, die RPMI1640 ohne FBS enthielt. Nach 24 h Inkubation wurden die nicht-invasive Zellen mit einem Baumwolltupfer entfernt. Die Zellen, die durch die Membran und klebte an der unteren Oberfläche der Membran wurden fixiert mit 10% Formalin und gefärbt mit Hämatoxylin gewandert sind. Zur Quantifizierung wurden die Zellen unter einem Mikroskop in fünf zufälligen Hochleistungsfeldern gezählt. Assays wurden dreifach durchgeführt. Die Invasion Verhältnis Mediums zu steuern berechnet.}

Statistische Analyse

Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Die Korrelationsanalyse wurde von Spearman-Rangkorrelationskoeffizient (rs) durchgeführt. Mehrere Vergleiche wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test von Scheffe-Test gefolgt durchgeführt. Einzel Vergleiche wurden durch den Mann-Whitney-Test durchgeführt. P
. ≪ 0,05 wurde als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Tetrandrin Induziert Mitochondrien-vermittelte Apoptose in menschlichen Magenkrebs BGC-823 Zellen
• PLoS ONE: Helicobacter-pylori-Infektion synergizes mit drei entzündungsbedingten Genetische Varianten im Gwäss Risiko von Magenkrebs in einem chinesischen Population