PLoS ONE: stads verordening van Claudin-18 wordt geassocieerd met de proliferatieve en invasieve Potentieel van maagkanker bij de Invasieve Voorzijde

De abstracte

Achtergrond

Claudins staan ​​bekend als tight junction eiwitten en hun expressie patroon bij maagkanker is nog steeds controversieel. De relatie tussen de expressie patronen van de tight junction eiwitten en tumor proliferatie in het begin van maagkanker is nog verre van duidelijk.

Doelstellingen

Om de expressie patronen van claudin-18 en Ki-67 te onderzoeken in vroege maagkanker in de invasieve voorzijde en omringende normale maagslijmvlies en de biologische functie van claudin-18 de proliferatie en invasie van kankercellen te onderzoeken.

Methods

Vijfenzeventig vroege maagkanker laesies verwijderd via endoscopische mucosale resectie of endoscopische submucosale resectie werden geëvalueerd. Alle maagkanker laesies werden gediagnosticeerd als gedifferentieerd adenocarcinoom met behulp van de Japanse classificatie van maagcarcinoom. Om epitheliale proliferatie te beoordelen, immunokleuring met Ki-67 werd uitgevoerd, en de etikettering index werd berekend. Om de expressie van epitheliale tight junction eiwitten te beoordelen, immunofluorescentie kleuring van claudin-18 werd uitgevoerd. De immunoreactiviteit van claudin-18 werd ingedeeld volgens het aantal gekleurde cellen. Correlatie analyse werd uitgevoerd door spearmans rangcorrelatiecoëfficiënt. Transfectie van claudin-18 kleine interfererende RNA (siRNA) werd bereikt in MKN74 een claudine-18-positieve maagkanker cellijn om het effect van claudin-18 op proliferatie en invasie van kankercellen te onderzoeken.

Resultaten

Claudin-18 was significant down-gereguleerd bij maagkanker in vergelijking met omliggende maag normale slijmvlies of intestinale metaplasie. De Ki-67 labeling index van maagkanker bij het invasieve voorzijde is omgekeerd gecorreleerd met de claudin-18 niveau, maar in de mucosale laesie niet gecorreleerd. Claudin-18 knock-down aanzienlijk bevorderde de proliferatie van MKN74 vergelijking met controle-siRNA getransfecteerde cellen. MKN74 invasie verhoogd in claudine-18 siRNA transfectie vergeleken met controle-siRNA transfectie.

Conclusies

Neerregeling van claudin-18 is gekoppeld aan het proliferatieve potentiaal op de invasieve voor maagkanker, hetgeen suggereert dat het een cruciale rol bij maagkanker progressie

Citation:. Oshima T, J Shan, Okugawa T, Chen X, K Hori, Tomita T, et al. (2013) neerwaartse regulatie van Claudin-18 is geassocieerd met de proliferatieve en invasieve potentieel van maagkanker bij het invasieve front. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10.1371 /journal.pone.0074757

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 28 mei 2013; Aanvaard: 6 augustus 2013; Gepubliceerd: 20 september 2013

Copyright: © 2013 Oshima et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan door een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (C) 2010-2012 (nr 22590691). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest gediagnosticeerde maligniteit en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in de wereld [1], [2]. Darmslijmvlies GC kan curatief worden behandeld door endoscopische behandeling. Voorts heeft de endoscopische submucosale dissectie (ESD) techniek de indicaties voor endoscopische behandeling uitgebreid en geactiveerd en bloc resectie van grote darmslijmvlies en enigszins submucosale invasieve vroege GC [3]. Een en bloc resectie van ESD maakt een nauwkeurige diagnose van kanker diepte [4].

Tight junctions (TJS) zijn gespecialiseerd membraandomeinen hooguit apicale gebied van gepolariseerde epitheliale en endotheliale cellen [5]. Claudins zijn de belangrijkste TJ eiwitten; ze bestaan ​​uit ten minste 27 lid eiwitten en worden uitgedrukt in een weefsel-specifieke wijze [6], [7]. Zij regelen paracellulaire permeabiliteit en vestigen epitheelcellen polariteit door hun hek functie [6], [8]. Een groeiende hoeveelheid recente bewijs suggereert dat Claudins zijn belangrijke structurele en functionele componenten van TJ strengen [6], [9], en ze kunnen een cruciale rol spelen bij het ontstaan ​​van tumoren en ontsteking [10] spelen, [11].

De gastrische epitheel vertoont een reeks veranderingen in claudin expressie van normale mucosa intestinale metaplasie en adenocarcinoom. Hoewel GC recent ondergebracht mucine gebaseerde expressiesystemen [12], [13], een claudin gebaseerde GC indeling is ook voorgesteld [14]. We hebben eveneens gemeld dat neerwaartse regulatie van claudin-3 werd met betrekking tot de proliferatie van het darmslijmvlies GC [15]. Recent werden claudine-18 knock-out muizen aangetoond maagslijmvlies atrofie en paracellulair H ^{+ ion lekkage [16] hebben. Claudin-18a2 werd aangetoond dat vaak neerwaarts gereguleerd in GC van een intestinale fenotype suggereert dat claudine-18a2 zou een goede marker voor GC [17]. De biologische functie van claudin-18, die kunnen worden betrokken bij kanker cel gedrag is nooit onderzocht. Verder is het niet duidelijk welke kenmerkend GC cellen bij de invasieve voorzijde is met betrekking tot snelle groei of agressiviteit van invasie.}

In deze studie, het expressieniveau van claudin-18 in de GC invasieve voorkant en omringende maagslijmvlies onderzocht voor de eerste keer, en de correlatie tussen de claudin 18-niveau en de Ki-67 labeling index (LI) in GC geëvalueerd. Het effect van claudin-18 op de proliferatie en invasiviteit In vitro
werd eveneens onderzocht.

Materialen en methoden

Patiënten

Een opeenvolgende reeks van 74 patiënten met vroege GC onderzocht (Tabel 1). GC laesies (n = 75) die curatieve EMR of ESD hadden ondergaan werden geëvalueerd. GC met submucosale invasie (n = 31) werden in deze studie. Double kankers werden gedetecteerd slechts in een mannelijke patiënt. Alle GC geclassificeerd als gedifferentieerd adenocarcinoom volgens de Japanse classificatie van maagcarcinoom [18]. Patiënt anonimiteit werd bewaard. Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de ethische commissie /Institutional Review Board van Hyogo College of Medicine. Het onderwerp gaven schriftelijk informed consent.

Immunohistochemie

De monsters werden gefixeerd met 10% formaline-oplossing en ingebed in paraffine. Secties werden tot 3 urn dikte gesneden en werden gekleurd met hematoxyline en eosine (HE). Om epitheliale proliferatie te beoordelen, werden monsters geïncubeerd met Ki-67 monoklonaal antilichaam (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gevolgd door incubatie met gebiotinyleerd paard-anti-muis secundair antilichaam (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). De streptavidine-biotine complex methode (Vector Laboratories) werd gebruikt om de immuunreactiviteit visualiseren. Kernen werden tegengekleurd met hematoxyline.

immunofluorescentiekleuring van Junctionele Eiwitten

Rabbit anti-claudine-18 polyklonaal antilichaam (Invitrogen) en Cy3-geconjugeerd geit anti-konijn IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, USA) secundair antilichaam gebruikt voor immuunreactiviteit visualiseren. De specificiteit van de reactie werd getest door incubatie met niet-immuun konijnenserum (Dako, Glostrup, Denemarken).

Scoring van Immunokleuring van Claudin-18 en Ki-67

immunoreactiviteit werd geëvalueerd door twee onafhankelijke waarnemers (T.Ok., XC), en beiden waren blind voor de klinisch-pathologische kenmerken en klinische uitkomsten geassocieerd met elk monster. Niet-neoplastische maagslijmvlies zonder intestinale metaplasie (niet-IM) en met intestinale metaplasie (IM) en kanker gebieden werden beoordeeld. De immunoreactiviteit van claudin-18 werd bepaald met behulp van de volgende criteria: 0, afwezigheid van membraan kleuring; 1+, minder dan 10% van tumorcellen complete membraan kleuring; 2+, 10% tot 50% van de tumorcellen met volledige membraankleuring; 3+, meer dan 50% tot 75% van de tumorcellen met volledig, sterke membraankleuring; en 4+, meer dan 75% van de cellen met volledige, zeer sterke membraankleuring. Vijf high-power velden werden geanalyseerd in elke regio van de gevallen en de gemiddelde score berekend. Alle secties werden tweemaal gescoord om de reproduceerbaarheid van de resultaten te bevestigen. De Ki-67 LI werd berekend na het tellen 1.000 kankercellen.

kleine interfererende RNA (siRNA) Knockdown Experimenten

Voor siRNA tot zwijgen brengen van de menselijke claudin-18, on-target plus Smartpool en een niet -specifieke control siRNA werd gekocht van Dharmacon, Inc (Lafayette, CO, USA). De MKN74 cellijn (Japanse Collection of Cell Research Bioresources Bank, Osaka, Japan), die CLDN18
-positieve, werd geselecteerd om de effecten van claudin 18-knockdown op de proliferatie en invasie eigenschappen van GC cellen te bestuderen . Cellen werden getransfecteerd met 25 nM siRNA gebruikt DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Controle en controle siRNA groepen werden behandeld met de siRNA transfectie reagentia zonder de transfectie reagentia met aspecifieke control siRNA, respectievelijk. Assays werden 3 dagen na de MKN74 cellen getransfecteerd.

Cell Proliferation Assay

celproliferatie werd bepaald met een colorimetrische bepaling van cellevensvatbaarheid gebaseerd op de splitsing van het tetrazoliumzout WST-1 door mitochondriale dehydrogenase (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). De absorptie van de gevormde formazan kleurstof, die correleert met het aantal metabolisch actieve cellen in de kweek werd gemeten bij 450 nm 1 uur na toevoegen van het reagens.

Invasion Assay

MKN74 celinvasie werd bepaald in 24-well Biocoat Matrigel invasie kamers (8 um, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) volgens het protocol van de fabrikant. De benedenkamers werden gevuld met RPMI1640 met 10% FBS en cellen (2 x 10 ^{5) werden in het inzetstuk kabinet, RPMI1640 bevatte zonder FBS geplaatst. Na 24 uur incubatie werden de niet-invasieve cellen verwijderd met een wattenstaafje. De cellen die door het membraan gemigreerd en vast aan het onderoppervlak van het membraan werden gefixeerd met 10% formaline en gekleurd met hematoxyline. Voor kwantificatie werden cellen geteld onder een microscoop in vijf willekeurige hoge krachtvelden. Testen werden in drievoud uitgevoerd. De invasie verhouding tot middelgrote controle werd berekend.}

Statistische analyse

Statistische evaluatie werd uitgevoerd met behulp van SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Correlatie analyse werd uitgevoerd door spearmans rangcorrelatiecoëfficiënt (rs). Meervoudige vergelijkingen werden uitgevoerd met de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door testen Scheffe's. Enkele vergelijkingen werden uitgevoerd met de Mann-Whitney-test. P
. ≪ 0,05 werd beschouwd als significant

Resultaten

Expressie van Claudin-18 in maagslijmvlies en carcinoom

Een totaal van 75 gedifferentieerde GC gevallen geanalyseerd in deze studie. De secties werden gekleurd met claudine-18, en de mate van kleuring werd beoordeeld. Claudine-18 werd gedetecteerd in hoge niveaus in maagepitheelcellen de apicale en laterale randen in niet-IM, maar niet in IM of gedifferentieerde adenocarcinoom cellen (Fig. 1A). De niveaus van claudin-18 waren in kankercellen significant lager dan bij niet-IM en IM, maar ook significant lager in vergelijking met niet IM-IM (fig. 1B).

Detectie van Claudin-18 in GC met submucosale invasie

vertegenwoordiger GC gevallen met submucosale invasie bleek dat dichte claudine-18 kleuring was duidelijk aan de invasieve voorzijde van submucosale binnengedrongen-kankercellen, en Ki-67 LI was laag bij de laesie (afb. 2A ). In een geval met lage claudine-18 kleuring op invasieve voor submucosale binnengedrongen-kankercellen, Ki-67 LI was hoog in de laesie (fig. 2A).

Correlatie van de Claudin-18 niveau en Ki -67 LI

de Ki-67 LI GC in mucosa en submucosa werd bepaald door het percentage Ki-67-positieve nuclei. De correlatie tussen de Ki-67 LI en claudin-18 te bepalen, werd correlatieanalyse uitgevoerd. De mucosale expressie niveau van claudin-18 was niet significant gecorreleerd met de Ki-67 LI (rs = 0.07, P =
0,60). Anderzijds, werd de submucosale claudin-18 expressieniveau significant omgekeerd gecorreleerd met de submucosale Ki-67 LI (rs = -0,550, P
= 0,0010) (Fig. 2B).

Effect van Claudin-18 siRNA op de verspreiding en de invasie van GC Cells

Een GC-cellijn, MKN74, constitutief tot expressie claudine-18, en het mRNA niveau van claudin-18 was significant door siRNA verminderd tegen claudin- 18 (Fig. 3A). Immunofluorescentiekleuring met claudine-18 eveneens verlaagd na transfectie (fig. 3B). In claudine-18 neerwaarts gereguleerd MKN74, celgroei aanzienlijk hoger (fig. 4A) en de invasie van de cellen was significant verhoogd (Fig. 4B).

Discussie

Veranderde expressie Claudins van de submucosale invasieve voorzijde kan worden gerelateerd aan de progressie van GC. Recente studies suggereren dat zelfs enigszins submucosale invasieve GC zonder lymfatische en vasculaire invasie, kan ESD haalbaar als curatieve werking [19] zijn. Het is echter nog steeds niet duidelijk welke gevallen een iets submucosale invasieve GC te volgen zonder verdere operatie na ESD. In dit onderzoek werd vastgesteld dat er een omgekeerde correlatie tussen de claudin-18 niveau en Ki-67 positiviteit bij invasieve voor submucosale invasieve GC en dat claudine-18 geregelde GC invasie en proliferatie. Ki-67 immunohistochemie werd vervangen mitotische telling bij de beoordeling tumorcelproliferatie. Studies hebben aangetoond dat Ki-67 is gecorreleerd met ongedifferentieerde en metastatische cellen in tumoren [20]. In deze studie, alleen EMR /ESD-resectie GC waarbij de indicatie wordt beperkt tot de gedifferentieerde aard van GC onderzocht. Daarom zijn deze gegevens blijkt dat de Ki-67 niveau invasieve voorzijde had met metastatische cellen in tumoren, en dat het verlies van claudin-18 één van de merkers van GC agressiviteit en kan worden gerelateerd aan de ontwikkeling van metastasen, die vereist dat extra operatie na behandeling ESD

Claudins abnormaal gereguleerd in diverse kwaadaardigheden zoals GC, hepatocellulair carcinoom, galwegen carcinoom, borstkanker, niercelcarcinoom en mesothelioom [15], [21] -. [ ,,,0],25]. De verandering in Claudins op kruispunten wordt geassocieerd met verlies van strakke hechting en polariteit in epitheel. Verlies van polariteit is geassocieerd met verhoogde cellulaire proliferatie en epitheliale-mesenchymale overgang, terwijl storingen in tight junction complexen wijzigen cel-cel interacties, die verband houden met invasie en metastase [23], [26], [27]. In observationele studies een afname van de claudin-3 en -4 zijn gemeld in GC cellen op het invasieve voorzijde en bleken te correleren met de progressie van kanker en metastase [14]. Neerwaartse regulatie van Claudins is ook beschreven in andere epitheliale tumoren, waaronder begrepen claudine-1 in borstkanker [28] en coloncarcinoom [29], en het verlies van claudin-7 borstkanker [30] en hoofd- en nekkanker [31]. Wat de invasie van tumorcellen, verminderde expressie van claudin-7 aan de voorzijde invasieve bleek te correleren met de diepte van invasie en lymfatische betrokkenheid bij plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm [32]. Hoewel claudine-3 en claudine-7 uitdrukkingen lager in de submucosale invasief voorste dan in mucosale laesies waren in onze eerdere studie werden claudine-3 en claudine-7 niveaus invasieve voorzijde niet gecorreleerd met de Ki-67 LI [15]. Anderzijds werd claudine-18 aan de voorzijde invasieve omgekeerd gecorreleerd met de Ki-67 LI in dit onderzoek. Deze gegevens kunnen verband houden met de bevindingen dat claudin-3 en claudine-4 geen verband hielden met lymfeklier [33]. Bovendien kunnen deze observationele studies niet verklaren of deze veranderingen rechtstreeks van invloed op de tumor invasie en metastase.

-Claudin 18, voornamelijk in de maag en longen epitheelcellen. Claudin-18a2 is het formulier voor de maag, en de isovormen zijn iets anders. In een vorig rapport, werd de maag soort claudine-18 verloor in GC [17]. Tijdens intestinale metaplasie, het expressiepatroon van Claudins verschilt al dan die van de normale maag epitheel. Het verdwijnen van claudin-18 bleek geassocieerd met intestinale metaplasie in de maag [17]. Derhalve kan het verlies van claudin-18 expressie in advanced GC [17] niet alleen tonen de aard van de kanker. Zelfs in het proces van GC progressie, kan het expressieniveau veranderen. Om de functie van deze doelgroepen moleculen te ontdekken, we dachten dat het belangrijk was om tumoren te onderzoeken in hetzelfde stadium, en evalueerden we het niveau van claudin-18, die invasie en metastase van invloed kunnen zijn, in een iets submucosale invasieve GC laesies. Bovendien kan maagslijmvlies claudine-18 niet alleen werken TJS, omdat het tot expressie lokalisatie aan het celoppervlak niet alleen op TJS. Verder onderzoek is nodig om fysiologische en pathofysiologische TJ eiwitexpressies onderzoeken op het laterale membraan.

Om te onderzoeken of de veranderingen in claudin-18 niveaus in de submucosale invasieve voorzijde bijgedragen tot de proliferatie en invasie van kankercellen, een siRNA benadering werd gebruikt om het eiwit knockdown in de MKN74 GC cellijn, die positief is voor claudine-18. De onderhavige studie toont voor de eerste keer de functie van claudin-18 GC met behulp van een genetische benadering, en dat het verlies van claudin-18 is betrokken bij zowel proliferatie en invasie van GC cellen. Samen met deze gegevens, verlies van claudin-18 aan de submucosale invasieve voorzijde aangegeven de overname van meer agressieve kenmerken en misschien cel-cel dissociatie mogelijk te maken tijdens de invasie. Echter, een beperking van deze studie was dat alleen MKN74 kunnen worden onderzocht, omdat het de enige gedifferentieerde maagkanker cellijn die expressie claudine-18 zover wij onderzocht. Daarom kan dit fenomeen niet worden gereproduceerd andere maagkanker cellijnen.

Zowel opwaartse regulatie en neerwaartse regulatie van Claudins gerapporteerd betrokken te zijn bij het proces van kanker [34], [35]. Voor de analyse van de functie van Claudins in kankercellen hebben genetische benaderingen Claudins ook beschreven in diverse kankercellen. Knockdown van claudine-1 door siRNA resulteerde in de remming van de migratie in coloncarcinoom cellen [36]. De overexpressie van claudin-6, claudin-7, of claudin-9 een versterking van de invasieve potentieel van een adenocarcinoom van de maag-cellijn [37]. Dergelijke Claudin geïnduceerde proliferatie en de invasie lijkt paradoxaal, want Claudins zijn bekend betrokken te zijn bij het afdichten van epitheliale kruispunten. Deze controversiële gegevens suggereren dat de functies van Claudins zowel subtype- en celtype-specifiek.

Als beperking van dit onderzoek, is het nog niet duidelijk dat deze verminderde claudine-18 niveau de submucosale invasieve voorzijde is daadwerkelijk bij kanker metastase, omdat het moeilijk is om de natuurlijke geschiedenis van de vroege GC volgen. De gegevens in deze studie bleek dat een lagere claudine-18 niveau invasieve voorzijde werd geassocieerd met grotere proliferatieve tendens. Moet worden prospectief onderzocht of deze afname in de claudin 18-niveau kan worden gebruikt als een metastatisch en prognostische biomarker na endoscopische resectie in een toekomstig onderzoek.

Samengevat is aangetoond voor de eerste keer dat claudine-18 heterogeen die tijdens de submucosale invasieve voor vroege GC en neerwaartse regulatie van claudin-18 is geassocieerd met de proliferatieve en invasieve potentieel van GC. Deze bevindingen geven aan dat claudine-18 een cruciale rol bij de progressie van GC en kan een kandidaat biomarker van de ziekte progressie. Een claudine-18 knock-down experiment bevestigde dat onderdrukking van junctionele claudin-18 bevorderde de proliferatie en de invasie van GC cellen.

Dankwoord

Wij danken Ms. Noriko Kamiya voor technische ondersteuning.

• PLoS ONE: Tetrandrine Veroorzaakt Mitochondriën-gemedieerde apoptose in Human MaagKanker BGC-823 Cells
• PLoS ONE: Helicobacter pylori Infectie synergie met drie Ontsteking-gerelateerde genetische varianten in de GWASs om het risico van maagkanker verhogen in een Chinese Population