Plos ONE: Dol-Regulacija Claudin-18 je povezana z proliferacije, in invazivni potencial želodčnega raka na invazivno Front

Povzetek

Ozadje

Claudins so znani kot Tesni stik proteinov, in njihovo izražanje vzorec na raka želodca, je še vedno sporen. Razmerje med izražanja vzorci Tesni stik beljakovin in širjenja tumorja pri zgodnjem raku želodca še zdaleč ni jasno.

Cilji

Da bi raziskali izražanju vzorcev claudin-18 in Ki-67 v zgodnjega raka želodca na invazivno spredaj in okoliških normalno želodčne sluznice in raziskati njegovo biološko delovanje claudin-18 na proliferacijo in invazijo rakavih celic.

Načini

petinsedemdeset zgodnjega raka želodca lezije odstranili z endoskopsko sluznico resekcijo ali endoskopsko Submukozno resekcijo bili ovrednoteni. Vse želodca lezije raka so diagnosticirali kot diferencirane adenokarcinom z uporabo japonske klasifikaciji želodca karcinomom. Za oceno epitelne orožja, imunskim barvanjem s Ki-67 je bila izvedena, in indeks označevanja je bila izračunana. Za oceno izražanje epitelijskih Tesni stik beljakovin, je bil opravljen imunofluorescenčni obarvanje claudin-18. Radioinkorporacijo za claudin-18 so razvrščeni po številu obarvanih celic. Korelacijska analiza je bila opravljena s Spearmanov koeficient korelacije. Transfekcija claudin-18 male interferenčne RNA (siRNA) je bil dosežen v MKN74, ki claudin-18-pozitivne želodčni rak celično linijo, naj preuči vpliv claudin-18 na proliferacijo in invazijo rakavih celic.

Rezultati

Claudin-18 se je močno zmanjšalo, urejena v raka želodca v primerjavi z okoliških želodčne normalno sluznico ali intestinalno metaplazijo. Indeks Ki-67 označevanje raka želodca pri invazivni spredaj je obratno povezana z ravnijo claudin-18, vendar so na sluznico lezije ni bila povezana. Claudin-18 rasklapanje pomembno spodbujati širjenje MKN74 v primerjavi s kontrolnimi celicami-siRNA transfekcije. MKN74 invazija bistveno povečala z claudin-18 siRNA transfekciji primerjavi s nadzor siRNA transfekciji.

Sklepi

Dol-regulacijo claudin-18, ki je povezana s proliferativno potencial na invazivno pred rakom želodca, kar pomeni, da ima ključno vlogo v želodcu napredovanje raka

Navedba. Oshima T, Shan J, Okugawa T, Chen X, Hori K, Tomita T, et al. (2013) Dol-Regulacija Claudin-18 je povezana z proliferativne in invazivni potencial želodčnega raka na invazivnih fronte. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10,1371 /journal.pone.0074757

Urednik: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 28. maj 2013; Sprejeto: 6. avgust 2013; Objavljeno: 20. september 2013

Copyright: © 2013 Oshima et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprlo Ministrstvo za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo Japonske skozi Grant-v-pomoč za znanstvene raziskave (C) 2010-2012 (št 22590691). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrta najpogosteje diagnosticiran malignost, in drugi najpogostejši vzrok smrti, povezanih z rakom na svetu [1], [2]. Intramucosal GC lahko kurativno zdraviti z endoskopsko zdravljenje. Poleg tega je endoskopski Submukozno seciranju (ESD) tehniko razširil indikacije za endoskopsko zdravljenje in omogočite en bloc resekcijo intramucosal velika in nekoliko Submukozno invazivno zgodnje GCS [3]. En bloc resekcijo ga ITR omogoča natančno diagnozo globine raka [4].

Tight križiščih (TJS) so specializirani membranske domene na najbolj apical regiji polarizirane epitelnih in endotelijske celice [5]. Claudins so glavni TJ beljakovine; so sestavljeni iz vsaj 27 držav proteinov in so izraženi na način, tkivno specifični [6] [7]. Urejajo paracelični prepustnost in vzpostaviti polarnost epitelijskih celic po svoji funkciji ograjo [6], [8]. Vedno najnovejši dokazi kažejo, da so claudins ključne strukturne in funkcionalne komponente TJ pramenov [6], [9], in se lahko igrajo ključno vlogo pri tumorigeneze in vnetja [10], [11].

epitela želodca kaže vrsto sprememb v claudin izražanja od normalne sluznice na intestinalno metaplazijo in adenokarcinom. Čeprav so bili GK nedavno razvrščeni po temeljijo na mucin izražanja [12], [13], je bila predlagana tudi temelji na claudin klasifikacija GC [14]. so prav tako poročali smo, da je bil navzdol ureditev claudin-3 v zvezi s širjenjem intramucosal GC [15]. Nedavno so claudin-18 knock-out miših dokazali, da imajo želodčne sluznice atrofijo in paracelični H ^{+ ion puščanja [16]. Claudin-18a2 je pokazalo, da je pogosto navzdol urejeno v GC za črevesne fenotipa, kar kaže, da claudin-18a2 bi bila dobra marker za GC [17]. Vendar pa je biološka funkcija claudin-18, ki bi lahko bile vključene v vedenju rakave celice, še nikoli ni bila preverjena. Poleg tega pa ni jasno, katero je značilno za GC celic v invazivno spredaj povezan z hitre rasti ali agresivnosti invazije.}

V tej raziskavi, je raven izraz claudin-18 v GC pri invazivni spredaj in okolici želodca sluznica je bila preučena prvič, in je bila ocenjena korelacija med stopnjo claudin-18 in indeks Ki-67 za označevanje (LI) v PK. Učinek claudin-18 na orožja in invazivnosti in vitro
je preučilo tudi.

Materiali in metode

Bolniki

A zaporedno serijo 74 bolnikov z so zgodaj GC preučevali (tabela 1). so bili ocenjeni GC lezije (n = 75), ki so bili izpostavljeni kurativno EMS ali ITR. GK z Submukozno invazije (n = 31) so bili vključeni v to študijo. Dvojni raka so odkrili le v enem moškega bolnika. Vse GC so razvrščene kot diferencirane adenokarcinom z japonsko klasifikaciji želodca karcinomom [18]. Anonimnost je bolnik ohranjena. Ta študija je bila izvedena v skladu z izjavo o Helsinkih in ga je odobril odbor za etiko /Institutional Review Board za Hyogo College of Medicine. Predmet dali pisno privolitev.

Imunohistokemija

Vzorci so bile določene z 10% raztopino formalina in vgrajeni v parafin. Oddelki so bili razrezani v 3 pm debeline in smo obarvali s hematoksilinom in eozinom (HE). Za oceno epitelne orožja, so bili vzorci inkubirali s Ki-67 monoklonsko protitelo (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), ki mu sledi inkubaciji z biotinilirano horse-anti-mouse sekundarnih protiteles (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ZDA). Kompleks metodo streptavidin-biotin (Vector Laboratories) je bila uporabljena za vizualizacijo radioinkorporacijo. Jedra so jih nasprotno s hematoksilinom.

imunofluorescenčni Obarvanje plošcicnih proteinov

Rabbit anti-claudin-18 poliklonskega protitelesa (Invitrogen) in Cy3 konjugiranih kozje anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, ZDA), sekundarna protitelesa so bili uporabljeni za vizualizacijo radioinkorporacijo. Specifičnost reakcije smo testirali z inkubacijo z non-imunski zajec v serumu (Dako, Glostrup, Danska).

Točkovanje imunskim barvanjem Claudin-18 in Ki-67

radioinkorporacijo je ocenil dve neodvisni opazovalci (T.Ok., XC), in tako so bili slepi za clinicopathological funkcij in kliničnih izidov, povezanih z vsakim vzorcem. so bili ocenjeni Non neoplastični želodca sluznica brez intestinalno metaplazijo (non-IM) in z intestinalno metaplazijo (IM) in raku regije. Radioinkorporacijo za claudin-18 je bila ocenjena na podlagi naslednjih meril: 0, odsotnost membrane kamna; 1+, manj kot 10% tumorskih celic s popolno membrane madež; 2+, 10% do 50% tumorskih celic s popolno membrane barvanjem; 3+, več kot 50% do 75% tumorskih celic s popolno, močno membrane obarvanje; in 4+, več kot 75% celic s popolno, zelo močno obarvanje membrane. Pet high-power polja so bili analizirani v vsaki regiji primerov, povprečna ocena je bila izračunana. Vseh odsekov bilo doseženih dvakrat potrditi ponovljivost rezultatov. Ki-67 LI je bila izračunana po štetju 1000 rakaste celice.

Mali moteče RNA (siRNA) rasklapanje Poskusi

Za siRNA utišanje ljudi claudin-18, O-TARGET plus SMARTpool in tretjo -specifične nadzor siRNA je bila kupljena od Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, ZDA). Celično linijo MKN74 (japonski Zbiranje Raziskovalne BioResources Cell banke, Osaka, Japonska), ki je CLDN18
-positive, je bil izbran za preučevanje učinkov claudin-18 rasklapanje na lastnosti orožja in vdor v GC celic . Celice smo transficirali s 25 nM siRNA uporabo DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Nadzor in zatiranje siRNA skupine so bili zdravljeni z reagenti transfekcijskih brez siRNA in reagentov transfekcijskih, ki nimajo posebne nadzorne siRNA, oz. Teste smo izvedli 3 dni po tem, ko smo transfektirali v celice MKN74.

Cell Proliferation Vsebnost

proliferacije celic smo določili s kolorimetričnim testom preživetja celic, ki temelji na cepitev tetracolij soli WST-1, ki ga mitohondrijske dehidrogenaze (Takara Bio Inc., Otsu, Japonska). Absorbanca formazana barvila oblikovana, kar sovpada s številom metabolno aktivne celice v kulturi, smo izmerili pri 450 nm 1 uro po dodajanju reagenta.

invazijo Vsebnost

MKN74 celično invazijo preizkusimo v 24-tudi Biocoat vdora v Matrigel komor (8 mikrometrov; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ZDA) po protokolu proizvajalca. Spodnji zbornice so bile napolnjene z RPMI1640 z 10% FBS in celice (2 x 10 ^{5) so bili postavljeni v vstavljanja komorah, ki so vsebovale RPMI1640 brez FBS. Po 24-h inkubaciji smo neinvaziven celice odstranimo z vato. Celice, ki so prešle skozi membrano in zataknejo na spodnjo površino membrane so bile določene z 10% formalinom in obarvali s hematoksilinom. Za količinsko, smo celice prešteli pod mikroskopom v petih naključno izbranih področjih visoke moči. Teste smo izvedli v treh izvodih. Razmerje invazija za nadzor medij je bila izračunana.}

Statistična analiza

Statistična ocena je bila izvedena z SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Korelacijska analiza je bila opravljena s Spearmanov koeficient korelacije (rs). Več primerjave so bile izvedene s testom Kruskal-Wallis, ki mu sledi Scheffe testu. Enojni primerjave smo izvedli test Mann-Whitney. P
. ≪ 0.05 je zdelo pomembno

Rezultati

Izražanje Claudin-18 v želodčne sluznice in karcinom

Skupno 75 raznolikih primerov GC so bili analizirani v tej študiji. Oddelki smo obarvali z claudin-18, in je bila ocenjena stopnja obarvanja. Claudin-18 je bila odkrita v visokih ravneh v epitelijskih celic želodca na apikalnih in stranskih stranic meja v ne-IM, vendar ne v IM ali diferenciranih adenokarcinom celic (sl. 1A). Ravni claudin-18 je bilo v rakavih celicah precej nižja kot v ne-IM in IM, kot tudi bistveno nižje v IM primerjavi z ne-IM (sl. 1B).

Odkrivanje Claudin-18 v GK z Submukozno invazijo

Reprezentativni primeri GC z Submukozno invazije je pokazala, da je bilo očitno na invazivno pred Submukozno napadel-rakavih celic gosto claudin-18 obarvanje in ki-67 LI je bila nizka na lezijo (sl. 2A ). V primeru z nizko claudin-18 obarvanja na invazivno pred Submukozno napadel-rakavih celic, je Ki-67 LI visoko na lezijo (sl. 2A).

Korelacija na ravni Claudin-18 in Ki -67 LI

Ki-67 LI GC v sluznici in submucosa je bila določena z odstotkom Ki-67-pozitivnih jeder. Če želite ugotoviti korelacijo med Ki-67 LI in ravni claudin-18, je bila analiza korelacije izvedena. Stopnja sluznice izraz claudin-18 ni bila bistveno povezana s Ki-67 LI (rs = 0,07, P =
0,60). Po drugi strani pa Submukozno claudin-18 nivo izražanja signifikantno obratno povezana z Submukozno Ki-67 LI (rs = -0,550, P
= 0,0010) (sl. 2B).

Učinek claudin-18 siRNA o širjenju in Invazija GC celice

celična linija GC, MKN74, konstitutivno izražen claudin-18, raven mRNA claudin-18 se je bistveno zmanjšalo s siRNA proti claudin- 18 (sl. 3A). Imunofluorescenco z claudin-18 po transfekciji (sl. 3B) se je zmanjšalo tudi. V claudin-18 navzdol urejeno MKN74 je rast celic močno povečal (sl. 4a), in invazijo celic se je bistveno povečala (sl. 4B).

Pogovor

spremenjeno izražanje od claudins na Submukozno lahko invazivna spredaj povezan z napredovanjem GC. Nedavne študije kažejo, da celo v nekoliko Submukozno invazivno GC brez limfne in žilne invazije, morda ESD izvedljiva kot kurativno delovanje [19]. Vendar pa še vedno ni jasno, kateri primeri nekoliko Submukozno invazivno GC lahko sledi brez dodatnega kirurškega posega po ITR. V tej raziskavi je bilo ugotovljeno, da obstaja inverzna korelacija med stopnjo claudin-18 in Ki-67 pozitivnosti na invazivno pred Submukozno invazivne GC, in da claudin-18 regulirani GC celic invazija in širjenje. Ki-67 imunohistokemija je nadomestil mitotičnem štetje pri ocenjevanju proliferacijo tumorskih celic. Študije so pokazale, da je Ki-67 povezana z nediferencirani in metastatskih celicah malignih bolezni [20]. V tej študiji je bila le EMS /-ITR resekcija GC, v katerem je indikacija omejena na diferenciranem tip GC preučevali. Zato ti podatki kažejo, da je stopnja Ki-67 v invazivno spredaj povezan z metastatskih celic v malignih sprememb, in da izguba claudin-18 je bil eden od markerjev GC agresivnosti in lahko povezana z razvojem metastaz, ki zahteva dodatna operacija po obdelavi ESD

Claudins so v različnih malignostmi, kot so GC, hepatocelularni karcinom, karcinom biliarnega trakta, rak dojk, karcinom ledvičnih celic, in mezotelioma [15] nenormalno regulirana, [21]. - [ ,,,0],25]. Sprememba claudins na križiščih je povezana z izgubo tesen oprijem in polarnosti v povrhnjice. Izguba polaritete je povezano s povečano celično proliferacijo in epitelijskih do mezenhimskega tranzicije, medtem ko se motnje v Tesni stik kompleksov spremeni celica celice interakcije, ki so povezane z invazijo in metastaz [23] [26] [27]. V opazovalnih študij, zmanjšanje claudin-3 in -4, so poročali v GC celic v invazivno spredaj in je bilo ugotovljeno, da v korelaciji z napredovanjem raka in metastaz [14]. Navzdol ureditev claudins so poročali tudi v nekaterih drugih epitelijskih tumorjev, vključno z izgubo claudin-1 raka dojke [28] in raka debelega [29], kakor tudi izgubo claudin-7 raka dojke [30] in raka glave in vratu [31]. Glede invazije tumorskih celic, zmanjšano ekspresijo claudin-7 na invazivne spredaj bilo ugotovljeno, da je povezana z globino invazije in limfnega vpletenosti v skvamoznih karcinomom požiralnika [32]. Čeprav so claudin-3 in claudin-7 izrazi v Submukozno invazivno spredaj nižji kot v lezij na sluznicah v prejšnji raziskavi, claudin-3 in claudin-7 stopenj na invazivno spredaj niso bile v korelaciji s Ki-67 LI [15]. Po drugi strani pa je claudin-18 na invazivno spredaj obratno povezana s Ki-67 LI v tej študiji. Ti podatki se lahko v zvezi z ugotovitvami, ki claudin-3 in claudin-4 niso bile povezane s bezgavkah metastaze [33]. Poleg tega te opazovalne študije ne more pojasniti, ali so te spremembe neposredno vplivajo na tumorske invazije in metastaz.

Claudin-18 se izraža predvsem v želodcu in epitelijskih celic v pljučih. Claudin-18a2 je obrazec za želodec in izo nekoliko drugačen. V prejšnjem poročilu, je bil tip želodca claudin-18 izgubil v GK [17]. Vendar je med intestinalno metaplazijo izraz vzorec claudins že razlikuje od običajnih želodca epitela. Ugotovljeno je bilo izginotje claudin-18, ki so povezana z intestinalno metaplazijo v želodcu [17]. Zato je izguba claudin-18 izražanja v naprednih GC [17], ne sme preprosto dokazati značaj raka. Tudi v procesu napredovanja GC, lahko nivo izražanja spreminjajo. Raziskati delovanje teh ciljnih molekul, smo mislili, da je pomembno, da se preveri, tumorje na isti stopnji, in smo ocenili stopnjo claudin-18, ki lahko vplivajo na invazijo in metastaze v nekoliko Submukozno invazivnih GC poškodb. Poleg tega želodca sluznični claudin-18 morda ne delujejo le na TJS, saj je izražen lokalizacijo na površini celic ni bilo samo na TJS. Nadaljnje raziskave so potrebne, da preuči fiziološke in patofiziološke TJ beljakovin izraze na stranskem membrano.

Da bi preverili, ali spremembe v nivojih claudin-18 na Submukozno invazivne pred prispevala k širjenju in invazijo rakavih celic, siRNA pristop je bil uporabljen za rasklapanje protein na celični liniji MKN74 GC, ki je pozitiven za claudin-18. Tako je ta študija pokazala, za prvič funkcije claudin-18 v GC pomočjo genske pristop in da izguba claudin-18 je vpletena tako proliferacijo in invazijo GC celic. Skupaj s temi podatki, izguba claudin-18 na Submukozno invazivne spredaj navedeno pridobivanje bolj agresivne lastnosti in lahko omogoči celica-celica disociacije med invazijo. Vendar pa je bila omejitev te študije, da bi se preučilo le MKN74, ker je bila to edina diferencirana želodčni rak celična linija, ki je izrazil claudin-18, kolikor smo pregledali. Zato, podobne pojave, ni mogoče ponoviti z drugimi želodca raka celičnih linijah.

Tako regulacijo navzgor in navzdol-ureditev claudins so poročali, da se vključijo v proces raka [34], [35]. Za analizo funkcije claudins na rakavih celicah, so poročali tudi genetske pristopi k claudins na različnih rakavih celicah. Rasklapanje od claudin-1 s siRNA privedla do inhibicije migracije v kolona rakavih celic [36]. Prevelike količine claudin-6, claudin-7 ali claudin-9 izboljšala invazivni potencial želodčne adenokarcinom celične linije [37]. Tak-claudin povzroča proliferacijo in invazijo Morda se zdi paradoksalno, saj je znano, claudins biti vključeni v tesnjenje epitelijskih križiščih. Ti spornih podatki kažejo, da so funkcije claudins tako subtype- in celično vrsto specifični.

Kot omejitev te študije, še vedno ni jasno, da je ta znižala raven claudin-18 na Submukozno invazivne spredaj je dejansko vključeni v raka metastaz, ker je težko slediti naravne zgodovine zgodnjega GK. Vendar pa so podatki v tej študiji so pokazali, da je bila nižja raven claudin-18 na invazivno spredaj povezana z večjo proliferativni tendenco. Je treba naprej, preveri, ali se to zmanjšanje ravni claudin-18 lahko uporabimo kot metastatskega in prognostičnega biomarker po endoskopski resekciji v prihodnjem študije.

Če povzamemo, je bilo dokazano, prvič, da claudin-18 je heterogeno izraženo na Submukozno invazivno pred predčasno GC in dol regulacijo claudin-18 je povezan s proliferativne in invazivnega potenciala GC. Te ugotovitve kažejo, da ima claudin-18 osrednjo vlogo pri napredovanju GC in je lahko biomarker kandidat za napredovanje bolezni. Claudin-18 rasklapanje poskus je potrdil, da zatiranje plošcicnih claudin-18 spodbuja proliferacijo in invazijo GC celic.

Priznanja

Zahvaljujemo se gospe Noriko Kamiya za tehnično pomoč.

• Plos ONE: Tetrandrine povzroča Mitohondrij-posredovana apoptozo v Human želodca raka BGC-823 celice
• Plos ONE: Helicobacter pylori okužbe synergizes s tremi vnetje so povezani genetske različice v GWASs za povečanje tveganja želodčnega raka v kitajski Prebivalstvo