PLoS ONE: микроРНК-217 Функции как потенциальный опухолевого супрессора в желудочном Рака Нацеливаясь GPC5

Абстрактный
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний во всем мире. Все новые данные показали, что отклоняющееся экспрессию микроРНК (миРНК) играет важную роль в прогрессии рака. Тем не менее, мало известно о потенциальной роли микроРНК-217 в GC. В данном исследовании мы исследовали роль микроРНК-217 на пролиферацию клеток GC и вторжения. Выражение микроРНК-217 был вниз регулируется в GC клетках и тканях человека GC. Принудительная экспрессия микроРНК-217 тормозится GC клеток пролиферации и инвазии. Кроме того, глипикан-5 (GPC5), новый ocncogene, был идентифицирован как потенциальная мишень микроРНК-217. Кроме того, избыточная экспрессия микроРНК-217 нарушения GPC5-индуцированной пролиферации продвижения и вторжения в GC клетки. В заключение, эти результаты показали, что микроРНК-217 функционирует как подавитель опухоли и ингибирует пролиферацию и инвазию клеток GC путем ориентации GPC5, которые могли бы, следовательно, служить в качестве терапевтической мишени для пациентов GC
<р> Образец цитирования:. Ван H , Dong X, X Гу, Цинь R, Цзя H, Гао J (2015) микроРНК-217 Функции в качестве потенциального опухолевого супрессора в рака желудка с помощью таргетинга GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. DOI: 10.1371 /journal.pone.0125474
<р> Редактор: Июнь Ли, Сунь Ят-сеном университета Медицинской школы, Китай
<р> Поступило: 10 октября 2014 года; Принято: 24 марта 2015; Опубликовано: 22 июня 2015
<р> Copyright: © 2015 Wang и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> финансирование:.. авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенных злокачественных опухолей человека и второй ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний во всем мире, с примерно миллиона новых случаев в год [1-4]. Несмотря на недавние достижения в области метода диагностики, хирургической техники и новых схем химиотерапии, курс выживания в долгосрочной перспективе для GC остается достаточно низкой [5, 6]. У многих пациентов, ГК диагностируется на продвинутой стадии с обширным вторжением и лимфатического метастазирования. Успешные стратегии лечения ограничены, а смертность высока [7]. Поэтому необходимо срочно исследовать основные молекулярные механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости, гистологическую гетерогенность и развитие метастаз, чтобы идентифицировать новые маркеры для диагностики и лечения для GC
.

MicroRNAs (микроРНК) небольшие, приблизительно 22 -nucleotide, некодирующие РНК, которые функционируют как негативные регуляторы, кодирующих белок генов на пост-транскрипционном уровне [8, 9]. Связываясь с комплементарными последовательностями в 3'-нетранслируемые области (3'-UTR) их мРНК мишеней, микроРНК может вызвать прямую деградацию мРНК или ингибирование трансляционной [10-13]. Растущие доказательства показали, что микроРНК принимают участие во многих важных биологических процессов, включая пролиферацию клеток, их дифференциации, апоптоза, ангиогенеза и иммунного ответа. Дерегуляция микроРНК может привести к аномальным экспрессии генов в различных заболеваний, включая рак желудка [14-16]. Тем не менее, понимание роли и функции микроРНК в GC все еще находится в ранней стадии. Точно так же, роли многих других аберрантно выраженных микроРНК в развитии GC до сих пор неизвестны.
<Р> Подавление MIR-217 является частым событием в различные виды рака, предлагая свою важную роль в онкогенеза [17-19]. Тем не менее, мало известно о потенциальной роли микроРНК-217 в GC. В этом исследовании экспрессия микроРНК-217 была снижена в клеточных линиях GC и тканей. Кроме того, более низкая экспрессия микроРНК-217was связано со стадией pTNM. Сверхэкспрессия MIR-217 подавлено вторжение GC и пролиферацию клеток. Кроме того, анализ люциферазы репортер и вестерн-блот подтвердил, что микроРНК-217might функция как подавитель опухоли в Генеральном targetingGlypican-5 (GPC5).

Материалы и методы

Заявление по этике
<р> Все пациенты дали согласие на участие в исследовании и дали письменное информированное согласие. Это исследование и согласие было одобрено этическим советом института аффилированном Йанан больницы Куньмина медицинского университета и выполнил Хельсинской декларацией.

Образцы тканей

Образцы тканей GC человека и в паре -adjacent неопухолевой ткани желудка, которые были дальше, чем в 5 см от опухоли были получены из 50 пациентов, которым была сделана операция резекция в аффилированном Йанан больнице Куньмина медицинского университета. Свежие образцы были замораживали inliquid азот сразу после резекции и хранили при -80 ° С. Все образцы были получены с информированного согласия пациентов и были подтверждены гистологическим окрашиванием гематоксилин-эозином. Гистологическое степень рака оценивали в соответствии с критериями, установленными Всемирной организацией здравоохранения. Ни один из пациентов не получал лучевой терапии или химиотерапии до операции. Характеристики пациентов приведены в таблице S1.

Клеточные линии и клеточная культура
<р> желудка человека раковых клеток линии SGC-7901, ГГК-27, MGC-803, MKN-45 и один нормальный желудка эпителиальных клеток линии GES-1 (в качестве контроля) были приобретены из Института биохимии и клеточной биологии при китайской академии наук (Шанхай, Китай). СГК-7901, ТЖК-27, MGC-803, MKN-45 размножали в среде RPMI 1640 (фирма Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и ГЭС-1 размножали в среде Игла в модификации Игла (Invitrogen). with10% эмбриональной телячьей сыворотки Все СМИ были дополнены. Клеточные линии культивировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% СО2.

Выделение РНК и QRT-ПЦР
<р> Суммарную РНК экстрагировали из образцов замороженных (или клетки) с помощью Trizol ( Invitrogen) в соответствии с руководством изготовителя. 1 мл РНК использовали для измерения экспрессии микроРНК-217 с помощью количественной ОТ-ПЦР (QRT-PCR) с TaqMan микроРНК обратной транскрипции набора для анализа специфических andtheTaqMan микроРНК RT праймеров для MIR-217 в соответствии с инструкциями изготовителя (Applied Biosystems, Foster City, CA). Выражение U6 использовали в качестве внутреннего контроля. ПЦР в реальном времени проводили с 1 мл каждой кДНК на стадии One Plus PCR System в режиме реального времени (Applied Biosystems, Foster City, CA) в двух экземплярах. Выражение микроРНК-217 была определена на основе порогового цикла (Ct), а также относительные уровни экспрессии были вычислены as22 - [(Ct из MIR-217) - (Ct из U6)] после нормализации со ссылкой на выражение U6 малая ядерная РНК [20, 21] (S2 Table).

Вестерн-блот
<р> Общий белок экстрагируют из замороженных образцов (или клетки) с использованием общего белка Extraction Kit (серийник, Нанкин , Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерение концентрации белка проводили с помощью ВСА Protein Assay Kit (кейген). Вестерн-блот-анализ проводили, как описано ранее [22]. Первичные антитела, используемые для вестерн-блоттинга были кроличьи поликлональные анти-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), мышиное моноклональное анти-GAPDH (Cell Signaling Technology, Беверли, штат Массачусетс, США).

Cell трансфекция
<р> микроРНК-217 имитируют, имитируют контроль (свалка), микроРНК-217 ингибитора, контроль ингибитора, Pez-GPC5 и вектор управления были приобретены у RiboBio (Гуанчжоу, Китай). Клетки ТЖК-27 высевали в шесть-луночные планшеты в количестве 30% монослоя за один день до трансфекции. Lipofectamine2000 (Invitrogen) использовали для трансфекции плазмиды в отдельности или вместе с РНК олигонуклеотиды.

люциферазы анализы
<р> Клетки 8 × 10 3 высевали в 96-луночные планшеты. После того, как 24-hincubation смесь 100-нг pLUC-3'-UTR, 5-пмоль отрицательный контроль, микроРНК-217mimic был котрансфицируют с 20 нг Renilla в клетки с использованием Липофектамина 2000. Двадцать четыре hoursafter трансфекцию, светлячка и люциферазные деятельность Renilla были измеренная с помощью Dual-люциферазы системы (Promega, Madison, WI, USA). Эффективность трансфекции была нормирована котрансфекции с репортерным вектором Renilla.

пролиферации клеток
<р> Клетки (3000 /лунку) собирали и высевали в 96-луночных планшет и инкубировали при 37 ° C после трансфекции. После инкубации в течение от 1 до 5 дней, чтобы был добавлен носитель из каждой лунки 10% ячеек Counting Kit-8 (ССК-8; Dojindo, Кумамото, Япония), и планшеты дополнительно инкубировали в течение еще 3 ч при 37 ° С. Затем среду замен ют 150 мл диметилсульфоксида (ДМСО; Sigma-Aldrich), и измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием микропланшет-ридера (восход солнца). Анализ повторяли 3 раза с шестью повторами.

Нозерн-блот
<р> Общую РНК выделяли из каждой ткани с использованием реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies), Нозерн блоттинг проводили, как описано предыдущий [23] , После Идеальная гибридизацию Гибр Plus при 68 ° С, были разработаны и проанализированы мембраны. Нозерн-блоты гибридизировали с 18S рибосомальной РНК (рРНК) кДНК использовали в качестве контроля.

инвазии клеток
<р> Invasion анализы проводили в трех экземплярах с использованием Transwell вторжения камеры, покрытые Матригель (BD, США) в качестве описано в протоколе производителя. Клетки трансфицировали withmiR-217 мимику, ингибитор или отрицательного олигонуклеотид управления, культивировали в течение 48 ч, и переносили на вершине матригелем инвазионных камер в бессывороточной DMEM (1 × 10 5 клеток на Transwell). DMEM, содержащей 10% сыворотки плода теленка добавляли в нижнюю камеры. После инкубации в течение 24 ч клетки, которые остались на верхней части фильтра были вымыты и от клетки, которые мигрировали к нижней поверхности фиксировали in90% спирта и последующим кристаллическим фиолетовым красителем.

гистологии
<р> Гистологический диагноз был поставлен в соответствии с методом биопсии желудка тройной сайта. Ткани фиксировали в течение ночи в буферном формалине, заливали в парафин, сократить до толщины 3 мкм и окрашивали гематоксилин-эозином (H &Amp; E). Окрашиванием

Статистический анализ
<р> Статистический анализ проводили с использованием статистического пакета программ SPSS 17.0. Эксперименты были повторены самостоятельно, по крайней мере в три раза, и данные представлены как среднее значение ± SD. Связь между микроРНК-217 и GPC5 анализировали с использованием корреляции тест Спирмена. Сравнения между группами по статистической значимости были проведены с сопряженным Стьюдента два Стьюдента тест или однофакторного дисперсионного анализа. P &л; 0,05 рассматривалось как статистически значимое.

Результат

Выражение MIR-217 подавляются в строках GC клеток
<р> Мы, во-первых количественно уровень экспрессии микроРНК-217 в четырех линии человеческих клеток GC (SGC-7901, ГГК-27, MGC-803, MKN-45) и ГЭС-1 с использованием Нозерн-блот (рис. 1А) Уровень экспрессии микроРНК-217 wasdecreased в линиях GC клеток по сравнению с ГЭС-1. QuantitativeRT-ПЦР также показал, что экспрессия микроРНК-217 была снижена в клеточных линиях GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) по сравнению с ГЭС-1, нормальная желудочная эпителиальной клеточной линии (рис 1В ).

MIR-217 подавляется в GC тканях
<р> Количественный ОТ-ПЦР использовали для изучения микроРНК-217 выражение в 50 тканях GC и их парными соседних нераковых тканей. Представительные гистологические характеристики GC и его парными соседних нераковых тканей были показаны на рис 2А. Среди 50 опухолевых тканей, 44 случая экспонируются снижение экспрессии микроРНК-217 по сравнению с соседними нормальными тканями (88%, 44 из 50, рис 2В). Выражение микроРНК-217 был в ГЦ тканях ниже, чем в соседних нераковых тканях (рис 2С). Кроме того, более низкие уровни экспрессии микроРНК-217 связаны со стадией pTNM ГК пациентов (рис 2D).

микроРНК-217 ингибирует пролиферацию клеток GC и вторжение
<р> Выражение MIR-217was увеличилась в трансфицированные ТЖК-27 клеток с помощью микроРНК-217 мимику (рис 3а) и с использованием ингибитора снизился микроРНК-217 (рис 3B). Распространение было уменьшено в клетках ТЖК-27, трансфецированных withmiR-217 подражает по сравнению с клетками, трансфицированных карабкаются или неочищенные (рис 3C). В то же время, распространение было увеличено в ТЖК-27 клеток, трансфицированных withmiR-217inhibitor по сравнению с клетками трансфицированных управления или неочищенные (рис 3D). Инвазивность клеток, трансфицированных микроРНК-217 подражает уменьшалась по сравнению с группой клеток скремблирования группы или управления и микроРНК-217 ингибитора инвазии клеток повышенное по сравнению с клетками группы скремблирования группы или контрольной группы (рис. 3е)

микроРНК -217 посттранскрипционная уменьшает экспрессию GPC5 непосредственно ориентации его 3'UTR
<р> Анализ с использованием имеющихся алгоритмов показал, что GPC5 был теоретический целевой ген микроРНК-217 (рис 4а) [24]. Для того, чтобы доказать, что микроРНК-217 непосредственно ориентированы на GPC53'UTR, мы провели гена люциферазы анализов репортер. Внематочная из микроРНК-217 пониженной активности люциферазы в репортерного гена дикого типа GPC5, но не мутант GPC5 3'UTR, указывая, что микроРНК-217 непосредственно ориентированы на GPC5 3'UTR (рис 4б). Уровень мРНК GPC5 уменьшалось после трансфекции с микроРНК-217 мимике и увеличилась после трансфекции с ингибитором микроРНК-217 с использованием QRT-ПЦР (рис 4в). В соответствии с этим результатом, способность MIR-217, чтобы регулировать экспрессию белка GPC5 была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга (рис 4D).

Восстановление MIR-217 ингибирует GPC5-опосредованной пролиферации клеток GC и вторжение

Гиперэкспрессия GPC5 способствовали распространению GC клеток и вторжения. Когда микроРНК-217 имитируют и Pez-GPC5 были котрансфицируют в ТЖК-27 клеток, микроРНК-217 экспрессия уменьшил GPC5-индуцированной пролиферации клеток GC и инвазии (рис 5А и 5С). Ингибирование GPC5 уменьшил пролиферацию клеток GC и вторжения. Когда ингибитор микроРНК-217 и shGPC5 были котрансфицируют в ТЖК-27 клеток, микроРНК-217 способствует ингибитор пролиферации shGPC5-заторможенной клеток и инвазию (фиг.5В и 5D).

GPC5 активируется в клеточных линиях GC и образцов
<р> выражение GPC5 была выше в клеточных линиях GC (СГК-7901, ТЖК-27, MGC-803, MKN-45) по сравнению с ГЭС-1, нормальный желудочный линии эпителиальных клеток (фиг.6А). Уровни протеина GPC5 были также выше в GC тканях, чем в соседних нераковых тканей с использованием вестерн-блот (6В).

Обсуждение
<р> GC вызывает около одного миллиона случаев смерти в мире в год [25] , В последнее время накопившиеся данные предположил, что микроРНК играют решающую роль в патогенезе GC путем регуляции пролиферации клеток, апоптоз, миграцию, объявления вторжения [26-28]. В этом исследовании, микроРНК-217 часто подавляются в линиях и тканях человека GC клеток, а нижний уровень микроРНК-217 был связан с pTNM стадии ГХ. Дальнейшие эксперименты показали, что избыточная экспрессия микроРНК-217 может подавлять GC клеточную миграцию и инвазию. GPC5 был идентифицирован как прямой и функциональной мишени микроРНК-217. Мы пришли к выводу, что микроРНК-217 по-видимому, новым супрессоров опухоли в GC и что подавляются микроРНК-217 может способствовать развитию и прогрессии опухоли у пациентов GC. Подавление MIR-217 является частым событием в различные виды рака, предлагая свою важную роль в онкогенеза [17-19]. Ли и его коллеги показали, что микроРНК-217 был вниз регулируется в незашифрованном виде клеток почечно-клеточного рака (ccRCC) по сравнению с сопряженным нормальной ткани [29]. Нижний уровень экспрессии микроРНК-217 было связано с более высокой степени дифференцировки опухоли и стадии. В этом исследовании, микроРНК-217 часто подавляется в GC. Интересно, что пациенты с более низким уровнем экспрессии микроРНК-217 имели тенденцию к более продвинутой стадии TNM, предполагая, что низкий уровень экспрессии ofmiR-217was связано с прогрессированием GC. Дальнейшие исследования показали, что избыточная экспрессия микроРНК-217 подавленной вторжения GC и пролиферации клеток. Вместе с предыдущими результатами, эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-217might играют решающую роль в гомеостазе GC ткани и deregulatedmiR-217 может способствовать развитию желудка новообразованиях.
<Р> Для изучения молекулярного механизма роли опухолевого супрессора СИК-217 в GC, мы использовали анализ люциферазы репортер и вестерн-блот, чтобы подтвердить, что GPC5 был мишенью микроРНК-217 в GC клетках. Для подтверждения прямого регулирования GPC5 по микроРНК-217, мы использовали GPC 3 'UTR репортер вектор, несущий потенциальный сайт связывания микроРНК-217 в флуоресцентным репортером. Кроме того, QRT-PCR и вестерн-блот анализ показал, что избыточная экспрессия микроРНК-217 ингибирует экспрессию ГПХ. Glypicans представляют собой семейство протеогликанов, которые связаны с exocytoplasmic поверхности плазматической мембраны через гликозильная фосфатидилинозитол якоря [30, 31]. Шесть glypicans были идентифицированы у млекопитающих (GPC1 к GPC6) [32, 33]. GPC5 в основном выражается в развитии центральной нервной системы, конечностей, почек, легких и печени [34, 35]. Недавние исследования показали, что некоторые ГЦП, особенно GPC3 andGPC5, может играть важную роль в регуляции прогрессии рака [35, 36]. Например, Чжан
и др. показал, что GPC5 была высоко выражена в SACC-М (высокое легкого-метастатическим клеточная линия) и в клинических образцах слюнных лимфоидной кистозный карциномы (SACC) больных с метастазами в легких [36]. Общий уровень экспрессии GPC5 в клинических случаях SACC с метастазами в легких была выше. Уильямсон и др. показали, что ген, кодирующий GPC5was усиливается в 20% пациентов с альвеолярной рабдомиосаркома (RMS), и что этот глипикан был избыточно экспрессируется у пациентов RMS. Кроме того, понижающая регуляция экспрессии GPC5 с помощью миРНК ингибирует скорость пролиферации клеток RMS. Другое исследование показало, что высокие уровни экспрессии GPC5 предсказывали плохие послеоперационные выживаемости для целебно уважаемых пациентов с немелкоклеточным раком легких, что указывает на значение GPC5 как молекулярный прогностического показателя [35, 37]. В нашем исследовании экспрессия GPC5 была выше в линии GC клеток и уровни протеина GPC5 были также в дс тканях выше, чем в соседних нераковых тканей. Ингибирование GPC5 уменьшил пролиферацию клеток GC и вторжения. Восстановление MIR-217 ингибирует GPC5-опосредованной пролиферации клеток GC и инвазии. Эти результаты показали, что микроРНК-217might выступать в качестве супрессора опухоли при раке желудка с помощью таргетинга GPC5.

В заключение, данное исследование показало, что MIR-217was подавляются в GC тканях и клеточных линиях. Низкие уровни экспрессии микроРНК-217 были связаны с pTNM стадии пациентов. выражение Внематочная микроРНК-217 приводит к подавлению пролиферации GC клеток и вторжения. Дальнейшее исследование показало, что GPC5 был потенциальной мишенью микроРНК-217. микроРНК-217 может служить прогностическим для прогноза и терапевтической мишенью для пациентов GC.

Поддержка Информация
S1 Таблица. Резюме клинико-патологическими параметров больных раком желудка
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001
(DOCX)
S2 Таблица. Грунтовка последовательность
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX)

• PLoS ONE: микроРНК-137 Содействует расхоложенные онкогенеза в человека рака желудка с помощью таргетинга AKT2
• PLoS ONE: Анализ выживаемости пациентов с экранированием Интервальный рака Проходят рака желудка при эндоскопии