PLoS One: The MicroRNA-217 Funkcijos kaip potencialus auglio slopinamojo skrandžio vėžio nukreipiant GPC5

Anotacija

Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų visame pasaulyje. Naujus įrodymus parodė, kad dėl netipiško išraišką mikro RNR (miRNAs) vaidina svarbius vaidmenis vėžio progresavimą. Tačiau mažai žinoma apie galimą vaidmenį PPN-217 GC. Šiame tyrime mes tyrė PPN-217 vaidmenį GC ląstelių proliferaciją ir invazijos. Iš miR-217 išraiška buvo žemyn reguliuojama GC ląstelių ir žmogaus GC audiniuose. Vykdomas išraiška Pasaulis-217 slopino GC ląstelių proliferaciją ir invazijos. Be to, Glypican-5 (GPC5), naujas ocncogene, buvo įvardyta kaip potencialiais taikiniais PPN-217. Be to, padidėjusi miR-217 pablogėjusio GPC5 sukeltos skatinimo platinimu ir invazijos GC ląsteles. Taigi, šie duomenys rodo, kad Pasaulis-217 veikė kaip naviko slopintuvas ir slopina proliferaciją ir invazija GC ląstelių nukreipiant GPC5, kuris gali todėl tarnauti kaip terapinio tikslo GC pacientų

nurodomoji dalis:. Wangas O Dong X Gu X Čin R Jia O Gao J (2015) MicroRNA-217 Funkcijos kaip potencialus auglio slopinamojo skrandžio vėžio nukreipiant GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. Doi: 10,1371 /journal.pone.0125474

Redaktorius: Jun Li Sun Yat-sen Universiteto medicinos mokykla, KINIJA

Įstojo: Spalio 10, 2014; Priėmė: Kovo 24, 2015 m Paskelbta: Birželis 22, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:.. autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia žmogaus piktybinių navikų ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirčių visame pasaulyje, su apytikriai vienas milijonas naujų atvejų per metus [1-4]. Nepaisant pastaraisiais pažangos diagnostikos metodas, chirurginė technika ir naujų chemoterapijos, ilgalaikių išgyvenamumas GC vis dar gana žemas [5, 6]. Daugeliui pacientų, GC diagnozuojama vėlyvos stadijos, turintys didelę invaziją ir limfinės metastazių. Sėkmingi gydymo strategijas, yra riboti ir mirtingumas yra didelis. [7] Todėl būtina skubiai ištirti pagrindines molekulinius mechanizmus, sukeliančius atsparumo vaistams histologinis heterogeniškumas ir plėtrą metastazių nustatyti naujų žymenų diagnozės ir gydymo GC.

mikro RNR (miRNAs) yra mažas, maždaug 22 -nucleotide, ne kodavimo RNR, kurios veikia kaip neigiamą reguliavimo baltymų kodavimo genų tuo posttranscriptional lygį [8, 9]. Prisijungdamas prie papildomų sekų 3'-neišverstų regionuose (3'-UTR), iš jų tikslinėms mRNR, miRNAs gali sukelti tiesioginį iRNR savybių blogėjimą arba Pritaikomųjų slopinimą [10-13]. Daugėja įrodymų, nurodė, kad miRNAs dalyvauja daugelyje svarbių biologinių procesų, įskaitant ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, apoptozės, angiogenezę ir imuninio atsako. Dereguliavimas miRNAs gali sukelti nukrypusiu nuo normos genų ekspresijos įvairių ligų, įskaitant skrandžio vėžio [14-16]. Tačiau vaidmuo ir funkcijos miRNAs į GC supratimas yra vis dar ankstyvojoje stadijoje. Be to, daugelio kitų nenormaliai išreikštų miRNAs vaidmenis GC plėtros vis dar nežinoma.

downregulation miR-217 yra dažnas įvykis įvairių vėžio formų, rodo svarbų vaidmenį Tumorigenesis [17-19]. Tačiau mažai žinoma apie galimą vaidmenį PPN-217 GC. Šiame tyrime iš miR-217 išraiška sumažėjo GC ląstelių linijų ir audiniuose. Be to, mažesnis išraiška miR-217was susijęs su pTNM etape. Padidėjusi miR-217 slopino GC ląstelių invaziją ir proliferaciją. Be to, liuciferazės reporterio testą ir Vakarų dėmė patvirtino, kad Pasaulis-217might funkcija kaip naviko slopintuvas GC iki targetingGlypican-5 (GPC5).

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Visi pacientai sutiko dalyvauti tyrime ir davė raštišką informuoto sutikimo. Šis tyrimas ir sutikimas buvo patvirtintas etikos tarybos kontroliuojamų YANAN ligoninės Kunming medicinos universiteto instituto ir laikomasi deklaracijos Helsinkyje.

Audinių mėginiai

Pavyzdžiai žmogaus GC audinių ir suporuotas -adjacent ne naviko skrandžio audiniai, kurie buvo toliau kaip 5 cm nuo navikų buvo gauti iš 50 pacientų, kuriems buvo atlikta operacija rezekcija tuo susijusiam YANAN ligoninės Kunming medicinos universitete. Švieži mėginiai buvo įrankį šaldytų inliquid azoto iš karto po to, kai rezekcija ir saugomi -80 ° C temperatūroje. Visi mėginiai buvo gauti su pacientų informuoto sutikimo ir buvo histologinis patvirtino nudažant hematoksilinu-eozinu. Histologinis rūšies vėžio buvo vertinami pagal Pasaulio sveikatos organizacijos nustatytus kriterijus. Nė vienas iš pacientų gautos radioterapija ar chemoterapija prieš operaciją. Pacientų charakteristikos aprašytos S1 lentelėje.

Mobilaus ryšio linijų ir ląstelių kultūros

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas SGC-7901, HGC-27, MSV-803, MKN-45 ir vienas normalus skrandžio epitelio ląstelių linija GES-1 (kaip kontrolė) buvo nupirkta iš biochemijos ir ląstelės biologijos instituto Kinijos mokslų akademija (Šanchajus, Kinija). SGC-7901, HGC-27, MSV-803, MKN-45 buvo padauginti RPMI 1640 terpė (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) ir GES-1 buvo padauginti Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (Invitrogen). Visi žiniasklaidai buvo papildytas with10% vaisiaus galvijų kraujo serume. Ląstelių linijos buvo auginamos 37 ° C temperatūroje drėgnoje inkubatorius 5% CO2.

RNR gavybos ir KRL-PGR

bendra RNR buvo išskirta iš šaldytų mėginių (arba ląstelių), naudojant Trizol ( Invitrogen) pagal gamintojo instrukciją. 1ml RNR buvo naudojamas matuoti PPN-217 išraišką kiekybinė RT-PCR (KRL-PGR) su TaqMan Mirna atvirkštinės transkripcijos rinkinys andtheTaqMan Mirna pagrindinius branduolinių medžiagų analizės konkrečių RT gruntų Mir-217, pagal gamintojo nurodymus (taikoma Biosystems Foster City ĮA). Iš U6 išraiška buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Realaus laiko PGR buvo atliekama su 1ml kiekvieno kDNR laiptinio vienas plius Realaus laiko PGR sistema (Applied Biosystems Foster City ĮA) kopijose. MiR-217 išraiška buvo apibrėžtas remiantis slenkstinis ciklas (CT), ir santykinis ekspresijos lygiai buvo apskaičiuojamas as22 ^{- [(Ct miR-217) - (Ct U6)] po normalizuoti su nuoroda į išraiškos U6 mažas branduolinis RNR [20, 21] (S2 lentelė).}

Vakarų dėmė

viso baltymas išgaunamas iš šaldytų egzempliorių (arba ląstelių), naudojant Bendras baltymas nusiurbimu rinkinį (keygen, Nanjing , Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Matavimo baltymų koncentracija buvo padaryta naudojant BCA Baltymai Analizės rinkinį (keygen). Western Blot analizė buvo atlikta kaip buvo aprašyta anksčiau [22]. Naudojamos Vakarų dėmė pirminiai antikūnai buvo triušis polikloninis kovos su GPC5 (Santa Krusas Biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija, JAV), pelės monokloninis anti-GAPDH (Mobilusis Signalizacijos Technologijos Beverly, MA, JAV).

Mobilusis transfekcija

mir-217 mimikos, mimikos kontrolė (įsiropšti), PPN-217 inhibitoriaus, inhibitorius kontrolė, pez-GPC5 ir kontrolės vektorius buvo įsigytas iš RiboBio (Guangzhou, Kinija). Į HGC-27 ląstelių buvo pasėjamos į šešių duobučių lėkštelėse esant 30% santakoje vieną dieną prieš transfekciją. Lipofectamine2000 (Invitrogen) buvo naudojamas transfekciją plazmidžių atskirai arba kartu su RNR nukleotidų,.

liuciferazės tyrimai

ląstelės 8 × 10 ^{3 buvo padengtas į 96-duobučių lėkštelėse. Po 24-hincubation, iš 100-ng mišinys plaučių-3'-UTR, 5-pmol neigiamos kontrolės, PPN-217mimic buvo cotransfected su 20 ng Renilla į ląsteles naudojant Lipofectamine 2000. dvidešimt keturi hoursafter transfekcija, Firefly ir Renilla liuciferazės veikla buvo matuojamas Dual-liuciferazės Reporter sistemos (Promega, Madison, WI, JAV). Transfekcija efektyvumas normalizavosi kontransfekcijai su Renilla reporteris vektorių.}

ląstelių proliferacija

ląstelių (3000 /gerai), buvo surinkti ir pasėjamos į 96 wellplates ir inkubuojami 37 ° C temperatūroje, po transfekciją. Po inkubacijos nuo 1 iki 5 dienų, į buvo įtraukta kiekvieno šulinio laikmenos 10% Mobilusis skaičiavimas Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japonija), o plokštelės buvo toliau inkubuojami dar 3 valandas 37 ° C temperatūroje. Tada, žiniasklaida buvo pakeistas su 150 ml dimetilsulfoksido (DMSO; Sigma-Aldrich), ir absorbcija buvo matuojamas esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant mikroplokštelės skaitytuvą (Sunrise). Tyrimas buvo pakartotas 3 kartus su šešiais pakartojimais.

Šiaurės dėmė

Viso RNR buvo išskirta iš kiekvieno audinio naudojant TRIzol reagento (INVITROGEN Life technologies) ir Šiaurės blotingą buvo atliktas kaip Ankstesnis aprašyta [23] , Po Perfect mišr Plus hibridizacija 68 ° C, membranos buvo sukurta ir analizuojami. Šiaurės dėmės hibridizavosi su 18S ribosomų RNR (rRNR) kDNR buvo naudojami kaip kontrolės.

Mobilaus ryšio invazija

Invazija tyrimai buvo atliekami tris kartus, naudojant Transwell invazija kameras padengtas Matrigel (BD, JAV) aprašyta gamintojo protokolu. Ląstelės buvo pernešta withmiR-217 imituoja inhibitoriaus, arba neigiamos kontrolės oligonukleotido kultūringas 48 h, ir perkelti ant Matrigel-dengtų invazija rūmų viršuje iš DMEM serumo nemokamai (1 × 10 ^{5 ląstelės per Transwell). DMEM, kurių sudėtyje yra 10% serumas iš veršiuko embriono buvo įtraukta į apatinių kamerų. Po inkubacijos 24 h, ląstelių, kad liko ant filtro viršuje buvo trinama išjungti ir ląstelių, kurios patekę į apatinio paviršiaus buvo nustatyti in90% alkoholio ir po to, metilvioletinio dėmių.}

Histologija

histologinis diagnozė pagal trijų svetainę skrandžio biopsijos metodu. Audiniai buvo nustatytos per naktį buferiniame formalino, įterptųjų parafinu, supjaustyti 3 mikronų storio, ir tamsintas hematoksilinu-eozinu ( "H & E). Dažymosi

Statistinė analizė

buvo atliekama Statistinė analizė naudojant SPSS 17.0 statistinį programinį paketą. Eksperimentai buvo pakartoti savarankiškai bent tris kartus, o duomenys pateikiami kaip priemonėmis ± SD. Tarp miR-217 ir GPC5 asociacija buvo analizuojami naudojant Spearman koreliacijos testą. Palyginimai tarp grupių statistinis reikšmingumas buvo atliekami su Stjudento porinio du tailed T-testo arba ANOVA. P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

rezultatas

Apie miR-217 išraiška downregulated GC ląstelių linijų

Pirma kiekybiškai raiškos lygį PPN-217 iš keturių žmogaus GC ląstelių linijas (SGC-7901, HGC-27, MSV-803, MKN-45) ir GES-1, naudojant šiaurinę dėmė (pav 1A). Sąvoka lygis miR-217 wasdecreased GC ląstelių linijų, palyginti su GES-1. QuantitativeRT-PGR taip pat parodė, kad miR-217 išraiška sumažėjo GC ląstelių linijas (SGC-7901, HGC-27 MSV-803, MKN-45), lyginant su GES-1, normalus skrandžio epitelio ląstelių linijos (pav 1B ).

MIR-217 yra downregulated GC audinių

Kiekybinė PGR buvo nagrinėjama Pasaulis-217 išraišką 50 GC audinių ir jų suporuotas gretimų noncancerous audiniuose. Tipinės histologiniai charakteristikos GC ir jos suporuotas gretimų noncancerous audiniuose buvo parodyta pav 2A. Tarp 50 navikų audiniuose, 44 eksponavimo atvejai sumažėjo ir miR-217 išraiška, palyginti su gretimų normaliuose audiniuose (88%, 44, 50, pav 2b). Iš miR-217 išraiška buvo mažesnė GC audinių nei gretimose noncancerous audinių (pav 2C). Be to, žemesnio lygio PPN-217 raiškos, susijusios su pTNM etape GC pacientų (pav 2D).

Pasaulis-217 slopina GC ląstelių proliferacija ir invazija

PPN-217was išraiška padidėjo į Transfekuoti HGC-27 ląstelių naudojant Pasaulis-217 imituoja (pav 3a) ir sumažėjęs naudojant Pasaulis-217 inhibitoriaus (pav 3b). Platinimas buvo sumažintas per HGC-27 ląstelių perkeltų withmiR-217 imituoja palyginti su ląstelėmis transfektuotose užšifruoti ar neapdorotas (pav 3c). Tuo tarpu, proliferacija buvo padidintas HGC-27 ląstelių perkeltų withmiR-217inhibitor palyginti su ląstelėmis transfektuotose kontrolės ar neapdorotas (pav 3D). Ląstelių transfektuotose Pasaulis-217 imituoja invazyvumas sumažėjo palyginus su peštynės grupės ar kontrolės grupės ląstelių ir miR-217 inhibitoriaus padidintą ląstelių invazija palyginti su peštynės grupės ar kontrolės grupės ląstelių (pav 3E).

miR -217 posttranscriptional sumažina GPC5 išraiška tiesiogiai nukreipti jos 3'UTR

analizė, naudojant laisvų algoritmai nurodė, kad GPC5 buvo teorinis taikinio geno miR-217 (pav 4a) [24]. Norėdami įrodyti, kad Pasaulis-217 tiesiogiai nukreipta į GPC53'UTR, mes atliekame liuciferazės reporteris genų tyrimų. Negimdinis miR-217 sumažinto liuciferazės aktyvumo GPC5 laukinio tipo reporteris geno, bet ne mutantas GPC5 3'UTR, nurodant, kad Pasaulis-217 tiesiogiai nukreipta į GPC5 3'UTR (pav 4b). MRNR lygis GPC5 sumažėjo po transfekciją su Pasaulis-217 imituoja ir padidėjo po transfekciją su Pasaulis-217 inhibitoriaus naudojant KRL PGR (pav 4c). Laikantis šio rezultatas, miR-217 gebėjimą reguliuoti GPC5 baltymo ekspresiją buvo patikrintas Imunoblotingo (pav 4D).

Restauravimas miR-217 slopina GPC5 tarpininkaujant GC ląstelių proliferaciją ir invazija

"Padidėjusi GPC5 skatinamas GC ląstelių proliferaciją ir invazija. Kai Pasaulis-217 mimikos ir Pez-GPC5 buvo cotransfected į HGC-27 ląstelių, PPN-217 išraiška sumažino GPC5 sukeltos GC ląstelių proliferaciją ir invazija (pav 5A ir 5c). Slopinimas GPC5 sumažino GC ląstelių proliferaciją ir invazija. Kai Pasaulis-217 inhibitoriaus ir shGPC5 buvo cotransfected į HGC-27 ląstelių, PPN-217 inhibitoriaus skatino shGPC5-slopinamas ląstelių proliferaciją ir invazija (pav 5B ir 5d).

GPC5 yra aktyvinama GC ląstelių linijų ir mėginių

iš GPC5 išraiška buvo didesnis GC ląstelių linijas (SGC-7901, HGC-27, MSV-803, MKN-45), lyginant su GES-1, normalus skrandžio epitelio ląstelių linija (pav 6A). Baltymų lygiai GPC5 taip pat buvo didesnis GC audinių negu gretimose noncancerous audinių, naudojant Vakarų dėmė (pav 6b).

Diskusijos

GC sukelia beveik vienas milijonas mirčių visame pasaulyje per metus [25] , Neseniai kaupiasi įrodymai rodo, kad miRNAs vaidina lemiamą vaidmenį GC patogenezės per reguliuojant ląstelių proliferaciją, apoptozę, migracijos, skelbimai invazija [26-28]. Šiame tyrime, PPN-217 buvo dažnai downregulated žmogaus GC ląstelių linijų ir audinių ir žemesnio lygio miR-217 buvo susijęs su pTNM etape GC. Daugiau eksperimentai parodė, kad padidėjusi miR-217 gali slopinti GC ląstelių migraciją ir invazija. GPC5 buvo įvardytas kaip tiesioginė ir funkcinio taikinio PPN-217. Galime daryti išvadą, kad Pasaulis-217 atrodo, kad romanas navikas slopintuvas GC ir kad downregulated Pasaulis-217, gali prisidėti prie naviko vystymosi ir progresavimo GC pacientams. Downregulation miR-217 yra dažnas įvykis įvairių vėžio formų, rodo svarbų vaidmenį Tumorigenesis [17-19]. Li ir jo kolegos parodė, kad Pasaulis-217 buvo žemyn reguliuojama aišku ląstelių inkstų ląstelių karcinoma (ccRCC), palyginti su suporuotas normalaus audinio [29]. Žemutinė Pasaulis-217 raiškos lygis buvo susijęs su didesne naviko rūšies ir stadijos. Šiame tyrime, PPN-217 buvo dažnai downregulated GC. Įdomu, pacientai, sergantys žemesnės raiškos PPN-217 linkusios turėti daugiau pažangių TNM etapą, o tai rodo, kad mažos raiškos ofmiR-217was susijęs su GC progresavimą. Tolesni tyrimai parodė, kad Pasaulis-217 nutylėtų GC ląstelių invazija ir platinimu raiška. Kartu su ankstesniais rezultatais, šie duomenys rodo, kad Pasaulis-217might vaidina lemiamą vaidmenį GC audinių homeostazę ir deregulatedmiR-217, gali prisidėti prie skrandžio navikų vystymosi.

Jei tirti molekulinės mechanizmas auglio slopinamojo vaidmenį miR-217 GC, mes panaudojome liuciferazė reporterio testą ir Vakarų dėmė patvirtinti, kad GPC5 buvo miR-217 tikslas GC ląsteles. Norėdami patvirtinti tiesioginį reguliavimą GPC5 pagal miR-217, mes panaudojome GPC 3 "UTR reporteris vektorių guolis galimą Pasaulis-217 prijungimo vietos liuminescencinių reporteris. Be to, KRL-PGR ir Vakarų dėmė tyrimas parodė, kad padidėjusi miR-217 slopinamas GPC išraiška. Glypicans yra proteoglikanų šeimos, kad yra susijęs su exocytoplasmic paviršiaus plazminės membranos per glikozilo fosfatidil inkaro [30, 31]. Šeši glypicans buvo nustatyti žinduolių (GPC1 į GPC6) [32, 33]. GPC5 daugiausia išreiškė plėtojant centrinę nervų sistemą, galūnių, inkstų, plaučių ir kepenų [34, 35]. Naujausi tyrimai rodo, kad kai kurie GPCs, ypač GPC3 andGPC5, gali vaidinti svarbų vaidmenį reguliuojant vėžio progresavimą [35, 36]. Pavyzdžiui, Zhang
et al., parodė, kad GPC5 buvo labai išreikštas SACC-M (didelio plaučių metastazių ląstelių linija) ir klinikinių mėginių seilių adenoidai cistine karcinoma (SACC) atvejais, sergančių plaučių metastazių [36]. Bendras išraiška lygis GPC5 klinikinių atvejų SACC, sergančių plaučių metastazių buvo didesnis. Williamson ir kt. parodė, kad genas, koduojantis GPC5was papildyta 20% pacientų, sergančių alveolių rabdomiosarkoma (RMS), ir kad tai glypican buvo ekspresija per RMS pacientams. Be to, žemyn reguliavimas GPC5 išraiškos siRNA slopino platinimo norma RMS ląsteles. Kitas tyrimas parodė, kad didelis GPC5 išraiškos prognozuojama prastos postsurgical išgyvenimo kartus dėl gydomojo gerbiamas NSLPV sergantiems pacientams, siūlydamas GPC5 vertę kaip molekulinės prognostinį rodiklis [35, 37]. Mūsų tyrime GPC5 išraiška buvo didesnis GC ląstelių linijų ir baltymų lygiai GPC5 taip pat buvo didesnis GC audinių nei gretimose noncancerous audiniuose. Slopinimas GPC5 sumažino GC ląstelių proliferaciją ir invazija. Restauravimas miR-217 slopinamas GPC5 tarpininkaujant GC ląstelių proliferaciją ir invazija. Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-217might veikti kaip naviko slopintuvas skrandžio vėžio nukreipiant GPC5.

Taigi, dabartinis tyrimas parodė, kad Mir-217was downregulated GC audinių ir ląstelių linijų. Žemo lygio miR-217 išraiškos buvo susijęs su pTNM etape pacientų. Negimdinis Pasaulis-217 išraiška lėmė slopinimu GC ląstelių proliferaciją ir invazijos. Daugiau tyrimas atskleidė, kad GPC5 buvo potencialus taikinys miR-217. Pasaulis-217, gali tarnauti kaip prognozės prognozuoti ir terapinio tikslo GC pacientams.

Pagalbinė informacija
S1 lentelę. Santrauka klinikos parametrų pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001
(docx)
S2 lentelė. Gruntas seka
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002
(docx)

• PLoS ONE: MicroRNA-137 Prisideda prie prislopinti tumorigenezei žmogaus skrandžio vėžio nukreipiant AKT2
• PLoS ONE: išgyvenamumo analizė pacientams, sergantiems Intervalas Vėžys išgyvena skrandžio vėžio atrankinės patikros Endoscopy