PLoS ONE: U mikrornk-217 Funkcije kao potencijalni tumor supresor u rak želuca ciljajući GPC5

Sažetak pregled

Rak želuca (GC) je jedan od najčešćih malignih bolesti u svijetu. Emerging dokazi pokazuju da neprirodni izraz mikroRNA (miRNAs) igra važnu ulogu u progresiji karcinoma. Međutim, malo se zna o potencijalnom ulogom MIR-217 u GC. U ovoj studiji, istražili smo ulogu MIR-217 na proliferaciju GC stanice i invaziju. Izraz Mir-217 je dolje regulirana u GC stanicama i ljudskih GC tkiva. Prisilni izraz Mir-217 proliferacije inhibiran GC stanice i invaziju. Štoviše, Glypican-5 (GPC5), novi ocncogene, identificiran kao potencijalni cilj MIR-217. Osim toga, prekomjerna ekspresija Mir-217 oslabljen GPC5 izazvanu promicanje proliferacije i invazije u GC stanicama. U zaključku, ova otkrića pokazala je da Mir-217 djeluje kao supresor tumora i inhibiraju proliferaciju i invaziju GC stanicama ciljajući GPC5, što posljedično može poslužiti kao terapijski cilj za GC pacijenata pregled

Izvor:. Wang H Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) na mikrornk-217 Funkcije kao potencijalni tumor supresor u rak želuca ciljajući GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474 pregled

Urednik: lipanj Li, Sun Yat-sen Medicinski fakultet Sveučilišta, Kina pregled

Primljeno: 10. listopada 2014.; Prihvaćeno: 24. ožujak 2015; Objavljeno: 22. lipnja 2015 pregled

Copyright: © 2015 Wang et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

financiranje:.. autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je četvrti najčešći ljudskih malignoma i drugi vodeći uzrok smrti od raka povezanih diljem svijeta, s procijenjenih milijun novih slučajeva godišnje [1-4]. Unatoč nedavnim iskoracima u dijagnostičkom postupku, kirurške tehnike i nove kemoterapije, dugotrajno stopa preživljavanja za GC je još uvijek vrlo niska [5, 6]. U mnogim pacijentima, GC se dijagnosticira u poodmakloj fazi s velikim invazije i limfne metastaze. Uspješni terapijske strategije su ograničena, a smrtnost je visoka [7]. Dakle, to je hitno istražiti temeljne molekularne mehanizme na kojima se temelji otpornost na lijek, histološki heterogenost, kao i razvoj metastaza identificiranja novih markera za dijagnozu i tretman za GC. Pregled

mikroRNA (miRNAs) su mali, oko 22 -nucleotide, nekodirajuće RNA koji djeluju kao negativni regulatori gena kodiraju protein na posttranskripcijsko razini [8, 9]. Vezanjem na komplementarne sljedove u 3'-netranslatiranim područjima (3'-UTR) od svoje ciljne mRNA, miRNAs mogu inducirati izravnu degradacija mRNA ili translacijsku inhibicije [10-13]. Dokazi su pokazala da su miRNAs uključena u brojne važne biološke procese, uključujući stanične proliferacije, diferencijacije, apoptoze i angiogeneze imunog odgovora. Deregulacija miRNAs može dovesti ekspresiji gena kod različitih bolesti uključujući rak želuca [14-16]. Međutim, razumijevanje uloge i funkcije miRNAs u GC je još uvijek u ranoj fazi. Isto tako, uloge mnogih drugih neprirodno izraženi miRNAs u razvoju GC su još uvijek nepoznati. Pregled

silazni Mir-217 je česta pojava u različitim oblicima raka, što upućuje na njegovu važnu ulogu u nastanku tumora [17-19]. Međutim, malo se zna o potencijalnom ulogom MIR-217 u GC. U ovom istraživanju, izraz Mir-217 je smanjen u staničnim linijama i tkivima GC. Osim toga, niži izraz Mir-217was povezana s pTNM fazi. Prekomjerna ekspresija MIR-217 potisnuta GC invazije stanica i proliferacije. Nadalje, Reporterski test i Western blot potvrdio da Mir-217might funkcioniraju kao supresor tumora u GC strane targetingGlypican-5 (GPC5). Pregled

materijali i postupci

Etika Izjava pregled

Svi su bolesnici pristali sudjelovati u istraživanju i dao pismeni pristanak. Ova studija i suglasnost je odobren od strane etičkog odbora instituta povezanih Yanan bolnici Kunming medicinskog sveučilišta i poštuje deklaracije u Helsinkiju. Pregled

Uzorci tkiva

Uzorci ljudskih GC tkiva i paru -adjacent ne-tumorske želučani tkiva koji su bili dalje od 5 cm od tumora dobiveni su od 50 pacijenata koji su bili podvrgnuti operaciji resekcija na povezanim Yanan bolnici Kunming Medicinskom fakultetu Sveučilišta. Svježi uzorci su nakon toga brzinski zamrznute inliquid dušik neposredno nakon resekcije i pohranjeni na -80 ° C. Svi uzorci su dobiveni uz informirani pristanak pacijenta te su histološki potvrđeno bojenjem s hematoksilin-eozinom. Histološka stupanj raka je ocijenjen prema kriterijima Svjetske zdravstvene organizacije. Nijedan od pacijenata primili radioterapiju ili kemoterapiju prije operacije. Karakteristike bolesnika opisane su u S1 tablici. Pregled

staničnih linija i kultura stanica pregled

ljudskog želuca stanične linije raka SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 i jedan normalan želučanog epitela stanične linije GES-1 (kontrola) kupljeni su od Instituta za biokemiju i staničnu biologiju pri kineskoj akademiji znanosti (Shanghai, Kina). SGC-7901, HGC-27 MGC-803, MKN-45 su umnožene u RPMI 1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), te GES-1 se širi u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (Invitrogen). Svi su mediji uz dodatak with10% fetalnog goveđeg seruma. Stanične linije su kultivirane na 37 ° C u vlažnom inkubatoru s 5% CO2. Pregled

ekstrakcija RNA i QRT-PCR pregled

Ukupna RNA bila je ekstrahirana iz zamrznutih uzoraka (ili stanice) pomoću Trizola ( Invitrogen) nakon vodič proizvođača. 1 ml RNA se koristi za mjerenje ekspresije Mir-217 kvantitativnim RT-PCR (QRT-PCR) s TaqMan Mirna reverzne transkripcije kit andtheTaqMan Mirna testa specifična RT početnice za MIR-217 u skladu s uputama proizvođača (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ekspresija U6 je korišten kao unutrašnji standard. Real-time PCR je izvedena s 1 ml svakog cDNA na korak Jedan plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) u duplikate. Izraz Mir-217 je definirana na temelju praga ciklusa (CT) i relativne razine ekspresije su izračunate as22 ^{- [(CT Mir-217) - (CT U6)] nakon normalizacije s obzirom na ekspresiju U6 mali nuklearni RNA [20, 21] (S2 Tablica). pregled}

Western blot pregled

Ukupni protein je ekstrahirana iz zamrznutih uzoraka (ili stanica), koristeći ukupno protein Extraction Kit (keygen, Nanjing Kina) u skladu s uputama proizvođača. Mjerenje koncentracije proteina je određena pomoću BCA proteinskog testa Kit (keygen). Western blot analiza je provedena kao što je opisano [22]. Primarna antitijela se koriste za western blot su zečjeg protutijela anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), mišje monoklonsko anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Pregled

Cell transfekcija pregled

Mir-217 oponašati, imitirati kontrola (otimati), Mir-217 inhibitor, kontrola inhibitor, pez-GPC5 i kontrolu vektora su kupljeni od RiboBio (Guangzhou, Kina). U HGC-27 stanice su posađene u šest jažica na 30% spajanja jedan dan prije transfekcije. Lipofectamine2000 (Invitrogen) je korišten za transfekciju plazmida sami ili zajedno s RNA oligonukleotida. Pregled

Luciferaze testovi pregled

stanice 8 × 10 ^{3 su stavljene u pločice s 96 jažica. Nakon 24 hincubation, smjesa 100 ng pLUC-3'-UTR, negativna kontrola 5 pmol, miR-217mimic je transfektirano s 20 ng Renilla u stanice pomoću Lipofectamin-a 2000. Dvadeset četiri hoursafter transfekciju Firefly i aktivnosti Renilla luciferaze bila mjereno sa Dual-luciferaze System (Promega, Madison, WI, USA). Učinkovitost transfekcije se normalizira kotransfekcijom s Renilla reporter vektor. Pregled}

stanične proliferacije pregled

Stanice (3000 /i) su bile sakupljene i zasijane u 96-wellplates i inkubira na 37 ° C nakon transfekcije. Nakon inkubacije od 1 do 5 dana, dodan je medij iz svake jamice 10% brojanja Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan), a ploče su dalje inkubirana još 3 sata na 37 ° C. Zatim je medij zamijenjen sa 150 mL dimetil sulfoksidu (DMSO; Sigma-Aldrich), a apsorbancija je mjerena na 450 nm upotrebom čitača za mikroploče (izlazak). Esej je ponovljen 3 puta sa šest replika. Pregled

Northern blot pregled

Ukupna RNA je izolirana iz svake tkiva pomoću Trizol reagensa (Invitrogen Life Technologies) blotting i Northern blotting je provedeno u prethodno opisano [23] , Sljedeći Perfect Hib Plus hibridizaciju pri 68 ° C, membrane su bile razvijene i analizirane. 'Northern blot hibridizirani s 18S ribosomske RNA (rRNA) cDNA su korišteni kao kontrola. Pregled

invazije stanica pregled

Invazija testovi su izvedeni u triplikatu upotrebom transjažična invaziju komore presvučene sa Matrigel-om (BD, USA) kao je opisano u uputama proizvođača. Stanice su transficirane withmiR-217 imitiraju, inhibitor ili negativni kontrolni oligonukleotid, uzgajane su 48 sati, i prenose na vrhu Matrigel® obložene invazije komora u DMEM bez seruma (1 × 10 ^{5 stanica po transjažična). DMEM koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma doda se u donje komore. Nakon inkubacije od 24 sata, stanice koje su ostale na vrhu filtera se pročišćenu se i stanice koje su migrirale na donju površinu su fiksirane in90% alkohola i zatim kristal ljubičaste boje. Pregled}

Histologija pregled

Histološka dijagnoza je bila u skladu s postupkom želuca biopsijom triple-site. Tkiva su fiksirani preko noći u puferiranom formalinu, uklopljeno u parafin, smanjiti na debljine 3 um, i obojene hematoksilin-eozinom (H &E). Bojenje pregled

Statistička analiza pregled

izvedeni su Statističke analize pomoću SPSS 17.0 statističkog programskog paketa. Pokusi su ponovljeni samostalno najmanje tri puta, a podaci su prikazani kao prosjek ± SD. Povezanost između MIR-217 i GPC5 analizirana je pomoću Spearmanov korelacije testa. Usporedbe između skupina za statističke značajnosti su provedena uz pomoć Studentskog uparenim dva kraka t-test ili jednosmjerna ANOVA. P < 0,05 smatrala se statistički značajna. Pregled

Rezultat pregled

Izražavanje Mir-217 je regulirani u staničnim linijama GC

prvo kvantificirati razinu ekspresije Mir-217 u četiri ljudske linije GC stanica (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) i GES-1 pomoću northern blot (Slika 1a). Razina ekspresije Mir-217 wasdecreased u staničnim linijama GC usporedbi s GES-1. QuantitativeRT-PCR je također pokazalo da je ekspresija Mir-217 je smanjen u staničnim linijama GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) u usporedbi s GES-1, normalan želučane epitelnih stanica linije (Slika 1B ). pregled

Mir-217 je regulirani u GC tkiva pregled

Kvantitativna RT-PCR je koriste za ispitivanje Mir-217 izražavanje u 50 GC tkivima i njihovim uparenih susjednih noncancerous tkiva. Reprezentativni histološke GC i njegovih upareni susjedna netumorskih tkivima što je prikazano na slici 2A. Među 50 tumorskim tkivima, 44 slučaja pokazale smanjen Mir-217 izraza u usporedbi sa susjednim normalnim tkivima (88%, 44 od 50, slika 2b). Izraz Mir-217 bila je niža u GC tkivima nego u susjednim noncancerous tkiva (slika 2c). Osim toga, niže razine Mir-217 izražavanja povezana s pTNM fazi GC bolesnika (Slika 2D). Pregled

Mir-217 inhibira proliferaciju GC stanica i invazija pregled

izraz Mir-217was povećala u transfektirane HGC-27 stanica pomoću mir-217 oponaša (Slika 3a) i smanjiti koristeći mir-217 inhibitor (slika 3B). Proliferaciju je smanjena na HGC-27 stanicama koje su transfektirane withmiR-217 oponaša usporedbi sa stanicama koje su transfektirane s jagma ili netretiranim (slika 3C). U međuvremenu, proliferacija je povećan u HGC-27 stanica transficiranih withmiR-217inhibitor u usporedbi sa stanicama zaraženim s kontrolom ili ne liječi (slika 3D). Invazivnosti stanica transficiranih Mir-217 oponaša je smanjen u odnosu na skupinu stanica otimati grupe ili kontrolne i Mir-217 Inhibitor povećana invazije stanica u usporedbi sa stanicama grupe otimati grupe ili kontrole (Slika 3e).

Mir -217 posttranskripcijsko smanjuje ekspresiju GPC5 izravno ciljanje njegove 3'UTR pregled

analiza pomoću dostupnih algoritama naznačeno da GPC5 je teoretski ciljni gen Mir-217 (slika 4a) [24]. Kako bi dokazali da je Mir-217 direktno ciljano GPC53'UTR, proveli smo luciferaza eseji reporter gen. Ektopično Mir-217 smanjene aktivnosti luciferaze u GPC5 divljeg tipa reporterskim genom, ali ne i mutant GPC5 3'UTR, što znači da miR-217 direktno ciljano GPC5 3'UTR (Slika 4B). MRNK razina GPC5 smanjena nakon transfekcije s miR-217 oponaša i povećana nakon transfekcije miR-217 inhibitora pomoću QRT-PCR (slika 4c). U skladu s tim rezultatom, sposobnost Mir-217 regulira ekspresiju GPC5 proteina verificirano od strane zapadne upijajući (Slika 4D). Pregled

Obnova Mir-217 inhibira proliferaciju GC stanica GPC5 posredovane i invaziju

Prekomjerna ekspresija GPC5 promovirao proliferaciju GC stanica i invaziju. Kad Mir-217 oponašaju i pez-GPC5 su kontraučinak u HGC-27 stanica Mir-217 ekspresija smanjuje proliferaciju GC stanica GPC5 izazvanu i invaziju (Slika 5a i 5c). Inhibicija GPC5 smanjuje proliferaciju GC stanica i invaziju. Kad Mir-217 inhibitora i shGPC5 su kontraučinak u HGC-27 stanice, Mir-217 Inhibitor promovirao proliferaciju shGPC5-inhibira stanice i invaziju (Slika 5b i 5d). Pregled

GPC5 je reguliran u staničnim linijama i uzorcima GC pregled

ekspresija GPC5 bila je veća u stanicama GC (sGC-7901, HGC-27 MGC-803, MKN-45), u usporedbi s GES-1, normalno želučani stanična linija epitelnih stanica (Slika 6A). Razine proteina od GPC5 su bili viši u GC tkivu nego u susjednim netumorskih tkiva pomoću western blot (slika 6b). Pregled

Rasprava pregled

GC uzrokuje gotovo milijun smrtnih slučajeva godišnje u svijetu [25] , Nedavno, gomilaju dokazi ukazuju da su miRNAs igraju ključnu ulogu u patogenezi GC kroz reguliranju stanične proliferacije, apoptoze, migraciju, oglasi invaziju [26-28]. U ovom istraživanju, Mir-217 je često regulirani u ljudskim GC stanicama i tkivima, a niža razina Mir-217 je bio povezan s pTNM fazi GC. Daljnji eksperimenti pokazuju da prekomjerna ekspresija Mir-217 može suzbiti GC staničnu migraciju i invaziju. GPC5 je identificiran kao izravni i funkcionalnog cilj MIR-217. Možemo zaključiti da miR-217 čini se da je novi tumor supresor za GC, te da downregulated miR-217 može doprinijeti razvoju tumora i progresiji u GC pacijenata. Regulacija Mir-217 je česta pojava u različitim oblicima raka, što upućuje na njegovu važnu ulogu u nastanku tumora [17-19]. Li i njegovi kolege pokazali su da Mir-217 je dolje regulirano jasno stanica karcinoma bubrežnih stanica (ccRCC) u usporedbi s uparenim normalnog tkiva [29]. Niža razina ekspresije Mir-217 bio povezan s višom ocjenom tumora i stadiju. U ovom istraživanju, Mir-217 je često regulirani u GC. Zanimljivo, pacijenti s nižom ekspresijom MIR-217 obično imaju više naprednih TNM stadij, sugerirajući da je niska izraz ofmiR-217was povezana s GC napredovanje. Daljnje studije pokazale su da izražajnost Mir-217 potisnute GC invazije stanice i proliferacije. Zajedno s prethodnim rezultatima, ti podaci ukazuju na to da Mir-217might igraju ključnu ulogu u homeostazi GC tkiva i deregulatedmiR-217 mogu doprinijeti razvoju želudac neoplazije. Pregled

Kako istražiti molekularni mehanizam Tumor supresor ulozi Mir-217 u GC, koristili smo reporter Luciferaze i western blot potvrditi da GPC5 bio meta MIR-217 u GC stanicama. Za potvrdu izravnu regulaciju GPC5 po MIR-217, koristili smo GPC 3 'UTR reporter vektor koji nosi potencijalnu Mir-217 vezno mjesto u fluorescentnim reporter. Nadalje, QRT-PCR i Western blot analiza pokazala je da prekomjerna ekspresija Mir-217 inhibirana GPC izraz. Glypicans su familija proteoglikana koji su povezani s exocytoplasmic površine plazmatske membrane preko glikozil fosfatidilinozitol sidro [30, 31]. Šest glypicans su identificirane u sisavaca (GPC1 do GPC6) [32, 33]. GPC5 uglavnom izražen u razvoju središnji živčani sustav, udovi, bubrega, pluća i jetre [34, 35]. Nedavna istraživanja su pokazala da su neki GPCs, pogotovo GPC3 andGPC5, mogla igrati važnu ulogu u reguliranju raka napredovanje [35, 36]. Na primjer, Zhang pregled i sur. pokazala je da GPC5 je vrlo izražena u SACC-M (visoka linija stanica pluća metastatski), te u kliničkim uzorcima sline adenoidnocističnog cistične karcinoma (SACC) slučajeva s metastaza pluća [36]. Ukupna razina ekspresije GPC5 u kliničkim slučajevima SACC s pluća metastaza bio veći. Williamson et al. pokazali su da gen koji kodira GPC5was amplificiran je u 20% bolesnika s alveolarne rabdomiosarkom (RMS) i da to glypican je izraženo u RMS pacijenata. Štoviše, down-regulacija GPC5 izražavanja siRNA inhibira brzinu širenja RMS stanica. Druga studija je pokazala da visoke razine GPC5 izražavanja predvidjeti loše poslijeoperacijske trajanje života za ljekovito poštuju NSCLC bolesnika, što ukazuje na vrijednost GPC5 kao molekularni prognostičkog pokazatelja [35, 37]. U našoj studiji, izraz GPC5 bila je veća u staničnim linijama GC i razina proteina u GPC5 također su bili veći u GC tkivima nego u susjednim noncancerous tkiva. Inhibicija GPC5 smanjuje proliferaciju GC stanica i invaziju. Obnova Mir-217 inhibirana proliferaciju GC stanica GPC5 posredovane i invaziju. Ovi rezultati su pokazali da je Mir-217might djelovati kao supresor tumora kod raka želuca ciljajući GPC5. Pregled

U zaključku, ova studija je pokazala da Mir-217was regulirani u GC tkivima i stanicama. Niske razine Mir-217 izražavanja su bili povezani s pTNM fazi pacijenata. Ektopično Mir-217 ekspresija rezultiralo inhibiciju proliferacije GC stanice i invaziju. Daljnja istraga otkrila je da GPC5 bio potencijalna meta MIR-217. Mir-217 može poslužiti kao prediktor za prognozu i terapijski cilj za GC pacijenata. pregled

popratne podatke
S1 tablicu. Sažetak kliničkopatološkim parametara bolesnika s karcinomom želuca pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001 pregled (docx) pregled S2 stol. Primer slijed pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002 pregled (docx) pregled

• PLoS ONE: mikrornk-137 Doprinosi namočenom tumorigenezi u ljudskoj raka želuca ciljajući AKT2
• PLoS ONE: Survival analiza pacijenata sa Interval Rak Prolazi rak želuca Screening by Endoscopy