PLoS One: A mikro-RNS-217 működik, mint egy potenciális tumor szupresszor gyomorrákban megcélozva GPC5

absztrakt katalógusa

A gyomorrák (GC) az egyik leggyakoribb rosszindulatú világszerte. Feltörekvő bizonyítékok azt mutatják, hogy a kóros expressziója mikroRNS (miRNS) fontos szerepet játszik a daganatos progresszió. Azonban keveset tudunk a lehetséges szerepét a miR-217 GC. Ebben a vizsgálatban betöltött szerepét vizsgáltuk a miR-217 GC sejtburjánzás és invázióját. A kifejezés a miR-217-t lefelé szabályozni a GC-sejtek és az emberi GC szövetekben. Erőltetett expressziója a miR-217 gátolja GC sejtek proliferációját és invázióját. Sőt, glipikánS-5 (GPC5), egy új ocncogene, azonosították a potenciális célpont a miR-217. Emellett túltermelése miR-217 felület GPC5 indukált előmozdítása proliferáció és invázió GC sejtekben. Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatta, hogy a miR-217 funkcionált tumor szuppresszor és gátolta a proliferációt és invázió GC sejtek megcélzásával GPC5, ami következésképpen szolgálhat, mint terápiás célpont a GC betegeknél.

bevezető hivatkozás: Wang H Dong X, X Gu, Qin R, Jia H, Gao J (2015) A mikro-RNS-217 működik, mint egy potenciális tumor szupresszor gyomorrákban megcélozva GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474 katalógusa

Szerkesztő: június Li, Szun Jat-szen University Medical School, Kína katalógusa

Beérkezett: október 10, 2014; Elfogadva: március 24, 2015; Megjelent: június 22, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: a szerzők nem támogatja vagy finanszírozási jelenteni. katalógusa

Érdekütközés: a szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

a gyomorrák (GC) a negyedik leggyakoribb rosszindulatú emberi és a második vezető oka a rák összefüggő halálesetek világszerte, becslések szerint egymillió új esetet diagnosztizálnak évente [1-4]. Jelentős előrelépések ellenére a diagnosztikai módszer, műtéti technika és az új kemoterápiás sémák, a hosszú távú túlélési arány GC még mindig meglehetősen alacsony [5, 6]. Sok beteg, GC diagnosztizáltak előrehaladott szakaszban kiterjedt invázió és metasztázis nyirok. A sikeres terápiás stratégiák korlátozottak, és a mortalitás magas [7]. Ezért sürgősen vizsgálja az alapvető molekuláris mechanizmusa a gyógyszerekkel szembeni rezisztencia, szövettani heterogenitás, és a fejlesztés metasztázis azonosítani újszerű markerek a diagnózis és a kezelés a GC. Katalógusa

A mikroRNS (miRNS) kicsi, körülbelül 22 -nucleotide, nem kódoló RNS-ek, hogy működnek a negatív szabályozói fehérjét kódoló gének a poszttranszkripciós szinten [8, 9]. Kötődve a komplementer szekvenciák a 3'-nem transzlálódó régiók (3'-UTR) az a cél mRNS-miRNS indukálhat az mRNS lebomlás vagy transzlációs gátlás [10-13]. Egyre több bizonyíték jelzi, hogy a miRNS-ek részt vesznek sok fontos biológiai eljárások, beleértve a sejtproliferációt, differenciálódást, az apoptózist, az angiogenezist és immunválaszt. Deregulációja miRNS vezethet aberráns génexpresszió különböző betegségek, beleértve a gyomor-rák [14-16]. Ugyanakkor a megértése a szerepe és funkciója miRNS a GC még a korai szakaszban. Hasonlóképpen, a szerepek sok más abnormálisan expresszált miRNS GC fejlődés még ismeretlen. Katalógusa

downregulációját miR-217 gyakori esemény a különböző rákos megbetegedések, ami arra utal, hogy fontos szerepe van a tumorok [17-19]. Azonban keveset tudunk a lehetséges szerepét a miR-217 GC. Ebben a vizsgálatban, a kifejezés a miR-217-ben csökkent GC sejtvonalakban és szövetekben. Ezen túlmenően, az alacsonyabb expressziója miR-217was társított esetben pTNM szakaszban. Túlexpressziója miR-217 elnyomott GC sejtek invázióját és proliferációját. Továbbá, a luciferáz riporter assay és Western blot megerősítette, hogy a miR-217might funkciót, mint egy tumorszuppresszor GC által targetingGlypican-5 (GPC5).

Anyagok és módszerek

Etikai Nyilatkozat

az összes beteg beleegyezett, hogy részt a vizsgálatban, és adott írásos beleegyezését adta. Ez a tanulmány és engedélyezési jóváhagyta az etikai testület az intézmény, amely a kapcsolódó yanan Kórház Kunming Orvostudományi Egyetem és betartják a Helsinki Nyilatkozat. Katalógusa

A szövetminták

A mintákat az emberi szövetek és GC párosított -adjacent tumort nem gyomor szövetek, amelyek távolabb, mint 5 cm-re a tumorokat 50 beteg műtéten átesett reszekció a kapcsolt yanan Kórház Kunming Medical University. Friss mintákat Snap fagyasztott inliquid nitrogén után azonnal reszekció és -80 ° C-on. Minden mintát kapunk a betegek beleegyező nyilatkozatot és arra szövettani megerősítette festéssel hematoxilin-eozin. A szövettani fokozatú daganatok értékelték beállított feltételek szerint az Egészségügyi Világszervezet. Egyik beteg kapott sugárterápia vagy kemoterápia a műtét előtt. A betegeinek ismerteti S1 táblázat. Katalógusa

Sejtvonalak és sejtkultúrák katalógusa

Az emberi gyomor rákos sejtvonalak SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 és egy normál gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1 (kontrollként) vásároltunk a Biokémiai Intézet és Sejtbiológiai a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 szaporítottuk RPMI 1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) és GES-1 szaporítottuk Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben (Invitrogen). Az összes tápközeget with10% borjúembrió-szérumot. Sejtvonalakat 37 ° C hőmérsékleten, párásított inkubátorban, 5% CO2.

RNS extrakció és QRT-PCR

Teljes RNS-t extraháltunk a fagyasztott mintákat (vagy a sejtek) Trizol ( Invitrogen) a gyártó útmutatóját. 1 ml RNS-t mérésére használt expressziójának miR-217 kvantitatív RT-PCR (QRT-PCR) a TaqMan miRNS reverz transzkripciós készlet andtheTaqMan miRNS assay-specifikus RT primerek miR-217 szerint az a gyártó utasításai (Applied Biosystems, Foster City, CA). A kifejezés a U6 alkalmaztunk belső kontrollként. Real-time PCR-t 1 ml Az egyes cDNS-egy lépés Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ismétlődések. A kifejezés a miR-217 alapján határozták meg a küszöbértéket ciklus (CT) és a relatív expressziós szintek számoltuk as22 ^{- [(Ct miR-217) - (Ct U6)] normalizálás után, hivatkozással kifejezése U6 kisebb nukleáris RNS [20, 21] (S2 táblázat). katalógusa}

Western blot katalógusa

az összes fehérje kivont fagyasztott mintákat (vagy a sejtek) alkalmazásával Total protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing , Kína), a gyártó utasításai szerint. Mérése fehérjekoncentráció alkalmazásával végeztük egy BCA Protein Assay Kit (KeyGen). Western-blot-analízist végeztünk a korábban leírtak [22]. A primer antitesteket használt Western blot voltak nyúl poliklonális anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), az egér monoklonális anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cell transzfekciós katalógusa

A miR-217 utánozzák, utánozzák kontroll (tülekedés), miR-217 inhibitor, inhibitor kontroll, PEZ-GPC5 és vezérlő vektor vásároltunk RiboBio (Guangzhou, Kína). A HGC-27 sejteket szélesztettünk hat lyukú lemezekre 30% összefolyás egy nappal a transzfekció előtt. Lipofectamine2000 (Invitrogen) használtuk transzfekciós plazmid egyedül vagy együtt RNS oligonukleotidokat.

luciferáz assay

sejtjei 8 × 10 ^{3-t szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken. Miután 24 hincubation, a keverék 100 ng pLUC-3'-UTR, az 5-pmol negatív kontroll, miR-217mimic kotranszfektáltuk 20 ng Renilla sejtekbe Lipofectamine 2000 Huszonnégy hoursafter transzfekció, szentjánosbogár és Renilla luciferáz tevékenysége mért kettős luciferáz riporter rendszert (Promega, Madison, WI, USA). A transzfekciós hatékonyságot normalizáltuk együttes transzfekció egy Renilla riporter vektort.}

A sejtproliferációt

A sejteket (3000 /lyuk) összegyűjtöttük, és szélesztettünk 96 wellplates és inkubáljuk 37 ° C-on a transzfekció után. Inkubálás után 1-5 napon belül, hogy a média minden lyukhoz 10% sejtszámláló Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japán), és a lemezeket tovább inkubáltuk további 3 órán át 37 ° C-on. Ezután a tápközeget helyettesítettük 150 ml dimetil-szulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich), és az abszorbanciát mérjük 450 nm-en egy mikrotiterlemez-leolvasó (Sunrise). A vizsgálatot megismételtük 3-szor hat ismétlésben.

Northern blot

Teljes RNS-t izoláltunk mind a szöveti TRIzol reagens (Invitrogen Life Technologies), és Northern-blottal hajtottuk végre, mint a korábbi leírt [23] . Miután Tökéletes Hyb Plus hibridizáció 68 ° C-on, membránokat kifejlesztett és elemezték. Northern-blot hibridizált egy 18S riboszóma RNS (rRNS) cDNS-t alkalmaztunk kontrollként.

sejtek invázióját

Invasion vizsgálatokat végeztünk három párhuzamosban használatával Transwell invázió kamrák bevonva Matrigel (BD, USA) leírása a gyártó utasításai szerint. A sejteket transzfektáltuk withmiR-217 utánozza, inhibitora vagy negatív kontroll oligonukleotid, tenyésztettük 48 órán át, és át a tetején Matrigel bevont invázió kamrák egy szérummentes DMEM-ben (1 × 10 ^{5 sejt per Transwell). DMEM, amely 10% magzati borjú-szérumot adtunk az alsó kamrákat. Az inkubálás után 24 órán, sejtek maradt a tetején a szűrőt súrolt le, és a sejteket, hogy vándorolt ​​az alsó felület fixáltuk in90% -os alkohol és az ezt követő kristályibolya foltot.}

Szövettan

a szövettani diagnózis szerint a hármas-site gyomor biopszia módszer. A szöveteket fixáltuk egy éjszakán át pufferolt formaiinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, vágott 3-um vastagságú, és megfestettük hematoxilin-eozin (H &E) festéssel.

Statisztikai analízis

Statisztikai elemzéseket végeztünk SPSS 17.0 statisztikai programcsomag. A kísérleteket megismételtük függetlenül legalább három alkalommal, és bemutatott adatok átlag ± SD-t. Az egyesület között miR-217 és GPC5 elemeztük Spearman-féle korrelációs tesztet. Az összehasonlítást a csoportok között a statisztikai szignifikancia végeztünk a Student-féle párosított két farkú t-teszttel vagy egy-utas ANOVA. P < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmény katalógusa

A kifejezés a miR-217 downregulált GC sejtvonalak

Elsőként mennyiségileg expressziós szintjének miR-217 négy humán GC sejtvonalak (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) és a GES-1 segítségével northern blot (1A ábra). Az expressziós szintje a miR-217 wasdecreased GC sejtvonalak összehasonlítva GES-1. QuantitativeRT-PCR is kimutatta, hogy a kifejezés a miR-217-ben csökkent GC sejtvonalak (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) képest GES-1, a normál gyomornyálkahártya sejtvonalat (1B ábra ).

miR-217 downregulált GC szövetek katalógusa

a kvantitatív RT-PCR-t használnak, hogy vizsgálja miR-217 expresszió 50 GC szövetek és páros szomszédos rákos szövetekben. A képviselő hisztológiai jellemzőit GC és párosított szomszédos jóindulatú szöveteket ábrán látható a 2A. Közül 50 daganat szövetekből, 44 esetben mutatott csökkent miR-217 expressziós összehasonlítva a szomszédos normális szövetekben (88%, 44, 50, ábra a 2B). A kifejezés a miR-217-ben alacsonyabb volt GC szövetekben, mint a szomszédos rákos szövetekben (2C ábra). Sőt, alacsonyabb szintű miR-217 expressziós társított esetben pTNM szakaszában GC beteg (ábra 2D).

miR-217 gátolja a GC sejtproliferáció és invázió

expresszióját miR-217was fokozott transzfektált HGC-27 sejtekbe miR-217 utánzók (3A ábra) és a csökkentés miR-217 inhibitor (3B ábra). A proliferáció csökkent a HGC-27-transzfektált sejtek withmiR-217 utánozza összehasonlítva transzfektált sejtek Scramble vagy kezeletlen (ábra 3C). Eközben a proliferáció fokozott volt HGC-27-transzfektált sejtek withmiR-217inhibitor összehasonlítva transzfektált sejtek kontroll vagy kezeletlen (ábra 3D). Az invazív transzfektált sejtek miR-217 utánozza csökkent összehasonlítva a Scramble csoport vagy kontroll csoport sejtek és miR-217 inhibitor sejtek fokozott invázió összehasonlítva a Scramble csoport vagy kontroll csoport sejtek (ábra 3E).

miR -217 poszttranszkripciós csökkenti GPC5 expresszió által közvetlenül megcélzó a 3'UTR

Elemzés a rendelkezésre álló algoritmusok azt jelezte, hogy GPC5 egy elméleti célgént miR-217 (ábra 4A) [24]. Annak bizonyítására, hogy a miR-217 célozza közvetlenül GPC53'UTR végeztünk luciferáz vizsgálatokban. Méhen kívüli miR-217 csökkentett Luciferázaktivitás a GPC5 vad típusú riporter gént, de nem a mutáns GPC5 3'UTR, jelezve, hogy a miR-217 célozza közvetlenül GPC5 3'UTR (4.b ábra). Az mRNS szintje GPC5 csökkent transzfekció után miR-217 utánozza után nagyobb transzfekciót miR-217 inhibitor alkalmazásával qRT-PCR (4c). Összhangban ezzel az eredménnyel, a képesség, a miR-217 expresszióját szabályozzák a GPC5 fehérje igazoltuk western blot (ábra 4D). Katalógusa

helyreállítása miR-217 gátolja GPC5 közvetített GC sejtburjánzás és invázió

túltermelése GPC5 elősegítette a GC-sejt proliferáció és invázió. Amikor miR-217 utánozzák és PEZ-GPC5 kotranszfektáltunk be HGC-27 sejtek, miR-217 expressziója csökkentette a GPC5 indukált GC sejtburjánzás és inváziós (5A és 5C). Gátlása GPC5 csökkentette a GC-sejt proliferáció és invázió. Amikor miR-217 inhibitor és shGPC5 kotranszfektáltunk be HGC-27 sejtek, miR-217 inhibitor elősegítette a shGPC5 gátolt sejtek szaporodását és inváziót (5B és 5D). Katalógusa

GPC5 felülszabáiyoződik GC sejtvonalak és példányok

A kifejezés a GPC5 magasabb volt GC sejtvonalak (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) képest GES-1, a normál gyomornyálkahártya sejtvonal (6A). A fehérje szintje GPC5 is magasabb GC szövetekben, mint a szomszédos rákos szövetekben western blot (6B). Katalógusa

Vita katalógusa

GC okoz közel egy millió ember halálát világszerte évente [25] . Nemrégiben felhalmozódó bizonyítékok alapján feltételezhető, hogy a miRNS-ek döntő szerepet játszanak patogenezisében GC keresztül sejtproliferáció, az apoptózis, a migráció, a hirdetések invázió [26-28]. Ebben a vizsgálatban, a miR-217-ben gyakran downregulált humán GC sejtvonalakban és szövetekben, és az alsó szinten a miR-217 társult esetben pTNM szakaszában GC. További vizsgálatok azt mutatták, hogy overexpressziója miR-217 elnyomja GC-migráció és invázió. GPC5 azonosították közvetlen és funkcionális célt a miR-217. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-217 úgy tűnik, hogy egy újszerű tumorszuppresszor GC és hogy downregulált miR-217 hozzájárulhat a tumor kialakulásában és fejlődésében GC betegeknél. Downregulációját miR-217 gyakori esemény a különböző rákos megbetegedések, ami arra utal, hogy fontos szerepe van a tumorok [17-19]. Li és munkatársai kimutatták, hogy a miR-217-t lefelé szabályozni a világos sejtes vesesejtes karcinóma (ccRCC) képest párosított normális szövet [29]. Alsó miR-217 expressziós szintet társult magasabb tumor grade és a színpadon. Ebben a vizsgálatban, a miR-217-ben gyakran downregulált GC. Érdekes módon a betegek kisebb kifejezése miR-217 inkább fejlettebb TNM, ami arra utal, hogy az alacsony kifejeződése ofmiR-217was kapcsolódó GC progresszióját. További vizsgálatok kimutatták, hogy túltermelése miR-217 elnyomott GC sejtek invázióját és proliferációját. Együtt korábbi eredmények, ezek az adatok arra utalnak, hogy a miR-217might játszanak döntő szerepet GC szöveti homeosztázis és deregulatedmiR-217 talán hozzájárulnak a gyomor daganat. Katalógusa

Annak vizsgálatára, molekuláris mechanizmusa a tumor szupresszor szerepet a miR-217 GC, szoktuk luciferáz riporter vizsgálat és western blot kell erősítenie GPC5 volt a cél, miR-217 GC sejtekben. Hogy megerősítsék a közvetlen szabályozása GPC5 által miR-217, szoktuk GPC 3 'UTR riporter vektort hordozó potenciális miR-217 kötőhely fluoreszcens riporter. Továbbá qRT-PCR és Western blot vizsgálattal kimutatták, hogy túltermelése miR-217 gátolja GPC kifejezést. Glypicans egy család proteoglikánok, amelyek kapcsolódnak a exocytoplasmic felületén a plazmamembrán keresztül glikozil-foszfatidil-horgony [30, 31]. Hat glypicans azonosítottak emlősökben (GPC1 a GPC6) [32, 33]. GPC5 főleg expresszálódnak a fejlődő központi idegrendszerben, a végtagok, a vese, a tüdő és a máj [34, 35]. A legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy néhány GPCs, különösen a GPC3 andGPC5, esetleg fontos szerepet játszanak szabályozásában rák progressziójának [35, 36]. Például a Zhang
et al. azt mutatta, hogy GPC5 ben erősen expresszálódik SACC-M (magas tüdő-metasztatikus sejtvonal) és klinikai mintákban a nyál adenoid cisztás karcinóma (SACC) esetben tüdő metasztázis [36]. A teljes expressziós szintjének GPC5 klinikai eseteiben SACC tüdő metasztázis magasabb volt. Williamson et al. azt mutatta, hogy a kódoló gén GPC5was amplifikált 20% -ánál alveoláris rhabdomyosarcoma (RMS), és hogy ez a glipikánS volt túlexpresszálódik RMS betegeknél. Sőt, down-regulációja GPC5 expresszió siRNS gátolta a szaporodási sebességét RMS sejteket. Egy másik tanulmány azt találta, hogy a magas GPC5 kifejezés megjósolt rossz műtét utáni túlélési idők gyógyító tiszteletben NSCLC betegek, ami arra utal, értéke GPC5 molekuláris prognosztikai tényező [35, 37]. Tanulmányunkban a kifejezés GPC5 magasabb volt GC sejtvonalak és a fehérje szint GPC5 is magasabb GC szövetekben, mint a szomszédos rákos szövetekben. Gátlása GPC5 csökkentette a GC-sejt proliferáció és invázió. Restaurálása miR-217 gátolja GPC5 közvetített GC sejt proliferáció és invázió. Ezek az eredmények azt igazolták, hogy a miR-217might jár, mint egy tumorszuppresszor gyomorkarcinómában megcélzásával GPC5.

Összefoglalva, a jelen tanulmány kimutatta, hogy a miR-217was downregulált GC szövetekben és sejtvonalakban. Az alacsony szintű miR-217 expresszió kapcsolódó pTNM szakaszában a betegek. Méhen kívüli miR-217 expresszió eredményezte gátlása GC sejtburjánzás és invázióját. A további vizsgálat során kiderült, hogy GPC5 volt potenciális célpontja a miR-217. miR-217 szolgálhat előrejelzője prognózis és terápiás célpontként GC betegek. katalógusa

alátámasztó információk
S1 táblázat. Összefoglaló klinikopatológiai paraméterek gyomorrákos betegeknél. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0125474.s001 katalógusa (DOCX) hotelben S2 táblázat. Primer szekvencia. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0125474.s002 katalógusa (DOCX) hotelben

• PLoS One: a mikro-RNS-137 Hozzájárul, hogy a nedves tumorképzésért Emberi gyomorkarcinóma által célzás Akt2
• PLoS One: Survival Analysis betegek Interval Rák átesett gyomorkarcinóma Szyurés endoszkópos