Ploche ONE: kompenzačné úlohu NF-kB p53 v reakcii na 5-FU chemoterapiou založenou na Žalúdočné Cancer Cell Lines

abstraktné

Aj napriek pozoruhodné zlepšenie pooperačných 5-FU na báze adjuvantnej chemoterapie, miera recidívy u pacientov s karcinómom žalúdka, ktorí podstupujú kuratívne resekcii nasledované adjuvantnej chemoterapie zostáva značný. Z tohto dôvodu je dôležité identifikovať predikčnú markery pre chemoterapeutickej účinnosti 5-FU. Nedávno sme identifikovali NF-kB ako kandidát recidíve predikcie biomarkerov rakoviny žalúdka. Zhodnotiť biologický význam NF-kB v súvislosti s chemoterapiou 5-FU na báze, sme analyzovali NF-kB-dependentný biologickú odpoveď po reakcii 5-FU v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Bolo identifikovaných sedem génov vyvolané pôsobením 5-FU v NF-kB-závislým spôsobom, z ktorých päť sú známe p53 ciele. Vyradenie Relay
ktorá kóduje P65 podjednotku NF-kB, znížil obe úrovne cieľového proteínu p53 a p53. Naproti tomu, NF-kB nebola ovplyvnená TP53
vyraďujúce. Tiež sme preukázali, že bunkové línie nesúce Pro /Pre homozygosity v codon72 p53 exon4, čo je dôležité pre NF-kB väzbu na p53, sú odolnejšie voči 5-FU, než tie, ktoré sa Arg /Arg homozygosity. Sme došli k záveru, že NF-kB hrá dôležitú úlohu v odpovedi na liečbu 5-FU v žalúdočnej rakovinové bunkové línie, s možným kompenzačné funkcie p53. Tieto výsledky naznačujú, že NF-kB je potenciálnym 5-FU-chemosensitivity predikcie marker, ktorý môže odrážať 5-FU-indukovanej dráhy stresovej reakcie, vrátane p53

Citácia :. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) kompenzačné úlohu NF-kB p53 v reakcii na 5-FU chemoterapiou založenou na žalúdočné nádorových bunkových línií. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10,1371 /journal.pone.0090155

Editor: Thomas G. Hofmann, Cancer Research Center Nemec, Nemecko |

prijatá: 17.října 2013; Prijaté: 28. január 2014; Publikované: 27. februára 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená Miasto (Medical Innovation Advanced Science and Technology) projekt Grant-in-Aid pre strategický Medical Science Research Center od Ministerstva školstva, kultúry, vedy a technológie v Japonsku, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); a Grant-in-Aid pre vedecký výskum (c) (11863286) (S.S.N.) a (12877914) (K.Ko.). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

väčšina rakoviny žalúdka vo svete je diagnostikovaných vo východnej Ázii [1], kde štandardné terapia pre pokročilých rakoviny žalúdka zostáva chirurgie a chemoterapie. V poslednej dobe vyvinuté adjuvantnej chemoterapeutickej režimy po kuratívny gastrektómii k pokročilým karcinómom žalúdka urobili pozoruhodný pokrok, pokiaľ ide o ovládajúci relapsu a prežitie bez choroby, a to najmä v japonskej populácie [2], [3]. Avšak, 30 až 40% pacientov stále dochádza k relapsu napriek liečbe chemoterapiou po kuratívny gastrektómii [3], čo naznačuje, že výber pacientov na základe molekulárnej informácie by mohli byť veľmi efektívny pre zvýšenie chemoterapia sprostredkované non-relapsov a miery prežitia.

Ak chcete vybrať pre pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí by mohli mať prospech z chemoterapie, je dôležité pochopiť, individuálnej citlivosti pred chemoterapiou [4]. Pooperačné adjuvantnej chemoterapie rakoviny žalúdka poskytuje možnosť testovať pacienta odvodené nádory skôr, ako oni podstupujú chemoterapiu. V snahe identifikovať potenciálne biomarkerov v tomto prostredí na úrovni proteínu, sme predtým vykázala bunková línia panel skríningového systému pomocou kvantitatívne vyjadrenie proteínu profilovanie reverznej fáze proteínové čipy (RPPAs) [5], [6] v kombinácii s buňka- založený rast testovací systém založený na koncepte NCI-60 bunkové línie skríningového panela [7], [8]. Kandidátske biomarkery boli izolované na základe korelačných koeficientov z proteínovej expresie a citlivosti voči liečivám matrice a potom sa ďalej overiť pomocou chirurgicky odstránené vzorky [9]. Na základe tohto prístupu sme identifikovali dva biomarkery na úrovni proteínu, vrátane NF-kB a JNK, ktorého hladiny mal dobrú koreláciu chemoterapii na reakciu. Vyššia expresia NF-kB Zdalo sa, že koreluje s horšou prognózou, zatiaľ čo JNK ukázala inverzný korelácia. Tieto značky boli tiež overené na molekulárnej úrovni pomocou žalúdočných a črevných nádorových bunkových línií. Bolo preukázané, že siRNA sprostredkovanú vyraďujúce P65 takmer výhradne ovplyvňuje citlivosť 5-FU medzi aktuálne používaných chemoterapeutických liekov; ale to nie je tento prípad JNK Knockdown [9]. Preto sme dospeli k záveru, že NF-kB hrá dominantnú úlohu v liečbe 5-FU a JNK môže byť indikátorom chronického zápalu žalúdočnej sliznice pozadí [10]. Ako rozšírenie tohto overovaciu štúdiu sme sa snažili preskúmať tieto proteíny funkčne a objasniť úlohu NF-kB ako transkripčný faktor stresu vyvolaného počas liečby 5-FU. Tiež sme hodnotili úlohu proteínu p53 po 5-FU-sprostredkovanú transaktivaci NF-kB [10], [11], pretože je dobre známe, že p53 je aktivovaná v reakcii na túto genotoxického činidla [12]. V tejto štúdii sme hlási potenciálne kompenzačné úlohu NF-kB pre p53 prostredníctvom analýzy p53-NF-kB väzby polymorfné miesto, kodóne 72 p53. Spoločne tieto zistenia naznačujú, že NF-kB /p53-codon72 by mohol byť robustné biomarker citlivosti 5-FU.

materiáloch a metódach

bunkové línie

Nine ľudského žalúdka rakovinové bunkové línie, vrátane Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY a MKN45 boli získané z bunkovej banky Riken BioResource Center. IWT-1 bol de novo
bunková línia, ktorá so sídlom v našom laboratóriu z japonskej mužského žalúdka pacienta s rakovinou, ktorí relapsom zápal pobrušnice carcinomatosa. Použitie IWT-1 bunkovej línie bol schválený Iwate Medical University Institutional Review Board (H25-116, a HG H25-15) a rodiny pacienta darcu, ktorý zomrel v čase vzniku bunkovej línie s písomný informovaný súhlas s ohľadom na odberom vzoriek a vykonaním bunkové línie. Bunky boli pestované do 70-80% zhlukovania v médiu RPMI-1640 doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) pri 37 ° C v prítomnosti 5% CO _2.

Príprava bunkového lyzátu

Bunky boli zozbierané centrifugáciou a bunkové pelety boli lyžovanie za použitia pufru obsahujúceho Pink 9 M močoviny (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -propanesul-fona (CHAPS, Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Nemecko), 2% pH 8,0 až 10,5 Pharma-Lyte (GE Healthcare Japonsko, Tokyo, Japonsko) a 65 mM DTT (GE Healthcare Japonsko, Tokyo, Japonsko) ako bolo skôr popísané [5], [13].

Western Blot

SDS-PAGE bola vykonaná za použitia NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel elektroforéza (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), boli použité Xcell Sure Lock Mini-buniek (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a napájanie PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Rozštiepené proteíny na gélu boli prenesené na nitrocelulózové membránu s použitím suchých iBlot blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Výsledné membrány boli blokované 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) v TBS (TBST) po dobu 1 hodiny. Membrány potom boli inkubované s uvedenými primárnymi protilátkami, vrátane pan-aktínu, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA); p21, Tigar, a PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); a NF-kB, α-tubulín a PCNA (Cell Signaling Technology Japonsko, Tokyo, Japonsko). Ďalej boli membrány premyté dvakrát po dobu 5 minút s TBST, inkubovaná s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou po dobu 1 hodiny, a potom sa premyjú dvakrát po dobu 5 minút v TBST. činidlá pre detekciu Chemoluminiscenčný boli inkubované s membránami pre 1-5 minút a potom obrazy boli získané pomocou Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japonsko, Tokyo, Japonsko). Na vyhodnotenie indukcie proteínu o 5-FU, western bloty boli kvantifikované za použitia ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

imunocytochemie

Bunky boli pestované do 70-80 % zhlukovania v RPMI-1640 doplnenom 10% FBS v 4-komorových tkanivových polystyrén nádoba kultúry ošetrené sklenené doštičky a potom sa spracuje s 5-FU, ako je uvedené v každom pokuse. Potom, čo boli bunky vystavené 50 uM 5-FU po dobu 4 hodín vidieť skoré transkripčný reakcie, ktoré boli fixované v 4% paraformaldehydu, permeabilizovány za použitia 0,2% Triton X-100 v PBS, a farbené DAPI (0,6 uM DAPI, 50 ul RNázy a 5 ml PBS) pri teplote miestnosti po dobu 12 min. Bunky potom boli inkubované s týmito primárnymi protilátkami: anti-NF-kB P65, fosfo-NF-kB P65 (Ser536) a fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japonsko, Tokyo, Japonsko) a p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, USA). Nakoniec boli bunky inkubovali buď s Alexa Fluor488- alebo 568-konjugovanou sekundárnou protilátkou (Life Technologies Japonsko, Tokyo, Japonsko). BX43 fluorescenčným mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japonsko) bol použitý pre snímanie obrazu.

profilovanie génovej expresie

MKN45 bunky boli zozbierané po liečbe s alebo bez 50 uM 5-FU po dobu 4 hodín , RNA sa extrahuje z Zozbierané bunky a génovej expresie profilovanie bola vykonaná v súlade s pokynmi výrobcu (Sure Vytlačiť G3 Human GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japonsko, Tokyo, Japonsko). Hrubých dát sa najprv normalizovať delením každého signálu sondy o 75 ^{percentilom celého signálu. Každý microarray experiment bol vykonaný v dvoch vyhotoveniach čo má za následok dve kontroly a dvoch microarray dátových sád 5-FU ošetrenie. Identifikovať gény, ktoré boli odlišne exprimované v reakcii na 5-FU, každá sada riadiace dáta bola porovnaná oddelene pre každú liečbu 5-FU set (4) porovnanie. Odlišne exprimovaných génov boli tie, ktoré mali zmeny v expresii zlúčenina, 2-násobne v každom porovnaní. Identifikovali sme konečnú sadu 10 rozdielne exprimovaných génov na základe ich početnosti v porovnaní 4 [14]. Pre potvrdenie reprodukovateľnosti týchto expresných zmien, kvantitatívne real-time RT-PCR z 5-FU ošetrené vzorky 0, 4, 8, 12 a 24 h bola vykonaná pre každý gén. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke S1. Génov vyvolané 5-FU, analýza väzby promotorových miest sa vykonáva za použitia algoritmu Jaspar (Jaspar, http://jaspar.genereg.net/). Promótor sekvencie 1000 bp špecifických pre príslušných génov bola získaná z transkripčný regulačný element Database (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Väzbové miesta bolo predpovedané skenovanie promotorové sekvencie s konsenzom sekvencie NF-kB a p53 s 70% prahu profil skóre.}

Relate a génu TP53 Knockdown

Bunky boli pestované na 70-80 % zhlukovania v RPMI-1640 doplnenom 10% FBS v 6-jamkové dosky pre kultiváciu buniek, a potom sa spracuje s NF-kB P65 alebo p53 siRNA (cell Signaling Technology Japonsko, Tokyo, Japonsko) po dobu 48 hodín. Stručne, knockdown bola vykonaná za použitia Trans-IT TKO (MIRUS Bio Corporation, Madison, WI, USA) v koncentrácii 3%, po dobu 10 minút pri teplote miestnosti. Príslušné koncentrácie siRNA pre každú bunkovú líniu, sa zmieša s Trans-IT TKO riešenia, a následne 20 min inkubácie pri teplote miestnosti. Koncentrácia siRNA boli nasledujúce: 100 nM P65 siRNA pre MKN45 a MKN74 buniek, a 150 nM pre bunky GSS a Kato-III; a 100 nM p53 siRNA na MKN45, a GSS bunky, a 50 nM pre bunky MKN74. Po 48 hodinách boli bunky zozbierané a množstvo bielkoviny boli skúmané pomocou Western Blot. Dve siRNA konštrukty, ktoré majú odlišné sekvencie, k rovnakému cieľového génu bola použitá pre každý gén pre potvrdenie špecificity knockdown. Distribúcia bunkového cyklu bola hodnotená pomocou Tali Image založené na cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Pre zobrazenie maximálneho účinku siRNA na reakciu 5-FU, liek bol pridaný 48 hodín po siRNA bol transfekován, a príslušná bunkového cyklu bola meraná po 24 hodinách inkubácie s 5-FU. Všetky experimenty boli opakovali najmenej trikrát.

TP53 Status a Codon72 Variant

DNA bola extrahovaná z žalúdočné nádorových bunkových línií za použitia QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japonsko, Tokyo, Japonsko). PCR amplifikácia pre bola vykonaná p53
exon4 codon72 variant (tabuľka S1) a p53
exon5-9 mutácie, ako bolo opísané skôr [15], [16]. Každý PCR produkt bol sekvenovanie za použitia genetického analyzátora ABI PRISM 3030xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) podľa protokolu výrobcu. Výsledky sekvenovania boli analyzované pomocou FinchTV (Perkin Elmer Japonsko, Tokyo, Japonsko) a MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Analýza rastu Potlačenie

Desať tisíc buniek na jamku boli nasadené na 96-jamkový mikrodoštičky. Dvadsaťštyri hodín neskôr boli bunky ošetrené s 5-FU po dobu 24 hodín. Po liečbe 5-FU, podiel živých buniek bola meraná pomocou Cell počítanie Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japonsko) a TriStar LB 941 mikrodesek (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemecko). Päťdesiat percent koncentrácie inhibícia rastu (GI _{50) sa vypočítala použitím softvéru Prism (Graf Pad Software, La Jolla, CA, USA). GI 50 Hodnoty boli použité pre stanovenie korelácia medzi úrovňami 5-FU účinnosti a bielkovín na báze product-moment korelačného koeficientu Pearsonovho ( r
).}

Výsledky

Fluorouracil indukuje NF-kB

na potvrdenie, typické správanie NF-kB ako odpoveď na liečenie 5-FU, sme vysledovať subcelulárnu lokalizáciu NF-kB v MKN45 (p53 divokého typu), MKN74 (p53 mutant ), GSS (p53 mutant), a Kato-III (p53 homozygotne odstránený) bunkové línie. Analýza Western blot s jadrovými a cytoplazmatickej frakcie ukázali, že 5-FU indukovanú NF-kB v oboch oddieloch v MKN45, ale nebol pozorovaný u p53 mutantných bunkových líniách (obr. 1 A-D). Tiež sme skúmali účinok 5-FU na NF-kB lokalizácia v bunkách imunocytochemickému (obr. 1 E-H). NF-kB lokalizované v cytoplazme v neošetrené MKN45, zatiaľ čo 5-FU ošetrení spôsobila zvýšenie NF-kB nukleárnej lokalizáciu (obr 1E.); Avšak, nebol pozorovaný žiadny nárast v bunkových línií p53 mutantov (obr. 1F-H). Tiež sme pozorovali drastický nárast fosforylovaného NF-kB (P65 Ser536) v jadre MKN45 liečených 5-FU, čo ukazuje, NF-kB bola transactivated o 5-FU (obr. 1E). Konštitutívny jadrový lokalizačný a príležitostné fosforylácie p53 bola pozorovaná u MKN74, ale nezdalo sa, že je indukovaná 5-FU (viď obr. 1G). Jadrová lokalizácia p53 bola vyvolaná 5-FU v GSS, ale aktivuje signál bol slabý (obr. 1H).

p53 Ciele sú vyvolané na 5-FU Treatment

Pretože NF-kB je transkripčný faktor (TF) a jeho jadrový lokalizačný pri liečení 5-FU silne naznačuje, transaktivaci. Identifikovali sme hornej 7 prepisy medzi viac ako 60.000, ktoré boli vyvolané po 4 hodinách liečenia 5-FU v MKN45 pomocou analýzy génovej expresie (tabuľka 1). Je zaujímavé, že päť zo 7 transkriptov, a to BBC3
(ktorý kóduje p53 up-regulované modulátor apoptózy, PUMA), BTG2, C12orf5
(ktorý kóduje pravdepodobný fruktózy-2,6-bisfosfatázy Tigar), CDKN1A a GPR87
, o ktorých je známe p53 ciele [18] - [22]. Prítomnosť väzobných miest promótorom boli predpovedal skenovanie promotorové sekvencie s konsenzuálnym sekvenciami NF-kB a p53 za použitia Jaspar algoritmus (tabuľka 1) [23].

Zistili sme, že hladiny p53 boli indukované v jadre podobnej k tým NF-kB ako odpoveď na 5-FU liečby (obr. 1E). Liečenie 5-FU tiež zvýšenej hladiny p53 fosforylácie na Ser15, čo naznačuje jeho transaktivační (obr. 1E, ref. [24]). V skutočnosti, je väčšina celkového p53 vyvolaného 5-FU sa zdalo, že je fosforylovaný. Tiež sme pozorovali indukciu časovo závislé génov, vrátane C12orf5 (Tigar)
BBC3 (PUMA)
CDKN1A (21) stroje a BTG2
o 5-FU s použitím RT-PCR (obr. 1i). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že bunková odpoveď na liečbu 5-FU môže zahŕňať ako NF-kB a p53 na transkripčný aktiváciu v tomto kontexte, v MKN45.

Relay Vyradenie má väčší vplyv na p53 cieľových proteínov než TP53 Gene Vyradenie

k vyhodnoteniu regulačný účinok NF-kB a p53 ako reakcie na liečenie 5-FU, sme analyzovali hladiny proteínovej P65, p53, rovnako ako známe p53 ciele, p21, Tigar, a PUMA, westernovým prenosom nasledujúcom Relate stroje a TP53
porazený v MKN45, MKN74, GSS, a Kato-III. rela
knockdown spôsobil významný pokles hladín p53 u všetkých bunkových línií. Ako sa dalo očakávať, že hladiny p21, Tigar a PUMA boli tiež znížené (obr. 2A). Naopak, zatiaľ čo TP53
porazený klesol p53 úrovne, to neovplyvnilo P65 úrovne. Ako sa dalo očakávať, že hladiny p53 cieľových proteínov boli znížené o TP53
vyraďujúce; Avšak, tento pokles bol nižší ako zníženie spôsobené Relay
knockdown (obr. 2B). V analýze bunkového cyklu, na MKN74, GS a Kato III bunkové línie vykazovali mierne zvýšenie S alebo G2 fáze frakcie vzhľadom k tomu, MKN45 vykazovali nárast frakcie G1 po 24 hodinách expozície 5-FU v P65 a p53 knockdown podobné zodpovedajúcim perie (obr. 2c). Tieto výsledky môžu naznačovať robustnosť strojov odozvy bunkový stres, ktorý udržuje distribúciu bunkového cyklu napriek Vyradenie P65 a p53.

TP53 Codon72 Pre Variant vykazuje nízku 5-FU Citlivosť a vysokým hladinám NF-kB

Gene porazený experimentálne výsledky ukázali, že interakcia medzi NF-kB a p53 proteíny by mohla byť dôležitá v kontexte liečenia 5-FU. Aby preskúmala možnosť, že TP53
codon72 variant môže mať vplyv na bunkovú odpoveď na liečbu 5-FU, máme sekvencovania TP53
codon72 rovnako ako mutácie v DNA väzbovú doménou kódujúce regióny (tj exóny 5-8) 9 žalúdočných nádorových bunkových línií (tabuľka 2). Postavenie codon72 variácie a TP53
mutácie nepreukázali jasné asociácie.

Ďalej sme skúmali vzťah medzi citlivosťou 5-FU a TP53
stave (obr. 3A ), rovnako ako endogénne hladiny NF-kB a p53 (obr. 3B). GSS, GCIY a MKN45 línie, ktoré vykazujú homozygotná Pre variant, vykazoval nízku citlivosť na 5-FU, vzhľadom k tomu, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 a IWT1 línií majúcich Arg alely vykazuje relatívne vysokou citlivosťou. Kato-III, ktorý má veľký TP53
vypustenia [25], bol najviac citlivý na 5-FU. hladina NF-kB proteín bol obzvlášť v korelácii s 5-FU citlivosti ( r
= 0,68; p
= 0,04, obr. 3C); Avšak, neexistuje žiadna jasná korelácia medzi úrovňou citlivosti p53 a 5-FU ( r
= -0,04; p
= 0,95; 3D obr.). Tieto výsledky naznačujú, že Pre homozygotnosti je spojená s odolnosťou proti 5-FU, zatiaľ čo ani p53 mutácií ani endogénnej hladiny p53, má priamy vplyv na citlivosť 5-FU.

Diskusia

sme už skôr identifikované NF-kB ako potenciálny prediktívne marker pre pooperačnú 5-FU na báze chemosenzitivity pokročilého karcinómu žalúdka [9]. NF-kB je indukovatelný transkripčný faktor zložený z P65 (relay), c-Rel, Rel-B, P50 /NF-κB1, a p52 /NF-κB2 [26], a hrá hlavnú úlohu v imunitnej odpovede a zápalového cytokínu regulácia [27] - [29]. Chang et al skôr ukázané, že NF-kB indukovanú nahor alebo nadol reguláciu odlišne exprimovaných génov v 5-FU-indukovanej črevného zápalu sliznice indukciou prozápalových cytokínov, ako je IL-6, TNF-a, IL-1 a [10]. Tieto 5-FU-indukovanej zápalovej odpovede boli považované za súčasť stresom zamedzenie procesov, ktoré môžu viesť k desenzibilizácii 5-FU účinnosti v žalúdočnej sliznici [30]. Aj keď bolo navrhnuté, že aktivácia NF-kB, nie je priamo spojený s rozvojom nádoru a progresiu [31], NF-kB bola považovaná za významnú biomarker a terapeutický cieľ [32]. Priamy dôkaz o zníženej chemorezistence na 5-FU o siRNA pre Relay
spolu s vysokou diskriminačné sily NF-kB nukleárnej farbenie v terapeutických výsledkov chirurgicky odstránených tkanív nás viedla na vykonanie ďalšej validáciu NF-kB z biologický hľadisko.

Naša transkripčný profilovanie výsledky ukázali, že niektoré gény p53, následní sa up-regulované v reakcii na 5-FU, v ktorom transaktivace NF-kB tiež došlo. už skôr bolo preukázané, tieto dva hlavné transkripčné faktory, ktoré majú byť spoločne regulované v reakcii na genotoxickým činidla [33] - [35], a TNF-α [36], [37]. Okrem toho, bolo navrhnuté, že súčasné aktivácia p53 a NF-kB v nádoroch ošetrených genotoxickým činidiel môže viesť k zlyhaniu liečby v dôsledku NF-kB sprostredkovanej signalizácie prežitia [38].

Individuálne vyraďujúce tieto transkripčné faktory odhalené gény po prúde p53 boli ovplyvnené P65 knockdown, zatiaľ čo efekt bol limitovaný p53 príklepu. Predchádzajúce správy navrhli vzťahu spolupráce medzi p53 a NF-kB v rámci autofagie, apoptózy, a S-fázy, kontrolný bod aktivácia [34], [39] - [41]. Naše výsledky tiež ukázali, že NF-kB sa môže kompenzovať transkripčný aktivitu proteínu p53, pokiaľ je neporušený funkcie stratené v reakcii na liečbu 5-FU. V skutočnosti sa väčšina karcinómov žalúdka nesú mutácie v DNA väzbovej doméne p53, čím by sa transkripčný inaktívny [42]. Nedávna štúdia Frank et al
. hlásené, že codon72 polymorfizmus TP53
podstatne ovplyvňuje schopnosť p53 spolupracovať s NF-kB pre génovú transaktivaci, a to najmä v indukcii apoptózy pomocou kaspasy 4/11 [40]. Súčasne s týmto zistením, že niektoré transkripčný aktivita p53 vyžadujú NF-kB ako odpoveď na 5-FU, p53 Kodona 72 polymorfizmu pre jeho viazania môže byť väčší vplyv než mutačního statusu TP53
alebo proteínové expresie NF-kB stav p53

dopad codon72 polymorfizmus na spontánny riziko rakoviny bol už skôr vyšetrovaný, ale nie presvedčivo preukázaná vzhľadom k obmedzenej ľudskej populácie a na zvieracích modeloch [40], [43] -. [45]. Avšak, codon72 polymorfizmus môže hrať úlohu pri udržiavaní stanovenej nádorové bunky, ako spúšťací bunkovú malígny transformáciu. V skutočnosti, predchádzajúce štúdie uvádzajú, že Pro /Pre alela je spojená s rezistenciou na chemoterapiu a zlou prognózou v ústnej dutine [46], ako aj hrubého čreva [47], prsníka [48] a žalúdka [49] rakoviny a neuroblastómu [ ,,,0],43]. Rad in vitro
štúdie tiež podporujú túto hypotézu o tom, že Arg alela je silnejšia apoptóza induktor než Pre alely [40], [50], [51]. Apoptóza je jeden z hlavných mechanizmov, vyvolaných 5-FU, a preto je rozumné predpokladať, že účinnosť chemoterapie 5-FU na báze sú spojené so špecifickými p53 polymorfizmy [49]. Naše vitro
nálezy podporujú tieto epidemiologických a experimentálnych dát a naznačujú možný mechanizmus pre 5-FU sprostredkovanej p53-NF-kB interakciu na mieste väzby p53-codon72.

Ako sa dalo očakávať v naša štúdia ukázala, že bunkové línie s pre alely boli odolnejšie voči 5-FU, než tie, ktoré sa Arg alely. Profil potlačenie rastu 9 žalúdočných nádorových bunkových línií ukázala dobrú koreláciu hladiny NF-kB proteínov. Tieto výsledky naznačujú, že Arg /Arg genotyp má silnejší indukciu apoptózy, ako je Pro /Pre genotyp v prítomnosti 5-FU. Medzi bunkové línie (odvodené od pacientov s rakovinou žalúdka japonských), pomer Arg /Arg: Arg /Pro: Pre /Pro bol 04:01:03, zatiaľ čo u zdravých japonských pacientov bol 4.5: 4.4: 1 [52] , To môže odrážať proces výberu, ku ktorému dochádza v priebehu vývoja nádoru a nariadenia ako bunkové línie. Predchádzajúce meta-analýzy rizika rakoviny a p53-codon72 polymorfizmy naznačujú, že Pro /Pre genotyp má vyššie riziko rakoviny (nižšia pre Arg /Arg genotypu) v ázijskej populácie [45], [53]. Avšak, význam "rizika rakoviny" pre rakovinu zhubného ochorenia alebo liečebnej odpovede je potrebné ešte objasniť, pretože je všeobecne ťažké vykonať klinické štúdie dominuje genetickými polymorfizmy a vyhodnotiť skutočné genetické účinky liečby. K dnešnému dňu, väčšina správy popisujúce pridružení medzi p53 codon72 polymorfizmu a chemoterapeutických reakcie ukázali, že Arg /Arg genotyp má priaznivú odozvu v širokej škále nádorov liečených konvenčnými genotoxické lieky [49], [54], [55] , Navrhujeme predpokladaný mechanizmus pre reakciu na 5-FU cez NF-kB a proteínu p53 väzba spojené s p53 polymorfizmus, a tým aj kombinačné diagnóza expresie proteínu a codon72 NF-kB môže byť užitočným ukazovateľom pre pooperačné adjuvantnej chemoterapie. Okrem niekoľkých súborov dát vo veľkom meradle [52], [56], rozsah demografických a etnických distribúciou polymorfizmu zostáva nejasný. Hromadia údaje o etnické rozdiely pre polymorfizmus môže vysvetliť rozdiely v riziku rakoviny alebo rýchlosti chemoterapeutickým odpovede v populácii pacientov.

Stručne povedané, naše zistenia naznačujú, že NF-kB reguluje p53 transkripčnú aktivitu v reakcii na 5-FU, ktorá môže byť spojená s polymorfným mieste p53 v codon72. Ďalšie klinické a epidemiologické štúdie by mala posúdiť užitočnosť súbežné patologické /genetické hodnotenie NF-kB /p53-codon72 v chirurgicky odobratých vzoriek s karcinómom žalúdka, aby sa predpovedať účinnosť pooperačné 5-FU na báze adjuvantnej chemoterapie.

podporné informácie
tabuľke S1.
Primer Sekvencia
doi: 10,1371. /journal.pone.0090155.s001
(DOCX)

• Ploche ONE: Zmena telesnej hmotnosti a makrofágov inhibičné cytokíny 1 počas chemoterapie v pokročilej rakoviny žalúdka: Čo je Ich klinický význam
• Ploche ONE: Interakcie Účinky pri-rokov-7a-1 rs10739971 s PGC a ERCC6 Génové polymorfizmy v rakoviny žalúdka a atrofickú gastritídou