PLoS ONE: kompensacinė vaidmuo NF-κB į p53 Atsakas į 5-FU chemoterapijos skrandžio vėžio ląstelių linijas

Anotacija

Nepaisant nepaprasto gerinimo pooperacinis 5-FU turinčiais palaikomąja chemoterapija, paūmėjimų dažnis skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kuriems atliekama gydomoji rezekcija po pagalbiniam chemoterapijos išlieka didelė. Todėl, svarbu nustatyti prognozavimo žymeklius už chemoterapinę veiksmingumo ir 5-FU. Mes neseniai nustatė NF-κB kaip kandidatas atkryčio prognozavimas biologinis į skrandžio vėžį. Įvertinti biologinę reikšmę NF-κB į 5-FU turinčiais chemoterapijos kontekste mes išanalizavo NF-κB priklausantį biologinį atsaką ant 5-FU gydymo skrandžio vėžio ląstelių linijas. buvo nustatytos septynios genai, kuriuos sukelia 5-FU gydymo į NF-κB priklausomu būdu, penki iš jų yra žinomi, P53, tikslus. Nokdaunas iš RelA
, kuris koduoja 65 psl subvieneto NF-κB, sumažėjo tiek p53 ir p53 baltymo taikinio lygį. Priešingai, NF-κB nebuvo paveikti TP53
triuškinantis. Mes taip pat parodė, kad ląstelių linijos guolis Pro /Pro homozigotiškumo į codon72 p53 exon4, kuris yra svarbus NF-κB privalomas p53, yra labiau atsparūs 5-FU, negu su Arg /Arg homozigotiškumo. Galime daryti išvadą, kad NF-κB vaidina svarbų vaidmenį reaguojant į 5-FU gydyti skrandžio vėžio ląstelių linijas, su kuo kompensacine funkcija p53. Šie rezultatai rodo, kad NF-κB yra potencialus 5-FU chemosensitivity prognozavimas žymeklis, kuris gali atspindėti 5-FU sukeltas streso reagavimo būdus, įskaitant p53

nurodomoji dalis:. Endo F Nishizuka SS, Kume K Izidė K, Katagiri H, Izidė K, ir kt. (2014) kompensacinė vaidmuo NF-κB į p53 Atsakas į 5-FU chemoterapijos skrandžio vėžio ląstelių linijas. PLoS ONE 9 (2): e90155. Doi: 10,1371 /journal.pone.0090155

redaktorius: Tomas G. Hofmann, Vokietijos vėžio tyrimų centras, Vokietija

Įstojo: Balandis 17, 2013 m Priėmė: Sausis 28, 2014 m Paskelbta 27 vasario 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 endo ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė MIAST (medicinos inovacijos iki pažangių mokslo ir technologijų) projekto dotacijos-in-pagalbos strateginio medicinos mokslo tyrimų centras iš švietimo ir mokslo ministerijos, kultūros, mokslo ir technologijų, Japonija, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); ir Grantas-in-pagalbos moksliniams tyrimams (C) (11863286) (S.S.N.) ir (12877914) (K.Ko.). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

skrandžio vėžio dauguma pasaulyje diagnozuojama Rytų Azijoje [1], kur standartinis gydymas pažengusiems skrandžio vėžio lieka operacija ir chemoterapija. Pastaruoju metu išsivysčiusiose adjuvanto chemoterapiniai režimai po radikalių pašalintas skrandis už išplitusiu skrandžio vėžiu, padarė nepaprastą pažangą kontroliuoti atkryčio ir ligos neapimtos teritorijos išlikimui, ypač Japonijos gyventojų [2], [3]. Tačiau 30-40% pacientų vis dar patiria atkrytį nepaisant chemoterapija po radikalių pašalintas skrandis [3], o tai rodo, kad pacientų atranka remiantis molekulinės informacijos potencialiai gali būti labai veiksminga didinant chemoterapijos sukelta ne atkryčių ir išgyvenimo.

Norėdami pasirinkti skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kurie gali gauti naudos iš chemoterapijos, svarbu prieš chemoterapiją suprasti individualius jautrumą [4]. Pooperacinis palaikomoji chemoterapija skrandžio vėžiu suteikia galimybę išbandyti pacientų gautas navikai, kol jie gauna chemoterapija. Bandant nustatyti galimus biologinius žymenis į šį nustatymą baltymų lygį, mes anksčiau pranešė ląstelių linija skydelis patikros sistemą naudojant kiekybinį baltymų ekspresijos su atvirkštinių fazių baltymų matricos (RPPAs) [5], [6] kartu su somatinių ląstelių remiantis augimas tyrimo sistema, remiantis NCI-60 ląstelių linija atrankos skydelyje koncepcijos [7], [8]. biologiniai žymenys kandidatės buvo izoliuoti remiantis koreliacijos koeficientų iš baltymų ekspresijos ir narkotikų jautrumo matrica ir tada toliau patvirtintas naudojant chirurgiškai pašalintos pavyzdžius [9]. Remiantis šiuo požiūriu, mes nustatė du biologinius žymenis tuo baltymų lygį, įskaitant NF-κB ir JNK, kurio lygis buvo gera koreliacija su chemoterapinių atsakymą. Kuo didesnė raiška NF-κB atrodė koreliuoja su blogesne prognoze, o JNK parodė atvirkštinį ryšį. Šie žymenys taip pat buvo patvirtinta molekuliniu lygiu naudojant virškinimo trakto vėžio ląstelių linijas. Įrodyta, kad siRNA tarpininkaujant triuškinantis iš 65 psl beveik išimtinai veikia 5-FU jautrumą tarp šiuo metu naudojamų chemoterapiniais vaistais; bet tai ne už JNK triuškinantis atveju [9]. Todėl mes padarė išvadą, kad NF-κB vaidina dominuojantį vaidmenį 5-FU gydymo ir JNK gali būti lėtinio uždegimo skrandžio fono gleivinės [10] indikatorius. Kaip šio patvirtinimo tyrimą pratęsimo, mes siekėme ištirti šiuos baltymus funkcionaliai ir paaiškinti NF-κB vaidmenį kaip streso indukuojamąją transkripcijos veiksnio 5-FU ir gydymo metu. Mes taip pat įvertintas p53 vaidmenį po to, kai 5-FU medijuojamos transactivation NF-κB [10], [11], nes ji yra gerai žinoma, kad p53 yra aktyvuota reaguojant į šią genotoksine agento [12]. Šiame tyrime mes pranešti galimą kompensacinę funkciją NF-κB už p53 analizuojant tam p53-NF-κB privalomas polimorfinį svetainę, kodono 72 p53. Kartu šie rezultatai rodo, kad NF-κB /P53-codon72 gali būti tvirta biologinis už 5-FU jautrumo.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos

Devyni žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, įskaitant Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY ir MKN45 buvo gauti iš RIKEN Bioresource centro Mobilusis bankas. VVT-1 buvo de novo
ląstelių linija, kuri įkurta mūsų laboratorijoje iš Japonijos vyrų skrandžio vėžiu, atkritę peritonitas carcinomatosa. VVT-1 ląstelių linijos naudojimas buvo patvirtintas Iwate medicinos universiteto institucinė ekspertizės valdyba (H25-116 ir HG H25-15) ir donoro paciento šeimos nariai, kurie mirė ne įsisteigimo ląstelių linijos laiką su parašyta informuotas sutikimas, atsižvelgiant į mėginių paėmimo ir priėmimo ląstelių liniją. Ląstelės buvo auginamos 70-80% susiliejimo į RPMI-1640 papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) 37 ° C 5% CO buvimo _2.

paruošimas Cell lizate

"Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant ir ląstelių granules buvo lizuoti naudojant Pink Buffer kuriame 9 m karbamido (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, JAV), 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS; CalBiochem Merck MILLIPORE, Darmštatas, Vokietija), 2% pH 8,0-10,5 Pharma-Lyte ( "GE Healthcare Japonija, Tokijas, Japonija) ir 65 mm DTT (" GE Healthcare Japonija, Tokijas, Japonija), kaip aprašyta anksčiau [5], [13].

Vakarų dėmė

SDS-PAGE atliekamas naudojant NuPAGE 4-12% bis-TrisGel elektroforezė (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV), XCell Žinoma Užrakinti Mini ląstelė (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV), ir "Power AAM HC (Bio-Rad, Heraklis, CA, JAV). Resolved baltymai ant gelio buvo perkeltas į nitroceliuliozinio membranos naudojant iBlot Sausas sugeriamojo sistema (INVITROGEN, Carlsbad, CA, JAV). Gauti membranos buvo blokuotos 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) ir 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Heraklis, CA, JAV) TBS (TBST) 1 val. tada membranos buvo inkubuojami su nurodytais pirminių antikūnų, įskaitant visos-aktino, p53 ( "Thermo Scientific", Kalamazoo, MI, JAV); P21, TIGAR, ir PUMAα /β (Santa Krusas Biotechnologijos, Dalasas, TX, Jungtinės Amerikos Valstijos); ir NF-κB, α-tubulino ir PCNA (Mobilusis Signalizacijos Technologijos Japonija, Tokijas, Japonija). Be to, šie Membranos buvo plaunami du kartus po 5 min su TBST, inkubuoto su HRP-konjuguoto antrinio antikūno 1 h, ir tada plaunami du kartus po 5 min TBST. Cheminės liuminescencijos aptikimo reagentai buvo inkubuojami su membranų 1-5 min ir tada vaizdai buvo įgytos naudojant vaizdo Quant LAS500 (GE Healthcare Japonija, Tokijas, Japonija). Įvertinti baltymų indukcija 5-FU, Vakarų dėmės buvo įvertinami naudojant ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

imunocitocheminiais

Ląstelės buvo auginamos 70-80 % susiliejimo į RPMI-1640 papildytas 10% FBS į 4-kameros polistireno laivas audinių kultūros apdoroto stiklo skaidres ir po to yra veikiamas su 5-FU, kaip nurodyta kiekvieno eksperimento metu. Po to, kai ląstelės buvo veikiamos 50 mkm 5-FU už 4 h pamatyti iš anksto transkripcijos reakcija, tai buvo nurodyta 4% paraformaldehido, membranos pralaidumu naudojant 0,2% Triton X-100 PBS, ir nudažomi su DAPI (0,6 mkm DAPI, 50 mikrol RNazės, ir 5 ml PBS), kambario temperatūroje 12 min. tada ląstelės buvo inkubuojamos su šių pagrindinių antikūnų: anti-NF-κB 65 psl, fosfo-NF-κB 65 psl (Ser536), ir fosfo-p53 (Ser15) (Mobilusis signalines technologijos Japonija, Tokijas, Japonija), ir p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, JAV). Pagaliau, ląstelės buvo inkubuojamos su arba Alexa Fluor488- arba 568-konjuguoto antriniais antikūnais (Life "technologijas Japonija, Tokijas, Japonija). BX43 fluorescencinis mikroskopas (Olympus, Tokijas, Japonija) buvo naudojamas vaizdų gavimo.

Genų ekspresijos

MKN45 Ląstelės buvo surinktos po gydymo su arba be 50 mkm iš 5-FU 4 h , tada RNR buvo išskirta iš augalinės ląstelės ir genų ekspresijos profiliavimas buvo atliekamas pagal gamintojo nurodymus (Žinoma Spausdinti G3 žmogaus GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japonija, Tokijas, Japonija). Pirminiai duomenys pirmą kartą buvo normalizuotas dalijant kiekvieną zondo signalą iki 75 ^{-ojo procentilio visą signalą. Kiekvienas Mikrogardelė eksperimentas buvo daromas po du kartus baigiasi dviejų kontrolės ir dviejų 5-FU gydymo Mikrogardelė duomenų rinkinių. Identifikuoti genus, kurie buvo skirtingai išreikštas atsakant į 5-FU, kiekvienas valdymo duomenų rinkinys buvo lyginamas atskirai kiekvienam 5-FU gydymo rinkinys (4 palyginimai). Skirtingai išreikšti genai buvo tie, kurie turėjo išraiška >kaita; 2 kartus kiekvienoje palyginimui. Mes nustatė galutinį rinkinį 10 diferencijuotai išreikštų genų remiantis jų dažnumą 4 palyginimų [14]. Patvirtinti, kad šių ekspresijos pokyčių atgaminimas, kiekybinis realaus laiko AT-PGR iš 5-FU bandiniai 0, 4, 8, 12, ir 24 val buvo atlikta kiekvienam geno. Gruntas sekos yra išvardytos S1 lentelėje. Dėl genų sukeliamų 5-FU, analizė promotoriaus privalomas svetainių atlikta naudojant JASPAR algoritmą (JASPAR, http://jaspar.genereg.net/). 1000 BP Rėmėjas seka būdinga atitinkamų genų buvo gauta iš Transkripcinis reguliavimo elementų duomenų bazėje (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Įrišimo vietos buvo prognozuojama skenuojant promotorių sekos su konsensuso sekos NF-κB ir p53 su 70% aprašymą rezultatą ribą.}

RELA ir TP53 Gene triuškinantis

Ląstelės buvo auginamos 70-80 % susiliejimo į RPMI-1640 papildytas 10% FBS į 6-bei ląstelių kultūrų lėkštelėse ir tada gydomi NF-κB 65 psl ar p53 siRNA (cell Signalizacijos technologijų Japonija, Tokijas, Japonija) 48 val. Trumpai tariant, nokdaunas buvo atliekama naudojant Trans IT (TKO Mirus Bio Corporation, Madison, WI, JAV), esant 3% koncentracijos 10 min kambario temperatūroje. Atitinkamų koncentracijų siRNAs kiekvienai ląstelių linijos buvo sumaišomas su Trans IT-TKO sprendimų, po to 20 min inkubuojant kambario temperatūroje. SiRNA koncentracija buvo naudojamos taip: 100 Nm 65 psl siRNA už MKN45 ir MKN74 ląsteles ir 150 Nm GSS ir Kato-III ląstelių; ir 100 Nm p53 siRNR už MKN45 ir GSS ląstelės, ir 50 nm MKN74 ląsteles. Po 48 h, ląstelės buvo nuimta ir baltymų koncentracija nagrinėjo Vakarų dėmė. Du siRNA konstruoja, turintys skirtingas sekas su tuo pačiu tikslinio geno buvo naudojamas kiekvienam geno patvirtinti triuškinantis specifiškumą. Mobilusis ciklas pasiskirstymas buvo įvertintas naudojant Tali vaizdiniai citometre (Life technologies ", Carlsbad, CA, JAV). Norėdami pamatyti didžiausią poveikį siRNA ant 5-FU Reaguodama į tai, kad vaistas buvo įtraukta 48 h po siRNR buvo pernešta, o atitinkama ląstelių ciklas buvo matuojamas po 24 h inkubacijos su 5-FU. Visi eksperimentai buvo kartojami bent tris kartus.

TP53 Statusas ir Codon72 variantas

DNR buvo išskirta iš skrandžio vėžio ląstelių linijas, naudodamos QIAmp DNR Mini Kit (Qiagen Japonija, Tokijas, Japonija). PGR amplifikacija buvo atliekama p53
exon4 codon72 variantas (lentelė S1) ir P53
exon5-9 mutacijos kaip aprašyta anksčiau [15], [16]. Kiekvienas PGR produktas buvo sekos naudojant ABI PRISM 3030xl genetinę analizatoriumi (Applied BIOSYSTEMS, Foster City, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Sekos rezultatai buvo analizuojami naudojant FinchTV (PERKINELMER Japonija, Tokijas, Japonija) ir MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Augimas slopinimas Analizės

Dešimt tūkstančių ląstelių per gerai buvo pasėjamos į 96-gerai mikroplašu. vėliau dvidešimt keturias valandas ląstelės buvo gydomi 5-FU 24 val. Po 5-FU gydymą, gyvų ląstelių frakcija buvo matuojamas naudojant Mobilusis Skaičiavimo KIT-8 (Dojindo Molekulinė TECHNOLOGIES, Kumamoto, Japonija) ir TRISTAR LB 941 microplate skaitytuvas (BERTHOLD TECHNOLOGIES, Bad Wildbad, Vokietija). Penkiasdešimt procentų augimo slopinimo koncentraciją (GI _{50) buvo apskaičiuotas naudojant Prism programinę įrangą (grafikas Pad Programinė įranga, La Jolla, CA, JAV). GI 50 vertės buvo naudojamos siekiant nustatyti koreliacijas tarp 5-FU veiksmingumo ir baltymų koncentracijos remiantis Pirsono produktas-momentas koreliacijos koeficientas ( R
).}

Rezultatai

fluorouracilu Skatina NF-κB

Norėdami patvirtinti tipinį NF-κB elgesį, reaguojant į 5-FU gydymo, mes ištyręs pavienių ląstelių tyri- mas lokalizacijos NF-κB į MKN45 (53 psl laukinio tipo), MKN74 (53 psl mutantas ), GSS (53 psl mutantas), ir Kata III (53 psl homozygously išbrauktas) ląstelių linijas. Vakarų dėmė analizė su branduolinėmis ir citoplazmos frakcijų parodė, kad 5-FU sukeltas NF-κB abiejuose MKN45 skyrių, tačiau nebuvo pastebėta p53 mutantas ląstelių linijas (pav. 1A-D). Mes taip pat nagrinėjo 5-FU poveikį NF-κB lokalizacijos ląstelių imunocitocheminį (pav. 1E-H). NF-κB lokalizuota į neapdorotas MKN45 citoplazmoje, o 5-FU gydymas sukėlė į NF-κB branduolinės lokalizaciją (1E pav.) Padidėjimas; Tačiau, ne padidėjimas buvo pastebėtas p53 mutantas ląstelių linijų (pav. 1F-H). Mes taip pat pastebėjo, drastišką padidėjimą fosforilinto NF-κB (65 psl Ser536) Atsižvelgiant į MKN45 branduolio gydomi 5-FU, nurodant NF-κB buvo transactivated 5-FU (pav. 1e). Steigiamąjį branduolinės lokalizacijos ir kartais fosforilinimas p53 buvo pastebėtas MKN74 bet neatrodė, kad būtų sukeltas 5-FU (1G pav.). Branduolinė lokalizacija p53 buvo sukeltas 5-FU GSS, bet įsijungia signalas buvo alpti (1H pav.).

p53 tikslai yra sukeltos ant 5-FU valymo

Nuo NF-κB yra transkripcijos faktorius (TF), jo branduolinė lokalizacija ant 5-FU gydymo primygtinai siūlo transactivation. Mes nustatė viršų 7 nuorašai tarp daugiau nei 60.000, kurie buvo sukeltas po 4 h nuo 5-FU gydymo MKN45 naudojant genų ekspresiją profiliavimo (1 lentelė). Įdomu tai, kad penki iš 7 nuorašai, ty BBC3
(kuris koduoja p53 iki reguliuojama moduliatorius apoptozės, PUMA) BTG2, C12orf5
(kuris koduoja galimą fruktozės-2,6-bisphosphatase TIGAR), CDKN1A ir GPR87
, yra žinomi p53 tikslai [18] - [22]. Iš promotoriaus jungimosi vietų buvimas buvo prognozuojama skenuojant promotorių sekos su konsensuso sekos NF-κB ir p53 naudojant JASPAR algoritmą (1 lentelė) [23].

Mes nustatėme, kad p53 lygis buvo sukeltas branduolį panašiai tiems, NF-κB reaguojant į 5-FU gydymo (pav. 1e). Gydymas 5-FU, taip pat padidino p53 fosforilinimo lygiai Ser15, tai rodo jos transactivation (. 1E pav, ref. [24]). Iš tiesų, iš viso p53 sukeltos 5-FU dauguma, atrodo, fosforilinamos. Mes taip pat pastebėjo, priklausomai nuo laiko indukcijos genų, įskaitant C12orf5 (TIGAR)
BBC3 (PUMA)
CDKN1A (P21)
ir BTG2
pagal 5-FU naudojant RT-PGR (1i pav.). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad mobiliojo ryšio atsakas į 5-FU gydymo gali dalyvauti ir NF-κB ir p53 už transkripcijos aktyvavimo Tokiu atveju, MKN45.

RELA triuškinantis turi didesnį poveikį p53 Tikslinės baltymų nei TP53 genas triuškinantis

Jei įvertinti reglamentavimo poveikį NF-κB ir p53 reaguojant į 5-FU gydymo, mes išanalizavo baltymų lygius 65 psl, p53, taip pat žinomų p53 tikslus, p21, Tigar, ir Puma, kurias Imunoblotingo po RelA
ir , TP53
nokdaunas į MKN45, MKN74, GSS, ir Kato-III. RelA
nokdaunas sukėlė žymiai sumažėjo p53 lygių visose ląstelių linijų. Kaip ir tikėtasi, p21 lygis, TIGAR, ir PUMA buvo taip pat sumažėjo (2a pav.). Priešingai, o , TP53
nokdaunas sumažėjo P53 lygius, tai neturėjo įtakos 65 psl lygį. Kaip ir tikėtasi, p53 tikslinių baltymų koncentracija sumažėjo TP53
triuškinantis; Tačiau šis sumažėjimas buvo mažesnis nei sumažėjimo dėl RELA
triuškinantis (pav. 2b). Į ląstelės ciklo analizė, MKN74, GSS, o Kato-III ląstelių linijas parodė šiek tiek padidėjo S arba G2 fazės frakcija o MKN45 eksponuojami į G1 frakcijos padidėjimą po 24 val ekspozicija 5-FU į 65 psl ir p53 nokdaunas panašus į atitinkamų scrambles (pav. 2C). Šie rezultatai gali rodyti, kad atsako ląstelių streso technika, kuri palaiko ląstelės ciklo pasiskirstymą nepaisant 65 psl ir p53 triuškinantis tvirtumą.

TP53 Codon72 Pro Variant Eksponatai Žemas 5-FU Jautrumas ir High NF-κB Lygiai

Genų Klojinius išardomi eksperimentiniai rezultatai parodė, kad tarp NF-κB ir p53 baltymų sąveika gali būti svarbus 5-FU gydymo kontekste. Ištirti galimybę, kad TP53
codon72 variantas gali turėti įtakos ląstelių atsaką į 5-FU gydymo, mes sekos , TP53
codon72 taip pat mutacijų DNR rišantis domenas kodavimo regionus (ty egzonų 5-8) 9 skrandžio vėžio ląstelių linijas (2 lentelė). Iš codon72 variacijos ir TP53 mutacija
nebuvo aiškius asociacijos statusą.

Kitas tiriami tarp 5-FU jautrumo ir TP53
būsenos (Pav. 3A asociacija ), taip pat šių endogeninių lygiai NF-κB ir p53 (pav. 3B). GSS, GCIY ir MKN45 linijos, kurioms būdingi Pro homozigotinę variantą, eksponuojami mažas jautrumas 5-FU, o KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 ir IWT1 linijų, turinčių Arg alelio eksponuojami gana didelio jautrumo. Kato-II, III, kuris turi daug, TP53
išbraukta [25], buvo jautriausios 5-FU. NF-κB baltymo koncentracija buvo ypač susijęs su 5-FU jautrumas ( R
= 0,68 P
= 0,04; 3C pav.); Tačiau nebuvo aiški koreliacija tarp p53 lygių ir 5-FU jautrumas ( R
= -0,04; P
= 0,95; pav. 3D). Šie rezultatai rodo, kad Apple homozigotiškumo yra susijęs su 5-FU atsparumo, o nei p53 mutacija nei endogeninių p53 lygis tiesiogiai veikia 5-FU jautrumą.

Diskusijos

Mes jau anksčiau nustatė NF-κB kaip potencialus prognozavimo persekiotoją pooperaciniam 5-FU turinčiais chemosensitivity už išplitusiu skrandžio vėžiu [9]. NF-κB yra indukuojamąją transkripcijos faktorius susideda iš 65 psl (Rela), C-ed, ed-B P50 /NF-κB1 ir P52 /NF-κB2 [26], ir vaidina pagrindinį vaidmenį imuninių reakcijų ir uždegiminės citokino reguliavimas [27] - [29]. Chang et al anksčiau parodė, kad NF-κB sukeltas aukštyn arba žemyn reguliavimą atskirtinai išreikštų genų 5-FU sukeltų žarnyno gleivinės uždegimo, sukeliant uždegimą skatinančių citokinų, tokių kaip IL-6, TNF-alfa, ir IL-1β [10]. buvo laikomi šie 5-FU sukeltas uždegimo reakcija, kad dalis stresu išvengti procesų, kurie gali sukelti jautrumą 5-FU veiksmingumo skrandžio gleivinės [30]. Nors tai buvo pasiūlyta, kad aktyvacija NF-κB nėra tiesiogiai susijęs su naviko vystymosi ir progresavimo [31], NF-κB buvo laikomas pagrindinis biologinis ir gydymo tikslo [32]. Tiesioginis įrodymų sumažėjusio Atsparumas cheminėms 5-FU iki siRNA už RELA
kartu su aukštos diskriminacinės galios NF-κB branduolinės dažymo gydomosiomis rezultatų chirurgiškai pašalinti audinių paskatino mus atlikti tolesnį patvirtinimą NF-κB nuo biologinis požiūris.

Mūsų transkripcijos profiliavimo rezultatai atskleidė, kad kelios p53 pasroviui genai buvo iki reguliuojama, atsižvelgiant į 5-FU, kurioje transactivation NF-κB pat įvyko. anksčiau buvo parodyta šie du pagrindiniai transkripcijos faktorius būtų bendrai reguliuojama reaguojant į genotoksiškų agentų [33] - [35] ir TNF-α [36], [37]. Be to, buvo pasiūlyta, kad kartu aktyvavimo p53 ir NF-κB į navikų genotoksiškų agentų gali sukelti terapinį gedimams, atsiradusiems dėl NF-κB sąlygojamą išlikimo signalizacijos [38].

Individuali triuškinantis iš šios transkripcijos veiksniai atskleidė genus pasroviui p53 nukentėjo 65 psl triuškinantis, o poveikis buvo ribotas p53 triuškinantis. Ankstesni pranešimai pasiūlė bendradarbiavimo santykius tarp p53 ir NF-κB į autofagija, apoptozės kontekste, ir S-etapas Checkpoint aktyvacijos [34], [39] - [41]. Mūsų rezultatai taip pat rodo, kad NF-κB gali kompensuoti transkripcijos veiklos p53, kai nepažeistas funkcija yra prarastas reaguojant į 5-FU gydymui. Iš tiesų, skrandžio vėžio dauguma padengti mutacijas p53 DNR rišantis domenas, todėl jis tampa transkripciškai neaktyvus [42]. Neseniai atliktas tyrimas Frankas ir kt
. Pranešama, kad codon72 polimorfizmas yra , TP53
esmės paveikia p53 gebėjimą bendradarbiauti su NF-κB genų transactivation, ypač apoptozės indukcija per kaspazė 4/11 [40]. Kartu su šia išvada, kad kai transkripcijos veikla p53 reikia NF-κB atsakant į 5-FU, p53 kodono 72 Polimorfizmas savo NF-κB privalomas gali būti labiau įtakinga ne mutacijos statusą TP53
arba baltymų raiškos statusas p53

iš codon72 polimorfizmo įtaka spontaniškai vėžio rizika buvo anksčiau tyrė, bet galutinai neįrodė dėl ribotų žmogiškųjų gyventojų ir gyvūnų modelių [40], [43] - [45].. Tačiau codon72 polimorfizmas gali vaidinti svarbų vaidmenį išlaikant nustatytus vėžines ląsteles nei suveikimo ląstelių piktybinę transformaciją. Iš tiesų, ankstesni tyrimai, pranešė, kad Pro /Pro alelis yra, susijusių su atsparumu chemoterapijos ir blogos prognozės burnos ertmės [46], taip pat storosios žarnos [47], krūties [48] ir skrandžio [49] vėžio ir neuroblastomų [ ,,,0],43]. A in vitro
tyrimus, taip pat remti šią hipotezę, rodančią, kad Arg alelis yra stipresnis apoptozė induktorius nei Pro alelio [40], [50], [51]. Apoptozę yra vienas iš pagrindinių mechanizmų, kurias sukelia 5-FU ir todėl yra pagrįsta hipotezę, kad 5-FU pagrįsta chemoterapija veiksmingumas yra susijusios su konkrečiomis p53 polimorfizmų [49]. Mūsų in vitro
išvados remti šias epidemiologinius ir eksperimentinius duomenis ir pasiūlyti galimą mechanizmą 5-FU tarpininkaujant P53-NF-κB sąveikos metu p53-codon72 privalomu svetainėje.

Kaip ir tikėtasi , mūsų tyrimai parodė, kad ląstelių linijos su Pro alelio buvo atsparesni 5-FU, nei su Arg alelio. Augimo slopinimas aprašymą 9 skrandžio vėžio ląstelių linijas parodė gerą koreliaciją su NF-κB baltymų koncentracijos. Šie rezultatai rodo, kad Arg /Arg genotipą turi stipresnį apoptozės sužadinimu nei Pro /Pro genotipo nuo 5-FU buvimą. Tarp ląstelių linijas (visi kilęs iš Japonijos skrandžio vėžiu sergantiems pacientams), iš Arg /Arg santykis: Arg /Pro Pro /Pro buvo 4:01:03, o kad sveikų japonų pacientų buvo 4.5:4.4:1 [52] , Tai gali atspindėti atrankos procesas, vykstantis per auglių vystymuisi ir įsteigta kaip ląstelių linija. Ankstesnis meta analizes vėžio rizikos ir p53-codon72 polimorfizmas leidžia manyti, kad Pro /Pro genotipas turi didesnę vėžio riziką (mažesnė už Arg /Arg genotipo) Azijos gyventojų [45], [53]. Tačiau "vėžio rizika" vėžio piktybinių navikų arba reakciją į gydymą reikšmė dar reikia išsiaiškinti, nes jis paprastai yra sunku atlikti klinikinį tyrimą dominuoja genetinių polimorfizmas ir įvertinti tikruosius genetinius pasekmes gydyti. Iki šiol dauguma ataskaitos, apibūdinančios ryšį tarp p53 codon72 polimorfizmo ir chemoterapinių atsakymų asociacija įrodė, kad Arg /Arg genotipas turi teigiamą atsaką įvairių vėžio gydomiems įprastiniais genotoksinėmis narkotikų [49], [54], [55] , Siūlome tariamą mechanizmą atsakant į 5-FU per NF-κB ir p53 baltymo surišimo susijęs su p53 polimorfizmo, taigi ir kombinacyjnych diagnozė NF-κB baltymų ekspresijos ir codon72 gali būti naudinga rodiklis pooperacinio palaikomąja chemoterapija. Be keleto stambių rinkinių [52], [56], iš demografinių ir etninių paskirstymo į polimorfizmo kiek lieka neaiškus. Kaupiamosios duomenis apie etninių skirtumų dėl polimorfizmo gali paaiškinti nuo vėžio rizika ar chemoterapinio atsako dažnis pacientų populiacijos skirtumų.

Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad NF-κB reguliuoja p53 transkripcijos veikla reaguojant į 5-FU, kurios gali būti susijusios su polimorfinėje vietoje p53 esant codon72. Daugiau klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai turėtų įvertinti kartu patologinio /genetinio įvertinimo NF-κB /p53-codon72 į chirurgiškai pašalinta skrandžio vėžio egzempliorių naudingumas siekiant prognozuoti pooperacinio 5-FU turinčiais palaikomąja chemoterapija efektyvumą.

Pagalbinė informacija
S1 lentelėje.
Primer sekos
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0090155.s001
(docx)

• PLoS ONE: Pakeisti kūno svorio ir makrofagų inhibitoriniam citokinų-1 per chemoterapija išplitusiu skrandžio vėžiu:? Koks jų klinikinė reikšmė
• PLoS ONE: interakcija poveikis pri-tegul-7a-1 rs10739971 su PGC ir ERCC6 Gene polimorfizmas skrandžio vėžio ir atrofijos gastritas