Plos ONE: na 5-FU-A Nadomestni Vloga NF-κB p53 pri odzivanju na 5-FU-Based kemoterapijo za želodca Cancer Cell Lines

Abstract

Kljub izredno izboljšanje postoperativne adjuvantno kemoterapijo, stopnja ponovitve bolnikov želodca z rakom, ki so podvrženi kurativno resekcijo sledi adjuvantno kemoterapijo še vedno precejšnje. Zato je pomembno ugotoviti napoved markerjev za kemoterapevtskim učinkovitosti 5-FU. Pred kratkim smo ugotovili NF-κB kot kandidat recidivno predvidevanja biomarker raka želodca. Za oceno biološki pomen NF-κB v okviru kemoterapijo na osnovi 5-FU, smo analizirali NF-κB-odvisno biološki odziv na zdravljenje 5-FU v želodcu raka celičnih linijah. smo identificirali sedem genov z obdelavo 5-FU inducirani v NF-κB-odvisen način kot, od katerih je pet so znani cilji p53. Rasklapanje za Rela
, ki kodira p65 podenoto NF-κB, zmanjšala tako p53 in p53 ravni ciljne beljakovin. V nasprotju s tem, NF-κB ni vplivala TP53
rasklapanje. tudi Pokazali smo, da so celične linije, ki nosijo Pro /Pro homozigotnosti v codon72 od p53 exon4, kar je pomembno za NF-κB vezavo na p53 bolj odporne na 5-FU kot tisti z Arg /Arg homozigotnosti. Sklepamo, da ima NF-κB pomembno vlogo pri odzivu na zdravljenje 5-FU v želodcu raka celičnih linijah, z možnostjo kompenzacijsko funkcijo p53. Ti rezultati kažejo, da je NF-κB potencialni 5-FU chemosensitivity napoved dvojno podajo, ki je lahko posledica 5-FU-inducirane poti stresa odzivanje, vključno z p53

Navedba. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) kompenzatorno vlogo za NF-κB p53 v odgovoru na 5-FU-Based kemoterapijo za želodca rakave celične linije. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10,1371 /journal.pone.0090155

Urednik: Thomas G. Hofmann, nemški Cancer Research Center, Nemčija

Prejeto: 17. oktober 2013; Sprejeto: 28. januar 2014; Objavljeno: 27. februar 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z MIAST (Medical inovacije Advanced znanost in tehnologijo) projekt Grant-v-Aid za strateško Medical Science Research Center iz Ministrstva za izobraževanje, kulturo, znanost in tehnologijo Japonske, 2010-2014 (SSN, K.Ku. , GW); in Grant-in-pomoč za znanstvene raziskave (C), (11863286) (S.S.N.) in (12877914) (K.Ko.). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

večina raka želodca na svetu zboli v vzhodni Aziji [1], kjer je standard terapija za napredne želodca raka ostaja operacijo in kemoterapijo. V zadnjem času razvili adjuvantne kemoterapije po kurativne želodca za napredovalega raka želodca naredili izjemen napredek na področju obvladujoče recidivov in brez bolezni preživetja, še posebej v japonski populaciji [2], [3]. Vendar pa je 30-40% bolnikov, ki so še vedno pride do ponovitve, čeprav prejemajo kemoterapijo po kurativnem želodca [3], kar kaže, da bi lahko bila izbira pacientov, ki temelji na molekularni informacij zelo učinkovita za povečanje-kemoterapijo posredovano brez ponovitve bolezni in preživetja stopnje.

Če želite izbrati za bolnike želodca z rakom, ki bi lahko imele koristi od kemoterapije, je pomembno razumeti individualne občutljivosti pred kemoterapijo [4]. Pooperativna adjuvantno kemoterapijo zaradi raka želodca, je priložnost, da preizkusite bolnikov, ki izhaja tumorje, preden so prejeli kemoterapijo. V poskusu, da bi ugotovili morebitne biomarkerjev v tem okviru na ravni proteina, smo že poročali sistem celične linije presejalni plošča s kvantitativno beljakovin izraz profiliranje z reverzno fazo Beljakovine Arrays (RPPAs) [5], [6], v povezavi z mobilnim temelji test rast sistem, ki temelji na konceptu NCI-60 presejalnega celična linija plošči [7], [8]. biomarkerjev kandidatke so izolirali na podlagi korelacijskih koeficientov iz beljakovin izražanja in občutljivosti drog matrice in nato še dodatno potrjena z uporabo kirurško odstranili osebki [9]. Na podlagi tega pristopa smo identificirali dve biomarkerjev na ravni beljakovin, vključno z NF-κB in JNK, katerega raven je bilo dobro korelacijo z kemoterapevtskim odgovor. Višja izraz NF-κB je zdelo, da se ujemajo s slabšo prognozo, medtem ko JNK pokazala inverzno povezavo. Ti markerji so bile potrjene tudi na molekularnem nivoju uporabo prebavne rak celičnih linij. Izkazalo se je, da je-siRNA posredovano rasklapanje za p65 skoraj izključno vpliva na občutljivost 5-FU med trenutno uporabljanih citostatikov; vendar to ne velja za JNK rasklapanje [9]. Zato smo sklenili, da ima NF-κB dominantno vlogo pri zdravljenju 5-FU in JNK lahko pokazatelj kroničnega vnetja želodčne sluznice ozadja [10]. Kot razširitev te študije validacije, smo skušali raziskati te beljakovine, funkcionalno in pojasni vlogo NF-κB kot stres inducirajo transkripcijski faktor med zdravljenjem 5-FU. Smo ocenili tudi vlogo p53 po 5-FU, posredovane transaktivacije NF-κB [10], [11], saj je znano, da je p53 aktivira pri odzivu na tej genotoksičnosti sredstvom [12]. V tej študiji smo poroča morebitno kompenzacijsko vlogo NF-κB za p53 z analizo p53-NF-κB vezavo polimorfne mesto, kodon 72 p53. Skupaj, te ugotovitve kažejo, da bi lahko NF-κB /p53-codon72 robusten biomarker občutljivosti 5-FU.

Materiali in metode

Mobilni Lines

Nine človeška želodca rakave celične linije, vključno z Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY in MKN45 so bili pridobljeni iz celic banke RIKEN Bioresource Center. IWT-1 je bila de novo
celična linija, ki je določena v našem laboratoriju iz japonskega moškega želodčni bolnik z rakom, ki se je bolezen ponovila peritonitisa carcinomatosa. Uporaba IWT-1 celične linije je odobril Institutional Review Board v Iwate Medical University (H25-116 in HG H25-15) in družini darovalca bolniku, ki je umrl v času priprave celične linije z pisno privolitev glede odvzema vzorcev in izdelavo celične linije. Celice smo gojili 70-80% konfluence v RPMI-1640 z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma (FBS), pri 37 ° C, v prisotnosti 5% CO _2.

Priprava celični lizat

Celice požanjemo s centrifugiranjem in celične pelete smo lizirali z uporabo roza Buffer vsebuje 9 M sečnino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ZDA), 4% 3 - [(3-holamidopropil) dimethylammonio] -1 -propanesul-fonate (kavbojke, Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Nemčija), 2% pH 8,0-10,5 pharma-LYTE (GE Healthcare Japonska, Tokyo, Japonska), in 65 mM DTT (GE Healthcare Japonska, Tokyo, Japonska) kot prej opisano [5], [13].

Western blot

SDS-PAGE smo izvedli z uporabo NuPAGE 4-12% bis-TrisGel elektroforeza (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), XCell Seveda Lock Mini-cell (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in Power PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, ZDA). Rešen proteinov na gelu smo prenesli na nitrocelulozno membrano s pomočjo iBlot Dry blot sistem (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Nastale Membrane so bili blokirani s 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) in 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) v TBS (TBST) za 1 h. Membrane smo nato inkubirali z navedenimi primarnih protiteles, vključno s pan-aktina, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, ZDA); p21, TIGAR in PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ZDA); in NF-κB, α-tubulin in PCNA (Cell Signaling Technology Japonska, Tokyo, Japonska). Naslednji so membrane dvakrat speremo 5 minut s TBST, inkubiranih s HRP-konjugiranega sekundarnega protitelesa za 1 uro in nato speremo dvakrat 5 minut v TBST. reagenti za odkrivanje Kemiluminescenca inkubiramo z membrano za 1-5 minut in nato so bile slike, pridobljene z uporabo Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japonska, Tokyo, Japonska). Da bi ocenili indukcijo beljakovin za 5-FU, so zahodni blots količinsko, z uporabo ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

imunocitokemija

Celice smo gojili na 70-80 % konfluence v RPMI-1640 z dodatkom 10% FBS v 4-komornih polistiren plovilo tkivno kulturo obdelamo steklene ploščice in nato obdelamo s 5-FU, kot je navedeno v vsakem poskusu. Potem ko so celice izpostavljene 50 uM 5-FU za 4 ure, da vidijo zgodnji transkripcijski odziva, so določene v 4% paraformaldehida, permeabiliziranih uporabi 0,2% Triton X-100 v PBS, in obarvamo z DAPI (0,6 pM DAPI, 50 ul RNase in 5 ml PBS) pri sobni temperaturi 12 minut. Celice smo nato inkubirali z naslednjimi primarnimi protitelesi: anti-NF-κB p65, fosfo-NF-κB p65 (Ser536), in fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japonska, Tokyo, Japonska) in P53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, ZDA). Končno smo celice inkubirali z bodisi Alexa Fluor488- ali 568 konjugiranim sekundarni protiteles (Life Technologies Japonska, Tokio, Japonska). BX43 fluorescenčni mikroskop (Olympus, Tokio, Japonska), je bila uporabljena za zajemanje slik.

Gene Expression profiliranje

MKN45 celice požanjemo po obdelavi z ali brez 50 pM 5-FU 4 ure . RNA smo nato ekstrahirali iz pridelek celic ter izražanje genov profiliranje je bila izvedena v skladu z navodili proizvajalca (Seveda Natisni G3 Human GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japonska, Tokio, Japonska). Neobdelani podatki so bili najprej normalizirali tako, da vsak signal, sonda, ki jih je 75 ^{percentil celotnega signala. Vsak mikromrež eksperiment je bil izveden v dveh izvodih, ki izhaja v dveh nadzor in dveh nizov podatkov mikromrež 5-FU zdravljenja. Za identifikacijo genov, ki so različno izražene kot odziv na 5-FU, je bil vsak niz kontrolni podatki v primerjavi ločeno za vsako obdelavo 5-FU, določenem (4 primerjave). Diferencialno izraženih genov so bili tisti, ki so imeli spremembo izražanja > 2-krat v vsakem primerjavo. Identificirali smo končni nabor 10 različno izraženih genov, ki temelji na njihovi frekvenci v 4 primerjavah [14]. Za potrditev ponovljivosti teh ekspresijskih sprememb, kvantitativno realnem času RT-PCR 5-FU obdelamo vzorce 0, 4, 8, 12 in 24 h smo izvedli za vsak gen. Primer zaporedja so navedeni v tabeli S1. Genov s 5-FU induciranih je analiza vezave promotorja območij izvede z uporabo JASPAR algoritem (JASPAR, http://jaspar.genereg.net/). 1000 bp promotor zaporedje specifični za posamezne gene so bili pridobljeni iz Transkripcijska regulatorni element Database (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Vezavna mesta so napovedali s skeniranjem promotorja sekvenc s konsenzom sekvencami NF-κB in p53 z 70% prag profil.}

Rela in TP53 Gene rasklapanje

Celice smo gojili na 70-80 % konfluence v RPMI-1640 z dodatkom 10% FBS v 6 vdolbinami celične kulture ploščah in nato obdelamo z NF-κB p65 ali p53 siRNA (celična signalizacija Technology Japan, Tokyo, Japonska) za 48 ur. Na kratko smo rasklapanje izvedemo z uporabo Trans IT-tko (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, ZDA) pri koncentraciji 3% za 10 minut pri sobni temperaturi. Ustrezne koncentracije siRNAs za vsako celične linije smo zmešali z Trans IT-tko rešitve, ki mu sledi 20 min inkubacije pri sobni temperaturi. Koncentracije siRNA, ki se uporabljajo, so bili naslednji: 100 Nm p65 siRNA za MKN45 in MKN74 celice, in 150 Nm pri GSS in Kato-III celic; in 100 nM p53 siRNA za MKN45 in GSS celice, in 50 nM za MKN74 celic. Po 48 urah smo celice poberemo in vsebnosti beljakovin so bile pregledane z Western blot. Dva siRNA konstrukte, ki imajo različne sekvence z enakim ciljnega gena smo uporabili za vsak gen za potrditev razgradljiv specifičnost. distribucija celični cikel je bila ocenjena s pomočjo osnovi slike Tali citometrom je (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA). Videti maksimalni učinek siRNA o odzivu 5-FU, je bila droga dodamo 48 ur po tem, ko je siRNA transfektirali in ustrezni celičnega ciklusa smo izmerili po 24 h inkubacije s 5-FU. Vse poskuse smo ponovili vsaj trikrat.

TP53 Status in Codon72 Variant

DNA je bila vzeta iz želodca raka celičnih linij z uporabo QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japonskem, Tokio, Japonska). PCR za je bila izvedena p53
exon4 codon72 variant (tabela S1) in p53
exon5-9 mutacije kot je opisano prej [15], [16]. Vsak izdelek PCR je zaporedje s pomočjo genetskega analizatorja ABI PRISM 3030xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) po protokolu proizvajalca. Rezultati zaporedja smo analizirali s FinchTV (PerkinElmer Japonska, Tokio, Japonska) in MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Rast Zatiranje Vsebnost

Deset tisoč celic na jamico smo zasejali v 96- mikroplošča. Štiriindvajset ur kasneje smo celice obdelali s 5-FU za 24 h. Po zdravljenju 5-FU, je bil delež živih celic izmerjena z uporabo mobilnega Counting Kit-8 (Dojindo Molekularni Technologies, Kumamoto, Japonska) in Tristar LB 941 bralcu mikroplošči (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemčija). Petdeset odstotkov koncentracija zaviranje rasti (GI _{50) je bila izračunana z uporabo Prism programske opreme (graf Pad programske opreme, La Jolla, CA, ZDA). GI 50 vrednosti so bile uporabljene za določitev korelacije med učinkovitostjo in beljakovin na ravni 5-FU, ki temeljijo na izdelek, trenutek koeficienta korelacije v Pearson ( r
).}

Rezultati

fluorouracil inducira NF-κB

za potrditev tipično NF-κB vedenje kot odziv na zdravljenje 5-FU, smo sledili subceličnih lokalizacijo NF-κB v MKN45 (p53 divjega tipa), MKN74 (p53 mutant ), GSS (p53 mutant), in Kato-III (p53 homozygously črta) celične linije. Western analiza blot z jedrskimi in citoplazme frakcij je pokazala, da 5-FU povzroča NF-κB v obeh oddelkov MKN45, vendar niso opazili P53 mutiranih celičnih linijah (sl. 1A-D). Proučili smo tudi vpliv 5-FU v NF-κB lokalizacije v celicah, ki jih imunocitokemija (sl. 1E-H). NF-κB lokalizirani v citoplazmo v neobdelanem MKN45, medtem ko je 5-FU zdravljenje povzročilo povečanje NF-κB jedrsko lokalizacijo (slika 1E.); Vendar pa ni bilo povečanje opaziti v celičnih linijah s p53 mutiranih (sl. 1F-H). Opazili smo tudi drastično povečanje fosforiliranega NF-κB (p65 Ser536) v jedru MKN45 zdravljenih s 5-FU, kar kaže, NF-κB je transactivated s 5-FU (sl. 1E). Konstitutivna jedrska lokalizacijo in občasno fosforilacijo p53 so opazili pri MKN74 vendar ni videti, da bi jih povzroča 5-FU (sl. 1G). Jedrska lokalizacija p53 je bila pridobljena s 5-FU v GSS, vendar se aktivira signalna je šibek (sl. 1 H).

p53 Cilji so povzročena na 5-FU Zdravljenje

Ker NF-κB je transkripcijski faktor (TF), njegov jedrski lokalizacija po obdelavi 5-FU močno kaže transaktivacije. Identificirali smo top 7 prepise med več kot 60.000, ki so bile izzvane po 4 urah zdravljenja 5-FU v MKN45 pomočjo genske ekspresije profilov (tabela 1). Zanimivo je, da pet od 7 transkriptov, in sicer BBC3
(ki kodira p53 reguliran modulator apoptoze, PUMA), BTG2, C12orf5
(ki kodira verjetnost fruktoze-2,6-bisfosfatazni TIGAR), CDKN1A in GPR87
so znani p53 cilji [18] - [22]. Prisotnost promotorja vezavnih mest je bilo napovedano s skeniranjem promotorja sekvenc s konsenzom sekvencami NF-κB in p53 uporabo JASPAR algoritem (tabela 1) [23].

Ugotovili smo, da so nivoji p53 so bile povzročene v jedru podobni tistim NF-κB v odziv na 5-FU zdravljenju (sl. 1E). Zdravljenje 5-FU povečala tudi raven p53 fosforilacije na Ser15, kar kaže na njeno transaktivacije (sl. 1E, ref. [24]). Dejansko je večina celotne p53 s 5-FU inducirane je zdelo, da se fosforilira. Opazili smo tudi časovno odvisnega indukcijo genov, vključno s C12orf5 (TIGAR)
, BBC3 (PUMA)
, CDKN1A (p21)
in BTG2
s 5-FU uporabi RT-PCR (sl. 1i). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da lahko celični odziv na zdravljenje 5-FU vključujejo tako NF-κB in p53 za transkripcijske aktivacije v tem kontekstu, v MKN45.

Rela rasklapanje ima večji vpliv na p53 Ciljna Beljakovine kot TP53 Gene rasklapanje

Za oceno regulatorni učinek NF-κB in p53 v odzivu na zdravljenje 5-FU, smo analizirali raven beljakovin za p65, p53, kot tudi znane cilje p53, p21, Tigar, in PUMA, ki ga zahodni blot naslednji rela
in TP53
rasklapanje v MKN45, MKN74, GSS, in Kato-III. Rela
rasklapanje povzročila izrazito zmanjšanje ravni P53 v vseh celičnih linijah. Kot je bilo pričakovati, je raven p21, TIGAR in PUMA so se tudi znižale (sl. 2A). Nasprotno, medtem ko je TP53
rasklapanje zmanjšala p53 ravni, to ni vplivalo na p65 ravni. Kot je bilo pričakovati, so se ravni P53 ciljnih beljakovin zmanjšalo za TP53
rasklapanje; Vendar pa je bilo to zmanjšanje manjše od zmanjšanja, ki ga je povzročil Rela
rasklapanje (sl. 2B). V analizi celičnega cikla, v MKN74, GSS in Kato-III celične linije so pokazali rahlo povečanje faznega frakcije S ali G2 ker MKN45 razstavljena povečanje frakcije G1 po izpostavljenosti 24 h do 5-FU v p65 in p53 rasklapanje podobni ustreznim scrambles (sl. 2C). Ti rezultati lahko kažejo robustnost odziva strojev celični stres, ki ohranja porazdelitev celičnega ciklusa kljub rasklapanje za p65 in p53.

TP53 Codon72 Pro Variant Razstave Low 5-FU občutljivosti in visoko NF-κB Ravni

Gene razgradljiv eksperimentalni rezultati so pokazali, da bi lahko interakcija med NF-κB in p53 proteinov pomembna v kontekstu zdravljenja 5-FU. Naj preuči možnost, da je TP53
codon72 varianta lahko vplivajo na celični odziv na zdravljenje, 5-FU, smo zaporedje TP53
codon72 kot tudi mutacije v DNA vezavna domena kodirnih regij (tj eksoni 5-8) 9 želodca raka celičnih linijah (tabela 2). Status variacije codon72 in TP53
mutacij niso pokazali jasne asociacije.

Naslednja raziskovali povezavo med občutljivostjo 5-FU in TP53
stanja (Sl. 3A ) kot tudi endogeni raven NF-κB in p53 (sl. 3B). GSS, GCIY in MKN45 linije, ki imajo Pro homozigoti varianto, razstavljena nizko občutljivost za 5-FU, medtem ko KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 in IWT1 linij, ki imajo alel Arg razstavljen relativno visoka občutljivost. Kato-III, ki ima velik TP53
izbris [25], je bil najbolj občutljiv na 5-FU. Ravni NF-κB beljakovin so predvsem povezana s 5-FU občutljivosti ( r
= 0,68; p
= 0,04;. slika 3C); Vendar pa ni bilo jasne povezave med ravnmi P53 in občutljivosti 5-FU ( r
= -0,04; p
= 0,95;. slika 3D). Ti rezultati kažejo, da je Pro homozigotnosti povezane z rezistenco 5-FU, medtem ko niti p53 mutacija niti endogeni ravni p53 neposredno vpliva na občutljivost 5-FU.

Pogovor

smo predhodno ugotovljenih NF-κB kot potencialni napovedni označevalec chemosensitivity ki temelji na 5-FU post-operative za napredovalim rakom želodca [9]. NF-κB je inducibilni transkripcijski faktor sestavljena iz p65 (Rela), c-Rel, Rel-B, P50 /NF-κB1 in P52 /NF-κB2 [26], in ima osrednjo vlogo v imunskem odzivu in vnetnih citokinov ureditev [27] - [29]. Chang et al prej dokazati, da NF-κB povzroča navzgor ali navzdol ureditev različno izraženih genov v 5-FU induciranih črevesnih vnetje sluznice, ki ga indukcijo vnetnih citokinov, kot so IL-6, TNF-a in IL-1β [10]. Ta 5-FU induciranih vnetnih so se štejejo za del procesa stresa izogibanje, ki lahko privedejo do desenzibilizacijo učinkovitosti 5-FU v želodčni sluznici [30]. Čeprav je bilo predlagano, da se aktiviranje NF-κB ni neposredno povezana z razvojem tumorja in napredovanja [31], je bil NF-κB šteje za velik biomarker in terapevtski cilj [32]. Neposredni dokazi zmanjšane chemoresistance 5-FU s siRNA za Rela
skupaj z visoko diskriminatorno moči NF-κB jedrske obarvanje v terapevtskih izidov kirurško odstranili tkiv nas morali opraviti dodatna potrditev NF-κB iz biološki vidik.

Naši transkripcijske profiliranje Rezultati so pokazali, da so na nižji stopnji geni nekaj p53 up-urejeno v odgovor na 5-FU, v kateri transaktivacije od NF-κB tudi zgodila. Ti dve glavni transkripcijski faktorji so bili prej pokazali, da se sočasno regulira odziv na genotoksične snovi [33] - [35] in TNF-α [36], [37]. Poleg tega je bilo predlagano, da bo sočasno aktivacijo p53 in NF-κB v tumorjih, zdravljenih z genotoksične snovi lahko privede do neuspeha terapije zaradi NF-κB posredovano preživetje signalizacija [38].

Individualni rasklapanje za ti transkripcijski faktorji razkrila gene, v smeri toka p53 so vplivale p65 rasklapanje, medtem ko je učinek omejen s p53 rasklapanje. Prejšnja poročila so predlagali odnosov sodelovanja med p53 in NF-κB v okviru avtofagija, apoptoze, in aktiviranje S-faza checkpoint [34], [39] - [41]. Naši rezultati tudi pokazali, da lahko NF-κB nadomestilo za transkripcijske aktivnosti p53 ko je nedotaknjena funkcija izgubil odziv na zdravljenje 5-FU. V bistvu, večina želodca raka nosi mutacije v zavezujočem p53 DNA domeni, zaradi česar je transkripcijsko neaktivno [42]. Nedavna študija, ki jo Frank et al
. poročala, da codon72 polimorfizem v TP53
bistveno vpliva na zmožnost p53 za sodelovanje z NF-κB za gensko transaktivacije, zlasti na indukcijo apoptoze preko kaspaze 4/11 [40]. Skupaj s to ugotovitvijo, da nekateri transkripcijski dejavnost p53 zahtevajo NF-κB v odziv na 5-FU, p53 kodon 72 polimorfizem za svoje NF-κB vezave lahko bolj vpliven kot mutacijsko statusa TP53
ali beljakovin izražanja status p53

vpliv codon72 polimorfizma na spontanih tveganje za nastanek raka je že raziskana, vendar ni dokončno ustanovljena zaradi omejenih modelih človeške populacije in živali [40], [43] -. [45]. Vendar pa lahko codon72 polimorfizem igrajo pomembno vlogo pri ohranjanju uveljavljenih rakave celice kot sproži celično maligne transformacije. V bistvu, so prejšnje študije so poročali, da je Pro /Pro alel povezane z rezistenco na kemoterapijo in slabo prognozo v ustni votlini [46] ter debelega črevesa [47], dojke, [48] in želodca [49] raka in nevroblastomi [ ,,,0],43]. Niz in vitro
študij podpira tudi to hipotezo, ki kažejo, da je alel Arg močnejši apoptoze induktor kot Pro alel [40], [50] [51]. Apoptoza je eden izmed glavnih mehanizmov za 5-FU induciranih in zato je smiselno hipotezo, da je učinkovitost kemoterapije osnovi 5-FU, povezane s specifičnimi P53 polimorfizmov [49]. Naša in vitro
ugotovitve podpirajo te epidemioloških in eksperimentalnih podatkov in kažejo na možno mehanizem za 5-FU posredovano interakcijo p53-NF-κB na p53-codon72 vezivnega mesta.

V skladu s pričakovanji naša raziskava je pokazala, da so bile celične linije z Pro alel bolj odporne na 5-FU kot tista z alel Arg. Profil zaviranje rasti 9 želodca raka celičnih linij so pokazali dobro povezavo do ravni NF-κB beljakovin. Ti rezultati kažejo, da ima Arg /Arg genotip večjo indukcijo apoptoze, kot Pro /Pro genotipa v prisotnosti 5-FU. Med celičnih linijah (vse izvira iz japonskih bolnikih z rakom želodca), razmerje med Arg /Arg: Arg /Pro: Pro /Pro je bil 4:01:03, medtem ko se je pri zdravih japonskih bolnikih je 4.5:4.4:1 [52] . To lahko odraža v izbirni postopek, ki se pojavi med razvojem tumorja in vzpostavitev kot celične linije. Prejšnja meta-analize v tveganje za nastanek raka in-P53 codon72 polimorfizmov kažejo, da ima Pro /Pro genotip večje tveganje za nastanek raka (nižji za genotip Arg /Arg) v azijskih populacijah [45], [53]. Vendar pa je pomen "tveganje za nastanek raka" za malignosti raka ali odziv na zdravljenje je treba pojasniti, ker je na splošno težko izvesti klinično študijo genetskih polimorfizmov prevladujejo in oceniti prave genetske učinke zdravljenja. Do danes je večina poročil, ki opisujejo pridružitvi med p53 codon72 polimorfizma in kemoterapevtiki odgovorov je pokazala, da ima Arg /Arg genotip ugoden odziv v različnih rakov, zdravljenih z običajnimi genotoksičnih drogami [49] [54] [55] . Predlagamo domnevnega mehanizem za odzivanje na 5-FU preko NF-κB in proteina p53 vezavo povezana s p53 polimorfizma, in tako lahko kombinacijska diagnoza NF-κB beljakovin izražanja in codon72 koristen kazalec za pooperativne adjuvantno kemoterapijo. Poleg nekaj obsežnih podatkovnih bazah [52], [56], obseg demografskih in etničnih distribucij na polimorfizma ostaja nejasna. Kopičijo podatke o etničnih razlik za polimorfizma lahko pojasni razlike v tveganju za raka ali kemoterapevtskim stopnjo odziva v populaciji bolnikov.

Na kratko, naše ugotovitve kažejo, da NF-κB ureja p53 transkripcijske aktivnosti kot odziv na 5-FU, ki je lahko povezano z polimorfne strani p53 pri codon72. Nadaljnje klinične in epidemiološke študije oceniti uporabnost sočasno patološkega /genetsko vrednotenje NF-κB /p53-codon72 v kirurško odstranjene želodčnih osebkov z rakom, da bi napovedali učinkovitost pooperativne ki temelji na 5-FU adjuvantno kemoterapijo.

Podpora Informacije
Tabela S1.
Primer Zaporedja
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090155.s001
(DOCX)

• Plos ONE: Sprememba telesne mase in makrofagne inhibirajočega citokinov-1 med kemoterapijo v naprednem želodca raku:? Kakšna je njihova Klinični pomen
• Plos ONE: Interakcija Učinki pri-let-7a-1 rs10739971 z PGC in ERCC6 genski polimorfizmi želodčnega raka in atrofični gastritis