Plos ONE: Gene Expression Podpis Analiza opredeljuje vorinostat kot kandidatka terapijo za Rak želodca

Povzetek

Ozadje

rak želodca še vedno ena od najbolj smrtonosnih rakavih obolenj na svetu, zato identifikacija novih zdravil, ki ciljajo na to vrsto raka je zato bistvenega pomena. Namen te raziskave je bil ugotoviti in potrditi terapevtsko sredstvo, ki bi lahko izboljšali rezultate za bolnike z rakom želodca v prihodnosti.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Uporaba mikromrež smo ustvarili gen izraz profil človeške želodčne rakavih specifičnih genov iz želodca vzorcev raka pri ljudeh tkiv. Uporabili smo ta profil v analizi širšem inštituta Povezave Zemljevid opredeliti kandidatke terapevtske spojine za raka želodca. Našli smo zaviralca vorinostat na histon kot vodilnega spojine in s tem potencialnega terapevtskega zdravilo za raka želodca. Vorinostat povzroča tako apoptozo in avtofagija v želodcu raka celičnih linijah. Farmakoloških in genetska zaviranje avtofagija pa povečala terapevtske učinkovitosti vorinostat, kar pomeni, da lahko terapevtsko kombinacija vorinostat z zaviralci avtofagija bolj koristno. Poleg tega je izražanje genov analiza raka želodca opredeljena zbirko genov ( ITGB5, TYMS, myb, APOC1, CBX5, PLA2G2A
in KIF20A
), katerih izraz je bil povzdignjen v želodcu tumorskem tkivu in navzdol reguliranih več kot 2-krat z obdelavo vorinostat v želodcu raka celičnih linijah. V nasprotju s tem, SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1
in NQO1
izkazali obrnil vzorec.

Sklepi /Pomen

Ugotovili smo, da je analiza izražanje genov podpis lahko predstavljajo nastajajočo pristop za raziskovanje terapevtskih sredstev za rakom želodca, kot vorinostat. Opazovanje spremenjene genske ekspresije po obdelavi vorinostat lahko zagotovi pojma za identifikacijo molekularni mehanizem vorinostat in tiste bolnike, ki bi lahko imeli koristi od zdravljenja vorinostat

Navedba sklicevanja. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Park YY, Kim K Kim SB, et al. (2011) Gene Expression Podpis Analiza Prepozna Vorinostat kot kandidatka terapijo za želodca raka. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10,1371 /journal.pone.0024662

Urednik: David L. McCormick, IIT Research Institute, Združene države Amerike

Prejeto: 29 marec 2011; Sprejeto: 16. avgust 2011; Objavljeno: 9. september 2011

Copyright: © 2011 Claerhout et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

financiranja:. Financiranje na SC kot Odyssey sodelavka je podprl program Odyssey in Theodore N. zakona ustanove za znanstvene dosežke na Univerzi v Teksasu MD Anderson Cancer Center. To delo je bilo podprto tudi s sredstvi iz Internal Medicine Raziskovalnega sklada in temeljne znanosti raziskovalnega programa 2009 Akademskega preko državnega Research Foundation Koreje s strani Ministrstva za šolstvo, znanost in tehnologijo (št 2010-0024248), ki jih financira. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [1], s splošnim preživetjem približno 10 mesecev [2] - [4]. Zdravljenje raka želodca lahko vključuje kemoterapijo, operacijo in radioterapijo. Na žalost, sedanje zdravljenja, ki temelji na kemoterapijo za napredovalega raka želodca dokažejo pričakovanji rezultati [2] - [4]. Dejansko je popolna odpustov so redki ali pa samo traja zelo kmalu.

nekaj ciljnih sredstev, ki zagotavljajo preživetja prednosti pri drugih vrstah raka je bilo v preiskavi raka želodca. Medtem ko so nekateri zgodnji klinične študije z vaskularni endotelijski rastni faktor receptor (VEGFR) in epitelne receptorja rastnega faktorja (EGFR) -1 inhibitorji, kot so cetuksimab in bevacizumab, so pokazale nekoliko aktivnost, je le redko dejansko koristi preživetja bolnikov [5] [6]. Eden izmed razlogov je lahko, da te študije niso izbrali bolnikov glede na prisotnost biomarkerjev. Pred kratkim je trastuzumab za Rak želodca (toga) sojenju ugotovil, da dodatek trastuzumaba na kemoterapijo privedlo do statistično pomembno izboljšanje preživetja brez napredovanja bolezni (PFS) in celokupno preživetje (OS) za približno 20% bolnikov z razširjajo želodca in gastroezofagealno (GE) junction tumorji prekomerno ekspresijo HER2 [7]. To poudarja potrebo po ciljno biološko terapijo in iskanje biomarkerjev za izbiro bolnikov za klinične poskuse, ki so upravičeni preživetje. Kljub nekaj dokazov o možnih ciljev, vključno s HER2 [8], [9], je učinkovitost teh biološko usmerjenih terapij ni znana in da je premalo standardno ciljno terapijo za raka želodca za. Zaradi biološko heterogenost želodca raka, je malo verjetno, da gre za enoten "čarobna palica" zdraviti. Molekularni markerji bodo tako v prihodnosti pomembna napovedati rezultate pacientov in krojenje zdravljenja po posameznih biologije.

V iskanju biomarkerjev, analiza izražanja genov podpis je bil uporabljen v različnih aplikacijah, kot so za pojasnjevanje mehanizmi bioloških poti [10], ki razvršča podtipe bolezni [11], napovedujejo raka prognozo [12] in profiliranje genske ekspresije v odziv na specifične droge [13], [14]. Genska analiza izraz podpis je mogoče storiti s pomočjo širših Inštituta Povezovanje Map (http://www.broadinstitute.org/cmap). Povezljivost Map želi ustvariti zemljevid, ki povezuje izražanje genov vzorce, povezane z boleznijo na ustreznih vzorcih se pridobiva s kandidati za zdravila in genetskih manipulacij [15], [16]. Ta pristop sistemi omogoča spojine, ki jih je treba pregledati glede podpisov bolezni genoma na ravni, namesto vnaprej določenem niz ciljnih genov. Droge so seznanjene z boleznimi, ki uporabljajo prefinjene metode vzorec-ujemanje z visoko stopnjo ločljivosti in specifičnosti. Čeprav pušča številna odprta vprašanja, je Povezljivost Map dokazala, da genomsko analizo podpis lahko uporablja za prepoznavanje droge s skupnimi mehanizmi ukrepov, odkrivanje neznane mehanizme delovanja in prepoznavanje potencialnih novih Therapeutics [15], [16].

namen te raziskave je bil ugotoviti morebitne nove terapije za zdravljenje raka želodca. Da bi to naredili, smo najprej analizirali genomske podpis raka človeškega želodca. Nastala želodca gen raka podpis je bil nato uporabljen silico
z uporabo analize Povezovanje Zemljevid ugotoviti terapevtskih sredstev, ki bi lahko bile učinkovite proti tej vrsti raka. Nadaljevali smo potrdil vrh ciljanje zdravilo za njeno učinkovitost v želodcu raka celičnih linijah. Ugotovili smo, da vorinostat, kot potencialni novi drog, inducirane tako apoptoza in avtofagija v želodcu rakavih celic. Skupaj je ta študija kaže, da se analiza Povezave Map lahko uporablja za identifikacijo terapevtskih sredstev, ki bi lahko bili uspešni pri zdravljenju podskupini želodčnega raka.

metod

Analiza podatkov mikromrež

za analizo Povezovanje Map smo uporabili podatke mikromrež 65 bolnikov z rakom želodca, vključno z 65 vrstami raka in 19 običajnih želodčnega tkiva, ki so bile pridobljene iz našega dosedanjega dela, podatke Yonsei [17]. Tumor vzorci so bili zbrani pri bolnikih želodca z rakom, ki želodca kot primarno zdravljenje. Vzorce tkiva smo pregledali patologi ob zbiranju in shranjena v -80 ° C v banki tkiva do začetka poskusa. Celotno RNA je bila vzeta iz sveže zmrznjena tkiva s pomočjo mirVana RNA označevanja izolacija kit (Ambion, Inc.). Primarni podatki mikromrež je na voljo v NCBI je Gene Expression Omnibus javne baze podatkov (mikromrež platforme, GPL6884; mikromrež podatkov, GSE 13861). Druga izražanje genov profil je bil pridobljen iz 69 želodca vzorcev tkiv, vključno z 38 rakom in 31 ne strome raka, Database Stanford mikromrež (http://smd.stanford.edu, GSE13911), podatke Stanford. Želodčni rak specifični geni so bili izbrani s BRB-ArrayTools različico 3.6.1 (biometričnih raziskovalni center, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Razred primerjava uporabo dva vzorca t-test (pomen < 0.001, 10.000 naključno permutacijske) označene želodčnih raka posebne gene in gene, katerih pomeni izraz intenzivnosti spremenila vsaj dva-krat v primerjavi z letom pomeni normalno genov tkivo izražanje bili izbrani
.

Povezovanje Map analiza

Za ugotavljanje morebitnih zdravil, ki ciljajo raka želodca, sezname gena top 500 do reguliranega in top 500 navzdol reguliranih genov iz želodca raka specifičnih genov, ki so bili uporabljeni (tabela S1). Analiza je povezljivost Karta je bila izvedena prek spletnega vmesnika (http://www.broadinstitute.org/cmap) z različico, zgraditi 02, ki vsebuje več kot 7.000 izraz profili, ki predstavljajo učinke 1.309 spojin na več gojenih človeških celic [15], [16]. Povezljivost zemljevid prikazuje funkcionalne povezave med droge, genov in bolezni. Zdravila, ki proizvajajo, ki posnemajo bolezni genskih podpisov lahko pomaga prepoznati poti, ki predstavljajo potencialne terapevtske cilje za te bolezni. Nasprotno pa lahko zdravila, ki povzročajo "obratne" podpis, tj spremembe pri izražanju genov v smeri, ki je nasprotna opazili v bolezenskega stanja, predstavljajo novih terapevtskih agentov. Kandidatke sredstva zoper določene bolezni lahko prepoznamo z uporabo bolezni posebno izražanje genov profil analizo Povezovanje Map. Izbrali smo droge kandidatke za potrditev in vitro
na podlagi rezultata povezljivost, korelacijo in P-vrednosti.

Kemija in celične kulture

Vorinostat je bila pridobljena iz Merck in ga pripravimo kot raztopine v dimetilsulfoksida (DMSO). Klorokin in bafilomycin A1 (Sigma) smo raztopili v zaporedju vodo in DMSO. Človeški želodca rakave celične linije AGS, NCI-N87, in KATO-III so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection in so bile ohranjene v skladu z njihovimi priporočili. Celice smo kultivirali v RPMI 1640, dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma, 100 U penicilina in 100 ug /ml streptomicina pri 37 ° C v 5% CO _2.

rast celic, preživetja in celičnega cikla testi

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetracolij bromid (MTT) testa smo MTT raztopili v PBS pri 5 mg /ml. Okoli 5 x 10 ^{3 Celice smo zasejali v 96 vdolbinami in pustimo, da se veže preko noči. Medij kulture smo nato nadomestili z svežega medija, ki vsebuje navedene koncentracije vorinostat ali DMSO. Po 72 urah dodamo 20 ul raztopine MTT in plošče inkubiramo pri 37 ° C 4 ure. Po inkubaciji smo dodali 100 ul DMSO, da se raztopi formazana in absorbance smo prebrali pri 570 nm s spektrofotometričnim čitalnikom mikroplošči (Vmax kinetično bralec mikroplošči, Molecular Devices). Poskuse smo izvedli v treh izvodih.}

Za kristalno vijolično obarvanje smo celice obdelamo 12 h, smo odstranili medij in celice speremo s PBS in nato inkubirali 30 minut s 0,5% kristal vijoličnim (v 20% metanola in 80% dvakrat destilirana voda). Celice smo nato sprali trikrat s PBS. Preostali kristal vijolično ekstrahiramo v ocetni kislini 5 min in Absorbanco smo merili pri 595 nm ob uporabi spektrofotometričnim mikroploščnem čitalniku.

Za določitev preživetja celic, smo celice inkubirali z vorinostat 72 ur. Adherentne celice smo nato loči od kulture plošč z trypsinization in združimo s spremenljivo celicami, centrifugirali in suspendiramo v 500 ul s propidijevim jodidom (PI) -exclusive raztopino (ne celično membrano prodirajo) 15 minut pri 4 ° C. Obarvajo celice smo spremljali s citometrije pretoka (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

Za analizo celičnega cikla, smo celice inkubirali z vorinostat 24 ur, zbrali in suspendiramo v 500 ul v hipotonični raztopini (0,1% natrijev citrat, 0,1% Triton X-100, 100 ug /ml RNaze in 50 ug /ml PI) za 15 minut pri 4 ° C. -PI obarvajo celice so spremljala citometrije toka. Celični ciklus smo analizirali s multicycle AV opreme.

RNA izolacije in mikromrež poskusi

RNA izolacija in mikromrež eksperimenti so bili izvedeni v skladu s protokolom, kot smo že prej opisali [17]. Total RNA je bila vzeta iz želodca linij rakavih celic z ali brez zdravljenja vorinostat uporabo mirVana izolacije RNA kit (Ambion, TX, ZDA). Celovitost velikega RNA frakcije smo določili z Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, ZDA) kot nadomestilo za mRNA nadzor kakovosti. Total RNA je bila označena in hibridizirali s človeško HT12 v.3 izražanja BeadChips v skladu s protokolom proizvajalca (Illumina, CA, ZDA). Potem ko so bili BeadChips skenirane z Illumina tehnologije BeadArray Reader, so bili podatki mikromrež normalizirala z metodo kvantil normalizacije v linearni modeli za paket Mikromrežni podatkov v R jezikovnem okolju [18]. Raven izražanja vsakega gena je preoblikoval v dnevnik _{2 bazo pred nadaljnjo analizo. Analiza grozda je bila opravljena z grozdom in drevesni [19].}

Western blot analiza

Celice so strgati v srednje in zavrtel dol, beljakovine pa so bile izolirane z uporabo liznega pufra (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA in 10 mM natrijev pirofosfat (pH 7,4)), ki vsebuje 100 mM NaF, 10% glicerol, 1,5 mM MgCl _{2, 1% Triton X-100 in inhibitor proteaze (Roche). Ekstrakte inkubiramo na ledu 20 minut in se vrti navzdol pri 20800 g 20 min. Koncentracija proteina smo določili s pomočjo BCA protein preizkusni reagent (Pierce). Enaka količina beljakovin iz vsakega vzorca smo ločili z elektroforezo skozi SDS-PAGE in prenesli na Haybond-C Super membrane (Amersham Pharmacia Biotech). Membrane smo blokirali 1 h pri sobni temperaturi v Tris-pufrom, ki vsebuje 0,1% Tween-20 in 5% nemastno mleko v prahu. Membrane smo inkubirali preko noči pri 4 ° C, s primarnim protitelesom razredčenega v 5% nemastno mleko v prahu ali 5% BSA v 1 x Tris-pufrom plus 0,1% Tween-20. smo uporabili protitelesa proti LC3 (Novus Biologicals), aktivne kaspaze-3 (Epitomics) in p62 (BD Biosciences). Protitelesa v alfa-tubulinu in beclin-1 so bili iz signalizacijo med celicami tehnologijo; protitelesa proti beta-aktin je Sigme. Membrane smo potem sprali in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi s peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa (Cell Technology signalnega). Beljakovinski trakovi smo prikazali s pomočjo okrepljenega kemiluminscenco po podatkih proizvajalca (GE Healthcare).}

siRNA transfekciji

siRNA ciljno zaporedje beclin-1, nontargeting siRNA (RISC Free) in Dharmafect 1 so opisani kupili od Dharmacon. Celice smo zasejali v 10-cm jedi in transfekciji s siRNA 24 ur kasneje po protokolu proizvajalca. Naslednji dan smo celice tripsinizirali in zasejali v 6-cm ali 96-vdolbinami, da dobimo enako učinkovitost transfekcije. Ravni Protein izraz bili določeni s strani zahodni blot analizo.

Menjalnik elektronska mikroskopija

Vzorci so bile določene z raztopino, ki vsebuje 3% gluteraldehyde plus 2% paraformaldehida v 0,1 M kakodilatu pufru, pH 7,3, za 1 uro. Po posnetka, so bili vzorci izperemo in obdelamo z 0,1% Millipore-filtriramo kakodilatu buffered taninske kisline, postfixed z 1% zastalega osmijevim tetroksidom 30 minut, in obarvali v enem kosu z 1% Millipore-filtriramo uranil acetat. Vzorci so bili dehidrirani pri povečanju koncentracije etanola, infiltrirane in vgrajeni v LX-112 mediju. Vzorci so bili polimerizirani v 70 ° C peč za 2 dni. Tankih sekcije smo razrezali v Leica Ultracut mikrotom (Leica, Deerfield, IL), obarvane z uranil acetat in vodi citrat v Leica EM Stainer, pregledajo v JEM 1010 prenosnim elektronskim mikroskopom (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) pri pospeševalni napetosti 80 kV. Digitalne slike so bili pridobljeni s pomočjo AMT Imaging System (Advanced mikroskopija tehnike Corp, Danvers, MA).

Rezultati

Izražanje genov podpis raka želodca

Tabela 1 predstavlja značilnosti bolniki iz podatkov Yonsei [17]. Želodčni rak so se večinoma nahaja v distalnem želodcu in faze III /IV. Uporaba podatkov mikromrež genske ekspresije teh bolnikov, smo našli 3.360 tumor specifičnih genov, katerih pomeni izraz intenzivnosti spremenila vsaj dvakrat višja pomeni normalno genov tkivo izražanje ( P
< 0,001, sliki S1 ). Ta sklop 3.360 genov (tj želodčni rak specifične podpisov) je bila uporabljena za nadaljnjo silico
pregledu potencialnih terapevtskih zdravil za raka želodca.

Analiza Povezovanje Map identificira možne droge ciljajo raka želodca

Za ugotavljanje morebitnih zdravil, ciljanje raka na želodcu, je bila posebna podpis raka želodca uporablja kot vhodni poizvedbo v Povezave Zemljevid kot je opisano v poglavju "metodo". Smo posebej iskali spojin, ki so imeli podpis obratno korelaciji z želodčnega raka specifične podpisa in ugotovljenih več zdravil, ki so povzete v tabeli 2. Razvrstitev zastopnikov kandidatk je bila določena na podlagi inverzne vrednosti korelacije in p-vrednosti. Tabela 2 (stolpci 2-4) prikazuje najvišje uvrščeni spojine iz podatkov Yonsei. Analiza povezljivost Map je pokazala, da histon deacetilaze (HDAC) inhibitorji, vključno vorinostat in trichostatin A predstavljajo potencialne kandidate za ciljanje raka želodca. inhibitor LY294002 fosfatidil-3-kinaza je fenotiazinov trifluoperazina in toplotnega šoka zaviralec protein tanespimycin so bile tudi opredeliti kot ciljne kandidat sredstva za rakom želodca. Dalje, smo potrjeni naše ugotovitve s pomočjo neodvisnega nabor podatkov izražanje genov profila iz Stanford mikromrež podatkovna baza (tabela 2; Stanford podatkov; stolpci 5-7). Povezovanje analiza Map tega nabora podatkov je potrdila vorinostat kot najvišje uvrščeni kandidat. Skratka, analiza Povezovanje Map opredeljena vorinostat kot potencialno terapevtsko sredstvo za raka želodca.

Vorinostat kaže terapevtska učinkovitost in vitro
in raka želodca celične linije

Za oceno terapevtske učinkovitost vorinostat, smo ocenili rast, določenih želodčnih raka celičnih linijah (AGS, KATO-III, in NCI-N87) po 72 h zdravljenja vorinostat uporabo MTT testom. V primerjavi z nezdravljenimi celicami, vorinostat močno zaviral sposobnost preživetja celic na način, ki je odvisen od vseh želodčnih raka celičnih linij (slika 1A). Smo potrdili zmanjšanje viabilnosti celic za analizo celičnega cikla AGS in KATO-III rakavih celic. Pokazali smo, da je zdravljenje s vorinostat (5 uM) za 24 ur povzročil znatno povečanje sub-G1 sorazmerju z dne AGS celic v primerjavi s kontrolo (2,3 ± 0,07% v primerjavi z 39,2 ± 0,99%, v tem zaporedju; P
<0,01), kar kaže na indukcijo celične smrti (slika 1B). V nasprotju s tem sub-G1 delež vorinostat zdravijo celice KATO-III ni bil prizadet (slika 1B), medtem ko je delež G2 /M celic močno povečal (21,4 ± 1,91% v primerjavi z 29,3 ± 0,35%; P
= 0,044), okvirno za ustavitev celičnega cikla. Nadaljevali smo testirali viabilnost celic s pomočjo PI izključenosti. obravnavajo smo AGS in celice KATO-III s 5 LM vorinostat za 72 ur in jih oceniti citometrije pretoka (slika 1C). Količina mrtvih celic, ki imajo nizko naprej odbojev in visoko stransko odbojev je bilo v AGS celicah (12,4 ± 4,3% v primerjavi z 79,4 ± 5,7%) bistveno povečala, in tudi v celicah Kato-III, v primerjavi s kontrolnimi celicami (8,7 ± 0,6% v primerjavi z 46,8 ± 2,1%). Končno smo analizirali indukcijo apoptoze po obdelavi vorinostat v AGS in Kato-III želodčni rak celičnih linijah z uporabo imunoblot. Vorinostat povečano apoptozo, kot jo je ocenil kaspaze-3 cepitvi v AGS celicah in v manjši meri v celicah KATO-III (slika 1D).

Skratka, ti podatki kažejo, da ima vorinostat antiproliferativno vpliva na raka želodca celične linije, ki jih inducira apoptozo v AGS celic in G2 /M ustavitev celičnega cikla v celicah KATO-III.

Globalna analiza izražanje genov želodčnih linij AGS rakavih celic in KATO-III po zdravljenju vorinostat

za analizo vpliva vorinostat na globalno izražanju genov, so AGS in KATO-III raka želodca celice, zdravljenih s 5 iM vorinostat 48 ur in analizo mikromrež je bila opravljena. Nenadzorovano analiza skupek podatkov mikromrež po zdravljenju vorinostat je pokazala, da AGS in KATO-III celice gruči z enakim celično linijo, ne glede na zdravljenje vorinostat (Slika 2A). Ker je bila avtofagija poročali, da imajo pomembno vlogo pri učinkih, vorinostat povzroča v druge oblike raka [20], [21], smo izvedli nadzorovano analizo v zvezi z avtofagija genom (80 genov in 149 sond; Tabela S2). -Vorinostat zdravijo raka želodca celične linije so združeni (slika 2B), kar kaže, da indukcijo avtofagija je pomembna lastnost vorinostat v želodcu raka linijah.

Zaviranje avtofagija izboljša učinkovitost vorinostat v želodčnih rakave celice

Glede na to, da imajo avtofagija lahko vlogo tako preživetje rakavih celic in raka celične smrti po zdravljenju odvisnosti od drog [22], [23], smo nadalje ovrednotili prispevek tega procesa na učinek vorinostat na želodcu raka celičnih linijah. Smo funkcionalno ocenili proces z analizo imunoblot na avtofagija označevalne-mikrotubularne povezan protein 1 lahke verige 3 (LC3). Vorinostat obdelani celice KATO-III, in v manjši meri AGS celic, je pokazala jasno kopičenje hitreje selijo lipidirana oblike LC3 (LC3-II) (slika 3A). Kopičenje LC3-II je lahko posledica bodisi uravnavanjem autophagosome oblikovanja ali blokade autophagic degradacije LC3-II [24], [25]. Zato smo analizirali-vorinostat zdravijo celice za razgradnjo p62, marker autophagic toka [24], in smo opazili zmanjšanje ravni p62 beljakovin v vorinostat obdelanih celic v primerjavi s časom ujema neobdelane rakave celice (slika 3A). Poleg tega sočasnim zdravljenjem z vorinostat s bafilomycin A1 (BafA1) inhibitor autophagosome-lizosomska fuzija, dodatno poveča kopičenje LC3-II (slika 3B), ki je združljiva z vorinostat induciranje autophagic tok ne blokirajo razgradnih zmogljivost autophagolysomes. Elektronsko mikroskopijo (EM) je občutljiv, kvantitativni in dokončna metoda za odkrivanje avtofagija [24]. Skladni s podatki Western Blot, EM analiza je pokazala, da vorinostat izrazito povečana tvorba autophagosome v AGS celic (slika 4B in B ") v primerjavi s kontrolno celice (Slika 4A in A").

Da bi raziskali, ali kopičenja autophagosomes ščiti celice pred celični stres vorinostat povzročenega smo zaviral proces avtofagija pomočjo farmakološkega zaviralca klorokina in male interferenčne RNA (siRNA) proti beclin-1. Dodajanje klorokina do-vorinostat zdravljenih AGS in celic KATO-III povzročilo zmanjšanje odvisnosti od odmerka v uspešnosti poslovanja (slika 5A). Zmanjšanje sposobnosti preživetja je bila potrjena v celicah KATO-III, zdravljenih z beclin-1 siRNA (slika 5B). Skupaj, podatki kažejo, da lahko zaviranje-vorinostat povzroča avtofagija izboljšanje učinkovitosti zdravljenja vorinostat želodcu rakavih celic.

Vorinostat spreminja genski podpis v človeške želodčne rakavih celic

Za razumevanje učinkov vorinostat na izražanje genov v želodcu raka celičnih linijah, smo opravili analizo mikromrež za vorinostat obravnavajo AGS in KATO-III z rakom želodca celične linije (sl. 2). Naša analiza je pokazala pomembne genomske razlike med neobdelanih in vorinostat zdraviti želodčnih rakavih celic (AGS in KATO-III). Po vorinostat zdravljenja, je izraz 1014 genov povečala in izraz 760 genov se je zmanjšala v celične linije AGS. V celični liniji KATO-III, je bilo 164 genov in 191 geni so navzdol urejeno (dvakratno razliko; P
< 0,001). Vorinostat bistveno spremenila izražanje 140 genov v obeh AGS in celičnih linij KATO-III (vorinostat poseben gen podpisov). Geni, ki so bile najbolj spremenjene po zdravljenju vorinostat so bili opredeljeni kot SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK
(> 4-krat up -regulation) in MUC1, IFITM1, ANKRD37
(>. 4-krat navzdol predpis)

Naprej smo želeli ugotoviti biomarkerjev kandidate, ki lahko napovedujejo občutljivost vorinostat bolnikov človekovih želodca z rakom . Zato smo združili niz spremenjenih genov v vorinostat zdraviti želodca raka celičnih linijah (vorinostat poseben gen podpisa) in dveh človeških želodca podpisov raka, pridobljenih iz podatkov Yosei in Stanford uporabo Vennov analize diagram. Ugotovili smo, da so relativni ekspresijski nivoji 12 genov obrnjen z obdelavo vorinostat (slika 6). Od teh 12 genov, 7 geni zelo izražene v želodčnih tkivih raka so navzdol urejeno ( ITGB5
, TYMS
, myb
, APOC1
, CBX5
, PLA2G2A
, KIF20A
) in 5 nizko izražena geni so se regulirano po zdravljenju vorinostat ( SCGB2A1
, TCN1
, CFD
, APLP1
, NQO1
(tabela 3).

Pogovor

Naši rezultati kažejo, da je globalna človeška želodca gen raka podpis bi bilo koristno, da bi našli terapevtska sredstva, ki ne ciljajo na genomsko podpis raka želodca namesto ciljanja eno ali dve posebne gene. z Povezave Map, smo ugotovili, da so imeli inhibitorji HDAC, kot vorinostat in trichostatin A obratno korelirana gen podpis v primerjavi z rakom želodca določenem genskem podpisu in zato lahko svinčeve terapevtske kandidati za raka želodca. in vitro
ocena terapevtske učinkovitosti vorinostat je pokazala, da je to terapevtsko zdravilo zatreti rast različnih raka želodca celične linije. Poleg svojih antiproliferacijskimi učinkov, vorinostat molekul tudi avtofagija specifične gene. Zaviranje-vorinostat povzroča avtofagija povzročilo nadaljnje zmanjšanje sposobnosti preživetja. Poleg tega je v kombinaciji analiza linij želodca rakavih celic, zdravljenih z vorinostat in vzorcev bolnikov z rakom želodca je pokazala, da vorinostat spremenila raven izražanja niz dvanajstih raka želodca specifičnih genov.

Naše ugotovitve so pokazale, da HDAC zaviralci, vorinostat in trichostatin A, so top terapevtski kandidati za rakom želodca, ki se strinja s konceptom, ki je HDAC pretirano izražena v želodčnih tkivih raka [26]. inhibitorjev HDAC bilo dokazano, da poveča acetiliranje histones torej vplivajo na izražanje genov. Ti inhibitorji očitne proti raku učinkov, ki jih inducira notranje in zunanje apoptozo poti [27], [28], blokiranje tumorsko angiogenezo [29], in zavirajo znotrajcelične poti odzivanja na stres [30]. Ker imajo inhibitorji HDAC globalne učinke na izražanje genov, lahko vplivajo še unrevealed celičnih procesov [31], [32]. V kliničnih okoljih, inhibitorji HDAC so bili večinoma uporablja za hematoloških malignih bolezni, vendar klinična preskušanja v čvrstimi tumorji so v teku. Nedavna študija, ki podpirajo naše vitro
Ugotovitve so pokazale, terapevtsko učinkovitost inhibitorjev HDAC o človekovih želodca vzorcih raka s testom histoculture odzivni drog [33]. Vendar pa je še vedno, da je nerazodeta ali lahko posebne molekularne določene podskupine napovedati odziv ali odpor do zaviralcev HDAC. Poleg tega je uporaba potencialno uporabnih biomarkerjev je vedno več omejitev [34].

Povezljivost Map še vedno težko oceniti, dokler ne bomo ocenili, v kolikšni meri genomske podpisov pridobljeni iz in vitro
poskusi povzamemo kompleksnosti bolezni pri ljudeh. Čeprav Povezave Map vsebuje več kot 7000 profile izražanja predstavljajo 1.309 spojine, njen pristop še vedno ukvarja z nekaterimi omejitvami, kot so omejeno količino podatkov s celičnimi linijami (MCF7, PC3, itd) v in nepoznavanja microenvironmental vplivov iz človeškega telesa [16] . Poleg tega gena izraz profili, ki izhajajo iz obravnave gojenih človeških celic ni mogoče povezati z vivo
učinek proti raku, zaradi kompleksne narave raka. Poleg tega je vnos le omejeno količino genov dovoljeno, kar lahko pristranskost dobljenih rezultatov. Nadaljnje študije je treba obravnavati, ali se naši rezultati, pridobljeni s pomočjo CMAP analize lahko potrdimo v vivo
želodca modelu raka. Kljub tem omejitvam, analiza Povezovanje Map je potencialno uporabna metoda za nove funkcije za drog, vključno vorinostat, ki so že v uporabi v kliniki za druge namene.

In vitro
ocenjevanju terapevtska učinkovitost vorinostat na raka želodca celične linije, je pokazala, da je to terapevtsko zdravilo pokazala antiproliferativnega vpliva na fiziološke pomembnih odmerkih (5 um), združljivih z drugih publikacij: IC _{50 za AGS in KATO-III je bilo dokazano, da je oziroma 2,9 mikrometrov in 5,9 pM [ ,,,0],35]. Analiza celičnega cikla (slika 1B), sposobnosti preživetja celic in (slika 1C) apoptotske odzivi (slika 1D), je pokazala, da so učinki vorinostat kaže na razliko v različnih želodčnih raka celičnih linij, ki inducira apoptozo v AGS celic in G2 /M priporu v KATO -III celice, oz. Razlika v genskem /mutacijsko ozadju celičnih linij, lahko predstavljajo razliko.}

Mikromrežni genske analize izraz primerjamo-vorinostat obdelano in neobdelano želodca rakave celične linije je pokazala, da to zdravilo povzroča avtofagija, ki je v skladu s prejšnjim poročila v drugih rakavih celic linij [20], [21]. Ker sta indukcijo in zaviranje avtofagija lahko ima terapevtske koristi [22], [23], smo nadalje oceniti vlogo avtofagija pri želodčnih rakavih celic po zdravljenju vorinostat. Zaviranjem avtofagija uporabo znano zdravilo proti malariji, Klorokvin [21] in z uporabo siRNA proti beclin-1 je povzročilo zmanjšanje sposobnosti preživetja želodca linij rakavih celic v prisotnosti vorinostat, kar kaže avtofagija se aktivira kot zaščitni odziv preživetja bolnikov po zdravljenju vorinostat (slika 5). Tako združevanje proti raku, kot vorinostat in zaviralci avtofagija lahko zagotavlja terapevtsko prednost v boju proti raku želodca.

Za identifikacijo vorinostat povzroča gen podpis, smo ocenili izražanje genov profile za AGS in KATO-III celici proge po zdravljenju vorinostat. Izraz 1774 in 355 genov je obrnilo (> 2-krat, p < 0,001) v AGS in Kato-III celičnih linij, v tem zaporedju. To kaže, da je celična linija AGS bolj ranljivi kot KATO-III z zdravljenjem vorinostat glede genske ekspresije. Ta manifestacija lahko pojasni občutljivost AGS celic na vorinostat. Ugotovili smo, da vorinostat bistveno spremenila ekspresijo sklopa 140 genov v obeh AGS in celičnih linij Kato-III.

• Plos ONE: The prognostični pomen apoptoze povezani biološke označevalce v kitajskih Rak želodca bolnikov
• Plos ONE: Gene-Expression Podpisi lahko razlikujemo Rak želodca razredov in Stages