PLOS ONE: Gene Expression Analysis Signature Identifie vorinostat comme une thérapie du candidat pour le cancer gastrique

Résumé

Contexte

Le cancer gastrique continue d'être l'un des cancers les plus meurtriers dans le monde et donc l'identification de nouveaux médicaments ciblant ce type de cancer est donc d'une importance significative. Le but de cette étude était d'identifier et de valider un agent thérapeutique qui pourrait améliorer les résultats pour les patients atteints de cancer gastrique dans l'avenir.

Méthodologie /Principales constatations

En utilisant la technologie des puces à ADN, nous avons généré un gène profil d'expression des gènes spécifiques du cancer gastrique humain à partir d'échantillons de tissu du cancer gastrique humain. Nous avons utilisé ce profil dans l'analyse Carte de connectivité de l'Institut Broad pour identifier des composés thérapeutiques candidats pour le cancer gastrique. Nous avons trouvé l'histone déacétylase inhibiteur vorinostat comme composé de plomb et donc un médicament thérapeutique potentiel pour le cancer gastrique. Vorinostat a induit à la fois l'apoptose et autophagy dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Cependant, l'inhibition pharmacologique et génétique de autophagy augmente l'efficacité thérapeutique de vorinostat, ce qui indique que la combinaison de vorinostat avec des inhibiteurs de autophagie peut être plus avantageux sur le plan thérapeutique. Par ailleurs, l'analyse de l'expression des gènes du cancer gastrique identifié un ensemble de gènes ( ITGB5, TYMS, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A,
et KIF20A
) dont l'expression a été élevée dans le tissu tumoral gastrique et régulés à la baisse de plus de 2 fois par traitement vorinostat dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. En revanche, SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1,
et NQO1
manifeste un motif inversé.

Conclusions /Importance

Nous avons montré que l'analyse des gène signature d'expression peut représenter une approche émergente pour découvrir des agents thérapeutiques pour le cancer gastrique, tels que vorinostat. L'observation de l'expression du gène altéré après le traitement de vorinostat peut fournir la clé pour identifier le mécanisme moléculaire de vorinostat et les patients susceptibles de bénéficier d'un traitement de vorinostat

Citation:. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Parc YY, Kim K, SB Kim et al. Analyse (2011) Gene Expression Signature Identifie vorinostat comme une thérapie du candidat pour le cancer gastrique. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10.1371 /journal.pone.0024662

Editeur: David L. McCormick, IIT Research Institute, Etats-Unis d'Amérique

Reçu le 29 Mars 2011; Accepté le 16 Août 2011; Publié 9 Septembre, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Claerhout et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Le financement à SC comme Fellow Odyssey a été soutenu par le Programme d'Odyssey et la loi de dotation Theodore N. pour les réalisations scientifiques de l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center. Ce travail a également été soutenue par des fonds provenant du Fonds 2009 Médecine interne académique Programme de recherche et de recherche en sciences de base par le biais de la National Research Foundation de Corée financés par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (n ° 2.010 à 0.024.248). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès par cancer dans le monde [1], avec une survie globale de 10 mois [2] - [4]. Le traitement du cancer de l'estomac peut inclure la chimiothérapie, la chirurgie et la radiothérapie. Malheureusement, les traitements à base de chimiothérapie courants pour le cancer gastrique avancé démontrent des résultats décevants [2] - [4]. En effet, des rémissions complètes sont rares ou ne durent très peu de temps.

Plusieurs agents ciblés qui confèrent des avantages de survie dans d'autres types de cancer ont été mis en examen dans le cancer gastrique. Bien que certaines études cliniques précoces en utilisant le récepteur vasculaire du facteur de croissance endothélial (VEGFR) et des récepteurs du facteur de croissance épithélial (EGFR) -1 inhibiteurs, tels que le cétuximab et le bévacizumab, ont montré quelque activité, il y a rarement un avantage de survie réelle pour les patients [5] , [6]. Une des raisons peut-être que ces études ne sont pas sélectionner les patients en fonction de la présence de biomarqueurs. Récemment, le trastuzumab pour le cancer gastrique (TOGA) procès a fait remarquer que l'addition de trastuzumab à la chimiothérapie a entraîné une amélioration statistiquement significative de la survie sans progression (PFS) et la survie globale (OS) du% environ 20 des patients disséminée gastrique et gastroesophageal (GE) des tumeurs qui surexpriment HER2 de jonction [7]. Cela souligne la nécessité d'une thérapie biologique ciblée et la recherche de biomarqueurs pour sélectionner les patients pour les essais cliniques qui peuvent bénéficier de survie. En dépit des preuves de cibles potentielles, y compris HER2 [8], [9], l'efficacité de ces thérapies ciblées biologiquement ne sait pas et il y a un manque d'une thérapie ciblée standard pour le cancer gastrique. En raison de l'hétérogénéité biologique des cancers gastriques, il est peu probable qu'il y ait un seul curé de balle magique ». Les marqueurs moléculaires seront donc important à l'avenir de prévoir les résultats des patients et des traitements de couture selon la biologie individuelle.

Dans la recherche de biomarqueurs, l'analyse génétique de la signature d'expression a été utilisée dans diverses applications, telles que pour élucider la mécanismes de voies biologiques [10], la classification des sous-types d'une maladie [11], prédire le cancer pronostic [12] et de profilage d'expression génique en réponse à des médicaments spécifiques [13], [14]. Gene analyse de la signature d'expression peut être fait en utilisant la connectivité Carte du Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/cmap). La Carte de connectivité vise à générer une carte qui relie les profils d'expression des gènes associés à la maladie à des modèles correspondants produits par des médicaments candidats et les manipulations génétiques [15], [16]. Cette approche systémique permet des composés à cribler contre les signatures de la maladie du génome entier, plutôt que d'un ensemble présélectionné de gènes cibles. Les médicaments sont jumelés à des maladies en utilisant des méthodes sophistiquées d'appariement de formes avec un haut niveau de résolution et de spécificité. Bien qu'il laisse beaucoup de questions ouvertes, le Plan de connectivité a montré que l'analyse de la signature génomique peut être utilisé pour reconnaître les médicaments avec des mécanismes communs d'actions, découvrir des mécanismes inconnus d'action et d'identifier de nouveaux traitements potentiels [15], [16].

le but de cette étude était d'identifier de nouveaux agents thérapeutiques potentiels pour le traitement du cancer gastrique. Pour ce faire, nous avons d'abord analysé la signature génomique du cancer gastrique humain. La signature génétique du cancer gastrique résultant a ensuite été utilisé in silico
en utilisant l'analyse Carte de connectivité pour identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être efficaces contre ce type de cancer. Nous avons également validé le top ciblage médicament pour son efficacité dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Nous avons constaté que le vorinostat, en tant que potentiel nouveau médicament, induit à la fois l'apoptose et l'autophagie dans les cellules cancéreuses gastriques. Ensemble, cette étude démontre que l'analyse de connectivité carte peut être utilisée pour l'identification d'agents thérapeutiques qui peuvent être efficaces dans le traitement d'un sous-ensemble de cancers gastriques.

Analyse de

Méthodes de données de microréseaux

Pour l'analyse Carte de connectivité, nous avons utilisé les données des microréseaux de 65 patients atteints de cancer gastrique, dont 65 cancers et 19 tissus gastriques normaux, qui ont été obtenus à partir de nos travaux précédents, les données Yonsei [17]. des échantillons de tumeur ont été prélevés chez des patients atteints de cancer gastrique subissant une gastrectomie comme un traitement primaire. Des échantillons de tissus ont été examinés par des pathologistes au moment de la collecte et stockés dans -80 ° C à la banque de tissus jusqu'à ce que le début de l'expérience. L'ARN total a été extrait à partir des tissus congelés frais en utilisant un kit de marquage d'isolement MIRVANA ARN (Ambion, Inc.). les données de puces à ADN primaire est disponible dans Gene Expression Omnibus base de données publique (microarray plate-forme, GPL6884; les données de puces à ADN, GSE 13861) de NCBI. Un autre profil d'expression du gène a été obtenu à partir de 69 échantillons de tissus gastriques, y compris le cancer 38 et 31 non stroma du cancer, de la base de données Stanford microréseau (http://smd.stanford.edu, GSE13911), les données de Stanford. gènes spécifiques de cancer gastrique ont été sélectionnés par BRB-ArrayTools Version 3.6.1 (Direction de la recherche biométrique, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Comparaison de la classe en utilisant deux échantillons t-test (signification < 0,001, 10,000 permutation aléatoire) a identifié des gènes spécifiques de cancer gastrique et les gènes dont la moyenne expression intensités ont été modifiées par au moins deux fois par rapport à la moyenne expression normale du gène de tissu ont été sélectionnés
.

Carte de connectivité analyse

Pour identifier les médicaments potentiels ciblant le cancer gastrique, les listes de gènes de 500 top up réglementé et le top 500 gènes régulés vers le bas à partir des gènes spécifiques de cancer gastrique ont été utilisés (tableau S1). L'analyse Carte de connectivité a été réalisée grâce à l'interface Web (http://www.broadinstitute.org/cmap) en utilisant la version, la construction 02, qui contient plus de 7.000 profils d'expression représentant les effets de 1.309 composés sur plusieurs cellules humaines en culture [15], [16]. La carte Connectivité montre les connexions fonctionnelles entre les médicaments, les gènes et les maladies. Les médicaments qui produisent des signatures de gènes de maladies imitant peuvent aider à identifier les voies qui représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour cette maladie. A l'inverse, les médicaments qui induisent une signature «inverse», à savoir les changements dans l'expression génique dans une direction opposée à celle observée dans l'état de la maladie, peuvent représenter de nouveaux agents thérapeutiques. Les agents candidats contre une maladie spécifique peuvent être reconnus par l'application spécifique du profil d'expression génique de la maladie à l'analyse Carte de connectivité. Nous avons sélectionné des médicaments candidats pour la validation in vitro
sur la base du score de la connectivité, la corrélation et P-valeur.

Produits chimiques et de la culture cellulaire

vorinostat a été obtenu auprès de Merck et préparé comme une solution mère dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Chloroquine et bafilomycine A1 (Sigma) ont été dissous dans l'eau et respectivement DMSO. des lignées de cellules de cancer gastriques humaines AGS, NCI-N87 et KATO-III ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection et ont été maintenus en fonction de leurs recommandations. Les cellules ont été cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 U de pénicilline et 100 ug /ml de streptomycine à 37 ° C dans 5% de CO 2

La croissance cellulaire, la viabilité et le cycle cellulaire _{. dosages}

Pour la 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium bromure (MTT), le MTT a été dissous dans du PBS à 5 mg /ml. Environ 5 x 10 ^{3 cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et on les a laissées se fixer pendant une nuit. Le milieu de culture a ensuite été remplacé par du milieu frais contenant les concentrations de DMSO ou vorinostat indiquées. Au bout de 72 heures, 20 pl de solution de MTT a été ajouté et les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 4 h. Après incubation, 100 pi de DMSO a été ajouté pour dissoudre le formazan, et l'absorbance a été lue à 570 nm en utilisant un lecteur spectrophotométrique de microplaque (Vmax lecteur de microplaques cinétique, Molecular Devices). Les expériences ont été réalisées en triple.}

coloration au cristal violet, les cellules ont été traitées pendant 12 h, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées avec du PBS et ensuite incubées pendant 30 min avec 0,5% de cristal violet (en 20% de methanol et 80% d'eau bidistillée). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS. Le violet de cristal restante a été extraite dans de l'acide acétique pendant 5 minutes et l'absorbance a été mesurée à 595 nm en utilisant un lecteur de microplaques spectrophotométrique.

Pour déterminer la viabilité des cellules, les cellules ont été incubées avec vorinostat pendant 72 h. Les cellules adhérentes ont ensuite été détachées des plaques de culture par trypsinisation et combinées avec des cellules flottantes, centrifugées et mises en suspension dans 500 pi d'iodure de propidium (PI) en solution -exclusive (non pénétrants cellule à membrane) pendant 15 min à 4 ° C. Les cellules colorées ont été contrôlées par cytométrie en flux (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

Pour l'analyse du cycle cellulaire, les cellules ont été incubées avec vorinostat pendant 24 heures, recueillies et mises en suspension dans 500 ul d'une solution hypotonique (citrate de sodium à 0,1%, 0,1% de Triton X-100, 100 pg /ml de RNAse et 50 pg /PI ml) pendant 15 min à 4 ° C. cellules PI-colorées ont été suivis par cytométrie de flux. cycle cellulaire a été analysé par le logiciel Multicycle AV.
expériences

isolement d'ARN et microarray

l'isolement de l'ARN et des expériences de puces à ADN ont été effectuées selon le protocole tel que décrit précédemment [17]. L'ARN total a été extrait à partir de lignées cellulaires de cancer gastrique avec ou sans traitement de vorinostat en utilisant un kit d'isolement MIRVANA ARN (Ambion, TX, USA). L'intégrité de la grande fraction d'ARN a été déterminée avec un Bioanalyseur Experion (Bio-Rad, CA, USA) comme substitut pour le contrôle de la qualité de l'ARNm. L'ARN total a été marqué et hybride avec HT12 humaine BeadChips d'expression v.3 selon les protocoles du fabricant (Illumina, CA, USA). Après les BeadChips ont été numérisés avec un Illumina BeadArray Reader, les données de puces à ADN ont été normalisées en utilisant la méthode de normalisation quantile dans les modèles linéaires pour le paquet Microarray données dans l'environnement de langage R [18]. Le niveau de chaque gène d'expression a été transformé en un journal _{2 base avant une analyse plus approfondie. L'analyse typologique a été fait avec Cluster et Treeview [19].}

Analyse par Western blot

Les cellules ont été grattées dans un milieu et centrifugés, et les protéines ont été isolées en utilisant un tampon de lyse (HEPES 50 mM, 150 mM NaCl, 1 mM d'EGTA et 10 mM de pyrophosphate de sodium (pH 7,4)) contenant 100 mM de NaF, 10% de glycerol, 1,5 mM MgCl _{2, 1% de Triton X-100 et un inhibiteur de protéase (Roche). Les extraits ont été mises en incubation sur de la glace pendant 20 minutes et centrifugés à 20800 g pendant 20 min. La concentration en protéine a été déterminée en utilisant le réactif BCA Protein Assay (Pierce). Des quantités égales de protéine à partir de chaque échantillon ont été séparés par électrophorèse sur SDS-PAGE et transférés sur Hybond-C super membrane (Amersham Pharmacia Biotech). Membranes ont été bloquées pendant 1 h à température ambiante dans une solution saline tamponnée au Tris contenant du lait en poudre 0,1% de Tween-20 et 5% sans matières grasses. du sérum physiologique, plus 0,1% de Tween-20 membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps primaire dilué dans 5% de lait écrémé en poudre ou de 5% de BSA dans 1 x tampon Tris. Les anticorps anti-LC3 (Novus Biologicals), actif caspase-3 (Epitomics) et p62 (BD Biosciences) ont été utilisés. Les anticorps anti-alpha-tubuline et beclin-1 provenaient de cellules de la technologie de signalisation; anticorps dirigé contre la ß-actine était de Sigma. Membranes ont ensuite été lavées et incubées pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (Cell Signaling Technology). Les bandes de protéines ont été visualisées en utilisant une chimiluminescence amplifiée comme décrit par le fabricant (GE Healthcare).}

siRNA transfection

La séquence cible siRNA pour beclin-1, nontargeting siRNA (Risc gratuit) et Dharmafect 1 étaient acheté auprès de Dharmacon. Les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm et transfectés avec le siRNA 24 h plus tard, selon le protocole du fabricant. Le lendemain, les cellules sont trypsinisées et ensemencées dans des plaques de 6 cm ou de 96 puits pour obtenir la même efficacité de transfection. les niveaux d'expression de la protéine ont été déterminées par analyse par transfert de Western.

microscopie électronique en transmission

Les échantillons ont été fixées avec une solution contenant 3% de glutaraldéhyde plus 2% de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon cacodylate, pH 7,3, pendant 1 heure. Après fixation, les échantillons ont été lavés et traités avec 0,1% de cacodylate millipore filtré tampon acide tannique, post-fixes avec 1% de tétroxyde d'osmium tamponné pendant 30 min, et colorés en bloc avec 1% millipore filtré acétate d'uranyle. Les échantillons ont été déshydratés dans des concentrations d'éthanol de plus en plus infiltrée et noyées dans un milieu LX-112. Les échantillons ont été polymérisés dans un four à 70 ° C pendant 2 jours. Des coupes ultrafines ont été coupées dans un microtome Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb dans un stainer Leica EM, et examinés dans un microscope électronique JEM 1010 transmission (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) à une tension d'accélération de 80 kV. Les images numériques ont été obtenus en utilisant AMT Système d'imagerie (Techniques avancées Microscopie Corp, Danvers, MA).

signature d'expression génique de

Résultats du cancer gastrique

Le tableau 1 présente les caractéristiques de les patients à partir de données Yonsei [17]. cancers gastriques étaient principalement situées dans l'estomac distal et le stade III /IV. En utilisant les données de biopuces d'expression génique de ces patients, nous avons trouvé 3.360 gènes spécifiques de la tumeur dont la moyenne expression intensités ont été modifiées par au moins deux fois par rapport à signifier l'expression normale du gène de tissu ( P
< 0,001, Figure S1 ). Cet ensemble de 3.360 gènes (c.-à-signature spécifique du cancer gastrique) a été utilisé pour d'autres in silico
dépistage de médicaments thérapeutiques potentiels pour le cancer gastrique.

Analyse de connectivité de la carte identifie les médicaments potentiels ciblant le cancer gastrique

Pour identifier les médicaments potentiels ciblant le cancer gastrique, la signature spécifique du cancer gastrique a été utilisé comme entrée requête dans Carte de connectivité comme décrit dans la section «Méthode». Nous avons spécifiquement cherché des composés qui ont une signature en corrélation inverse avec la signature spécifique du cancer gastrique et identifié plusieurs médicaments qui sont résumées dans le tableau 2. Le classement des agents candidats a été établie sur la base de la valeur de corrélation inverse et p-valeur. Tableau 2 (colonnes 2-4) montre les composés les mieux classés à partir des données de Yonsei. l'analyse de connectivité de la carte a révélé que histone désacétylases (HDAC), y compris le vorinostat et la trichostatine A représentent des candidats potentiels pour le ciblage du cancer gastrique. L'inhibiteur LY294002 phosphatidylinositol-3-kinase, de la trifluopérazine phénothiazine et le choc thermique, un inhibiteur de protéine tanespimycin ont également été identifiés comme agents cibles candidates pour un cancer gastrique. Ensuite, nous avons validé nos résultats en utilisant un ensemble indépendant de données de profil d'expression génique de la base de données Stanford Microarray (tableau 2; Stanford données; colonnes 5-7). Connectivité analyse de la carte de cet ensemble de données confirme vorinostat comme le candidat le mieux classé. En conclusion, l'analyse Carte de connectivité identifié vorinostat comme agent thérapeutique potentiel pour le cancer gastrique.

vorinostat montre l'efficacité thérapeutique in vitro
dans le cancer gastrique lignées cellulaires

Pour évaluer la thérapeutique efficacité de vorinostat, nous avons évalué la croissance des lignées établies gastriques de cellules cancéreuses (AGS, KATO-III, et NCI-N87) après 72 h de traitement de vorinostat en utilisant un test MTT. Par rapport aux cellules non traitées, vorinostat a inhibé de façon significative la viabilité cellulaire d'une manière dépendante de la dose dans toutes les lignées gastriques de cellules cancéreuses (figure 1A). Nous avons confirmé la diminution de la viabilité cellulaire par analyse du cycle cellulaire des cellules cancéreuses AGS et KATO III. Nous avons montré que le traitement avec le vorinostat (5 uM) pendant 24 h induit une augmentation marquée de la proportion de sous-G1 de cellules AGS par rapport au témoin (2,3 ± 0,07% vs 39,2 ± 0,99%, respectivement; P
<0,01), ce qui indique l'induction de la mort cellulaire (figure 1B). En revanche, la proportion de sous-G1 de vorinostat cellules traitées KATO-III n'a pas été affectée (figure 1B), alors que la proportion de cellules en G2 /M a augmenté de manière significative (21,4 ± 1,91% vs 29,3 ± 0,35%; P
= 0,044), indicatif de l'arrêt du cycle cellulaire. Nous avons également testé la viabilité des cellules en utilisant PI-exclusion. Nous avons traité AGS et des cellules KATO III avec 5 uM vorinostat pendant 72 h et les évalué par cytométrie en flux (figure 1C). La quantité de cellules mortes, qui ont une faible diffusion vers l'avant et se dispersent côté haut, a été significativement augmentée dans les cellules AGS (12,4 ± 4,3% vs 79,4 ± 5,7%), et aussi dans les cellules KATO-III, par rapport aux cellules témoins (8,7 ± 0,6% par rapport à 46,8 ± 2,1%). Nous avons finalement analysé l'induction de l'apoptose après traitement vorinostat dans des lignées cellulaires de cancer gastrique AGS et KATO-III à l'aide immunoblot. Vorinostat a augmenté l'apoptose, évaluée par la caspase-3 clivage, dans les cellules AGS et dans une moindre mesure dans les cellules KATO-III (figure 1D).

En résumé, ces données indiquent que le vorinostat a un effet anti-prolifératif sur le cancer gastrique des lignées cellulaires en induisant l'apoptose dans les cellules AGS et G2 /M arrêt du cycle cellulaire dans les cellules KATO III.

analyse globale de l'expression du gène de l'estomac cellules cancéreuses lignes AGS et KATO-III après traitement vorinostat

pour analyser l'effet du vorinostat sur l'expression globale des gènes, des cellules de cancer gastrique AGS et KATO-III ont été traitées avec 5 uM vorinostat pendant 48 heures et l'analyse de puces à ADN a été réalisée. Unsupervised analyse typologique des données de biopuces après le traitement de vorinostat a montré que les cellules AGS et KATO-III regroupés avec la même lignée cellulaire quel que soit le traitement de vorinostat (Figure 2A). Parce que l'autophagie a été rapporté d'avoir un rôle dans les effets induits par vorinostat-dans d'autres cancers [20], [21], nous avons effectué une analyse supervisée de l'ensemble des gènes liés à l'autophagie (80 gènes et 149 sondes; Tableau S2). des lignées de cellules cancéreuses gastriques vorinostat traités ont été regroupés (figure 2B), ce qui indique que l'induction de l'autophagie est une propriété importante de vorinostat dans des lignées de cancer de l'estomac.

L'inhibition de l'autophagie améliore vorinostat efficacité dans les cellules cancéreuses gastriques

Etant donné que autophagy peut avoir un rôle dans la survie des cellules cancéreuses et le cancer de la mort cellulaire après un traitement médicamenteux [22], [23], nous avons évalué davantage la contribution de ce procédé à l'effet de vorinostat sur des lignées cellulaires de cancer gastrique. Nous avons évalué fonctionnellement ce processus par analyse d'immunotransfert du marqueur autophagy microtubule-associated protein 1 chaîne légère 3 (LC3). Vorinostat-cellules traitées KATO-III, et dans une moindre mesure les cellules AGS, a montré une nette accumulation de la forme lipidée migration plus rapide de LC3 (LC3-II) (figure 3A). L'accumulation de LC3-II peut résulter soit d'une régulation positive de la formation autophagosome ou le blocage de la dégradation autophagique de LC3-II [24], [25]. Nous avons donc analysé les cellules vorinostat traitées pour la dégradation de p62, un marqueur de flux autophagic [24], et nous avons observé une diminution des taux de protéine p62 dans les cellules vorinostat traitées par rapport au temps des cellules cancéreuses non traitées appariés (figure 3A). En outre, cotraitement de vorinostat avec bafilomycine A1 (BafA1), un inhibiteur de la fusion autophagosome-lysosome, a encore augmenté LC3-II accumulation (figure 3B), compatible avec le vorinostat induisant autophagique flux plutôt que de bloquer la capacité de dégradation de autophagolysomes. La microscopie électronique (EM) est une méthode sensible, quantitative et définitive pour la détection de l'autophagie [24]. Cohérentes avec les données de transfert Western, une analyse EM a montré que vorinostat augmenté de façon marquée la formation de autophagosome dans les cellules AGS (figure 4B et B ') par rapport aux cellules témoins (figure 4A et A').

Afin de déterminer si l'accumulation de autophagosomes protège les cellules contre le stress cellulaire provoquée par le vorinostat, nous inhibés le processus d'autophagie en utilisant la chloroquine pharmacologique inhibiteur et petits ARN interférents (siRNA) contre beclin-1. Addition de chloroquine AGS vorinostat traitées et les cellules KATO III a entraîné une diminution dose-dépendante de la viabilité (figure 5A). La réduction de la viabilité a été confirmée dans les cellules KATO III traités par beclin-1 siRNA (figure 5B). Ensemble, les données suggèrent que l'inhibition de l'autophagie induite vorinostat-peut améliorer l'efficacité du traitement de vorinostat des cellules de cancer gastrique.

vorinostat modifie la signature du gène dans les cellules cancéreuses gastriques humaines

Pour comprendre les effets de la vorinostat sur l'expression génique dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, on a effectué une analyse de puces à ADN de vorinostat traités AGS et KATO III lignées cellulaires de cancer de l'estomac (Fig. 2). Notre analyse a révélé des différences significatives entre les génomique des cellules cancéreuses gastriques non traitées et traitées vorinostat (AGS et KATO-III). Après traitement vorinostat, l'expression de gènes 1014 a été augmentée et l'expression de gènes 760 a été diminuée dans la lignée de cellules AGS. Dans la lignée cellulaire KATO-III, 164 gènes ont augmenté et 191 gènes ont été régulés à la baisse (différence de deux fois; P
< 0,001). Vorinostat altéré de manière significative l'expression de gènes dans les 140 AGS et des lignées cellulaires KATO-III (gène signature spécifique vorinostat). Les gènes qui ont été les plus modifiés après le traitement de vorinostat ont été identifiés comme SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK
(> 4 fois jusqu'à -Règlement) et MUC1, IFITM1, ANKRD37
(>. 4 fois la régulation)

ensuite, nous avons l'intention d'identifier des candidats de biomarqueurs qui peuvent prédire la sensibilité de vorinostat des patients atteints de cancer gastrique humains . Par conséquent, nous avons combiné l'ensemble des gènes modifiés dans l'estomac des lignées cellulaires de cancer de vorinostat traité (signature de gène spécifique de vorinostat) et les deux signatures de cancer gastrique humaines générées à partir des données Yosei et Stanford en utilisant Venn analyse du diagramme. Nous avons constaté que les niveaux d'expression relatifs des 12 gènes ont été inversés par traitement vorinostat (figure 6). Parmi ces 12 gènes, 7 gènes fortement exprimés dans les tissus de cancer gastrique ont été régulés à la baisse ( ITGB5
, TYMS
, MYB
, APOC1
, CBX5
, PLA2G2A
, KIF20A
) et 5 gènes faiblement exprimés étaient SCGB2A1
, TCN1 régulés à la hausse après le traitement de vorinostat (
, CFD
, APLP1
, NQO1
(tableau 3).

Discussion

Nos résultats indiquent qu'une signature globale du gène du cancer gastrique humain pourrait être utile de trouver des agents thérapeutiques qui plutôt ciblent la signature génomique du cancer gastrique au lieu de cibler un ou deux gènes spécifiques. Utilisation de la carte de connectivité, nous avons constaté que les inhibiteurs de HDAC, tels que le vorinostat et la trichostatine A, avaient une signature génétique en corrélation inverse comparée à la signature de gène spécifique du cancer de l'estomac et peut donc être des candidats thérapeutiques principaux pour le cancer gastrique. in vitro
évaluation de l'efficacité thérapeutique de vorinostat a révélé que ce médicament thérapeutique supprime la croissance d'un cancer gastrique différent des lignées cellulaires. A côté de ses effets anti-prolifératifs, vorinostat aussi upregulated gènes spécifiques autophagie. L'inhibition de l'autophagie induite vorinostat-a abouti à une réduction supplémentaire de la viabilité. En outre, l'analyse combinée des lignées cellulaires de cancer gastrique traités avec vorinostat et des échantillons de patients atteints de cancer gastrique a montré que le vorinostat a modifié les niveaux d'un ensemble de gènes spécifiques de douze de cancer gastrique d'expression.

Nos résultats ont montré que HDAC inhibiteurs, vorinostat et trichostatine A, étaient les candidats thérapeutiques haut pour le cancer gastrique, ce qui est d'accord avec le concept que HDAC est surexprimé dans les tissus de cancer gastrique [26]. On a montré que les inhibiteurs de HDAC à augmenter acétylation des histones, ce qui affecte l'expression génique. Ces inhibiteurs d'effets anticancéreux manifestes en induisant la voie de l'apoptose intrinsèque et extrinsèque [27], [28], bloquant l'angiogenèse tumorale [29], et inhibant les voies de réponse au stress intracellulaire [30]. Parce que les inhibiteurs d'HDAC ont des effets globaux sur l'expression des gènes, ils peuvent affecter les processus cellulaires encore non révélés [31], [32]. Dans les milieux cliniques, les inhibiteurs de HDAC ont été la plupart du temps appliqué aux hémopathies malignes, mais les essais cliniques dans les tumeurs solides sont en cours. Une étude récente, soutenant notre in vitro
conclusions a montré une efficacité thérapeutique des inhibiteurs de HDAC sur des échantillons de cancer gastrique humain en utilisant le dosage de la réponse aux médicaments de histoculture [33]. Cependant, il reste à savoir si unrevealed sous-groupes moléculaires spécifiques définis peuvent prédire la réponse ou la résistance aux inhibiteurs de HDAC. En outre, l'application de biomarqueurs potentiellement utiles a encore plusieurs limites [34].

La Carte de connectivité reste difficile à évaluer jusqu'à ce que nous puissions évaluer la mesure dans laquelle les signatures génomiques obtenues à partir de in vitro
expériences récapitulent les complexités de la maladie humaine. Bien que le Plan de connectivité contient plus de 7000 profils d'expression représentant 1.309 composés, son approche traite encore avec quelques limitations telles que la quantité limitée de données de lignées cellulaires (MCF7, PC3, etc.) et l'ignorance des influences microenvironnement du corps humain [16] . En outre, les profils d'expression génique provenant du traitement des cellules humaines cultivées pourraient ne pas être corrélées avec in vivo
effet anti-cancéreux, en raison de la nature complexe du cancer. En outre, l'entrée de seulement une quantité limitée de gènes est autorisée, ce qui peut fausser les résultats obtenus. Les études futures doivent être abordées si nos résultats obtenus par l'analyse cmap peuvent être confirmées dans un in vivo modèle de cancer gastrique. Malgré ces limites, l'analyse Carte de connectivité est une méthode potentiellement utile pour de nouvelles fonctions pour les médicaments, y compris vorinostat, déjà en usage dans une clinique à d'autres fins.

Évaluation in vitro
de l'efficacité thérapeutique du vorinostat sur le cancer gastrique lignées cellulaires ont révélé que ce médicament thérapeutique a montré un effet anti-prolifératif à des doses physiologiques pertinentes (5 pM) compatibles avec d'autres publications: IC a été montré _{50 pour AGS et KATO-III pour être respectivement de 2,9 uM et 5,9 uM [ ,,,0],35]. Analyse du cycle cellulaire (figure 1B), la viabilité cellulaire et (figure 1C) les réponses apoptotiques (figure 1D) ont indiqué que les effets de vorinostat montrent une différence dans différentes lignées cellulaires de cancer gastrique, ce qui induit l'apoptose dans les cellules AGS et G2 /M arrêté dans KATO cellules -III, respectivement. La différence de fond génétique /mutationnelle des lignées cellulaires peut expliquer la différence.}

gène microarray analyse de l'expression comparant vorinostat-traité et des lignées cellulaires de cancer gastrique non traitées ont indiqué que ce médicament induit l'autophagie, qui est en accord avec les précédents rapports dans d'autres lignées cellulaires du cancer [20], [21]. Comme l'induction et l'inhibition de l'autophagie peut avoir des avantages thérapeutiques [22], [23], nous avons évalué davantage le rôle de l'autophagie dans les cellules de cancer gastrique après le traitement de vorinostat. Inhiber autophagy en utilisant un antipaludéen bien connu, la chloroquine [21] et en utilisant le siRNA contre beclin-1 a entraîné une réduction de la viabilité des lignées cellulaires de cancer gastrique en présence de vorinostat, suggérant autophagy est activé en réponse protectrice de survie après traitement vorinostat (figure 5). combinant ainsi des agents anticancéreux tels que le vorinostat et les inhibiteurs de l'autophagie pourrait fournir un avantage thérapeutique dans la lutte contre le cancer de l'estomac.

Pour identifier une signature génétique de vorinostat induite, nous avons évalué les profils d'expression génique de l'AGS et KATO-III cellule lignes après le traitement de vorinostat. L'expression de 1774 et de 355 gènes a été inversée (> 2 fois, p < 0,001) dans des lignées cellulaires AGS et KATO-III, respectivement. Ceci suggère que la lignée de cellules AGS est plus vulnérable que KATO-III à un traitement vorinostat en ce qui concerne l'expression du gène. Cette manifestation peut expliquer la sensibilité des cellules AGS à vorinostat. Nous avons découvert que le vorinostat a changé de manière significative l'expression d'un ensemble de 140 gènes dans les deux AGS et des lignées de cellules KATO III.

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