PLoS ONE: Gene Expression Potpis analiza pokazala da Vorinostat kao kandidat terapija za želučani Cancer

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Rak želuca i dalje biti jedan od najsmrtonosnijih oblika raka u svijetu i stoga identifikacija novi lijekovi koji ciljaju ove vrste raka je stoga od velike važnosti. Svrha ovog istraživanja bio je utvrditi i provjeriti terapijsko sredstvo koje bi mogle poboljšati ishode kod pacijenata s rakom želuca u budućnosti. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

Korištenje microarray tehnologiju, generira se gen izraz profil humanog želučanog raka specifičnih gena iz uzorka ljudske želučane rak tkiva. Koristili smo ovaj profil u širem Instituta Povezivanje Karta analize za identifikaciju mogućih terapeutskih spojeva za rak želuca. Pronašli smo histona deacetilazni inhibitor vorinostat kao vodećeg spoja, a time i potencijalni terapeutski lijek za rak želuca. Vorinostat inducirane apoptoze i oba autophagy u želučanim staničnim linijama raka. Farmakološka i genetski inhibicije autophagy međutim, povećava terapijsku učinkovitost vorinostat, što ukazuje da je kombinacija s inhibitorima vorinostat autophagy može terapeutski biti koristan. Osim toga, ekspresija gena analiza raka želuca prepoznaje zbirka gena ( ITGB5, TYMS, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A, pregled i KIF20A pregled) čiji izraz je uzdignut u želučanom tkivu tumora i downregulated više od 2 puta po vorinostat liječenja u želučanom staničnim linijama raka. Za razliku od toga, SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1, pregled i Nqo1 pregled manifestira obrnuti obrazac. Pregled

Zaključci /Značaj pregled

Mi smo pokazali da se analiza ekspresije gena potpis može predstavljati pristup nastajanju otkriti terapijska sredstva za rak želuca, kao što je vorinostat. Promatranje promijenjenog gena nakon vorinostat liječenja može pružiti ključ za identifikaciju molekularni mehanizam vorinostat i one pacijente koje bi mogle imati koristi od vorinostat liječenja

Citation. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Park YY, Kim K, Kim SB, et al. (2011) Gene Expression Potpis analiza pokazala da Vorinostat kao kandidat terapija za rak želuca. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10,1371 /journal.pone.0024662 pregled

Urednik: David L. McCormick, IIT Research Institute, United States of America pregled

Primljeno: 29. ožujka 2011; Prihvaćeno: 16. kolovoz 2011; Objavljeno: 9. rujna 2011 pregled

Copyright: © 2011 Claerhout et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

sredstva:. Financiranje se SC kao Odyssey suradnik je podržan od strane Odyssey programom i zakonom zaklada Theodore N. za znanstvena dostignuća na Sveučilištu Texas MD Anderson Cancer Center. Ovaj rad je također podržan od strane sredstava iz Internal Medicine Academic Research Fund 2009. i Basic Science Research programa putem Nacionalnog Research Foundation Koreje financira Ministarstvo obrazovanja, znanosti i tehnologije (br 2010-0.024.248). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [1], s ukupnom preživljavanju oko 10 mjeseci [2] - [4]. Liječenje karcinoma želuca mogu uključivati ​​kemoterapije, operacije i zračenja. Na žalost, sadašnji kemoterapije temeljene tretmani za uznapredovali rak želuca pokazuju razočaravajući rezultati [2] - [4]. Doista, kompletna remisija su rijetki ili samo trajati jako kratko.

Nekoliko ciljane sredstva koja dovode do prednosti preživljavanja u druge vrste raka su pod istragom u raka želuca. A neki rani kliničkih studija koristeći vaskularnog endotela receptora čimbenika rasta (VEGFR) i epitela receptor faktora rasta (EGFR) -1 inhibitori, kao što su cetuksimab i bevacizumab, pokazali su donekle aktivnost je rijetko stvarna prećivlja za pacijente [5] [6]. Jedan od razloga može biti da su te studije nisu odabrali pacijente prema prisutnosti biomarkera. Nedavno je trastuzumab za rak želuca (toge) postupku napomenuti da dodatak trastuzumab na kemoterapiju dovela je do statistički značajnog poboljšanja preživljavanja bez progresije (PFS) i ukupno preživljenje (OS) u oko 20% bolesnika s diseminirani želuca i gastroezofagealna (GE) razvodne tumore s prekomjernom ekspresijom HER2 [7]. To naglašava potrebu za ciljane biološke terapije i potragu za biomarkera za odabir bolesnika za klinička ispitivanja koji bi mogli imati koristi opstanak. Unatoč nekim dokazima potencijalnih ciljeva, uključujući i HER2 [8], [9], učinkovitost ovih biološki ciljane terapije nije poznat, a postoji nedostatak standardne ciljane terapije za rak želuca. Zbog biološke raznovrsnosti želučanog karcinoma, malo je vjerojatno da postoji jedan 'magična' izliječiti. Molekularni markeri će biti tako važno u budućnosti predvidjeti ishod pacijenata i krojenje tretmane prema individualnim biologije. Pregled

U potrazi za biomarkera, analiza ekspresije gena potpis je bio korišten u različitim aplikacijama, kao što je za razjašnjenje mehanizmi bioloških puteva [10], klasificiranja podtipova bolesti [11], koji predviđaju rak prognozu [12] i profiliranje ekspresije gena kao odgovor na određene lijekove [13], [14]. Genska ekspresija potpis analiza se može učiniti pomoću širokog Instituta Povezivanje karta (http://www.broadinstitute.org/cmap). Povezanost karta ima za cilj stvoriti kartu koja povezuje genske uzorke ekspresije povezane s bolešću na odgovarajućim obrascima koje proizvode kandidata za lijekove i genetskim manipulacijama [15], [16]. Ovaj pristup sustavima omogućuje spojevi biti prikazivan protiv genoma širom bolesti potpisa, nego predodređeni skup ciljnih gena. Lijekovi su u paru s bolestima koje koriste sofisticirane metode uzorak podudaranja s visokom razinom razlučivosti i specifičnosti. Iako to ostavlja mnoga otvorena pitanja, povezivost karta je pokazala da genomske analize potpis može se koristiti za prepoznavanje lijekova sa zajedničkim mehanizmima djelovanja, otkrivanje nepoznatih mehanizama djelovanja i identificirati potencijalne nove terapeutika [15], [16]. Pregled

Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi potencijalne nove lijekova za liječenje karcinoma želuca. Da biste to učinili, prvo smo analizirali genomske potpis ljudskog raka želuca. Zatim je korišten Nastala želuca gen raka potpis u silico pregled angažiranjem Povezivanje Karta analiza za identifikaciju terapijska sredstva koja potencijalno može biti učinkovit protiv ove vrste raka. Smo dodatno potvrdili vrhu lijek ciljanja za efikasnost u želučanom staničnim linijama raka. Otkrili smo da vorinostat, kao potencijalni novi lijek, izazvanog kako apoptoze i autophagy u želučanih stanica raka. Zajedno, ova studija pokazuje da Povezivost Karta analiza se može koristiti za identifikaciju terapeutskih sredstava koji mogu biti uspješni u liječenju podskup želučanog karcinoma. Pregled

Metode

Analiza microarray podataka pregled

Za povezivanje Karta analize, koristili smo podatke microarray od 65 pacijenata s rakom želuca, uključujući 65 vrsta raka i 19 normalnih želučanog tkiva, koje su dobili od našeg prethodnog rada, Yonsei podataka [17]. Tumor primjerci prikupljeni su od pacijenata s rakom želuca prolaze gastrektomije kao primarni tretman. Uzorci tkiva su ispitana patologa u trenutku prikupljanja i pohranjen u -80 ° C u banci tkiva do početka eksperimenta. Ukupna RNA je ekstrahirana iz svježe zamrznuta tkiva pomoću mirVana RNA označavanja izolacijski kit (Ambion, Inc.). Primarni mikropostrojima podaci dostupni u NCBI je Gene Expression Omnibus javna baza podataka (microarray platformi, GPL6884; mikropostrojima podataka, GSE 13.861). Još jedna ekspresija gena profil koji je dobiven od 69 uzoraka želučane tkiva, uključujući i 38 karcinoma i 31 rak ne strome, od Stanford Microarray baze podataka (http://smd.stanford.edu, GSE13911), Stanford podataka. Želučani geni raka specifične su odabrani od strane BRB-ArrayTools verziji 3.6.1 (Biometrijski Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Usporedba klasa pomoću dva uzorka t-testa (značaj < 0.001, 10.000 nasumično permutacija) identificirati želučanog specifične gene i gene čija znači izraz intenziteti su promijenjeni najmanje dva puta u odnosu na normalnu znači ekspresiju gena tkiva su odabrani od raka pregled.

Povezivanje karta analiza pregled

Kako identificirati potencijalne lijekove koji ciljaju želučani karcinom, liste gena iz top 500 do uređenog i 500 najboljih dolje propisane gene iz želučanog gena raka specifične su korišteni (tablica S1). Povezanost Karta Analiza je provedena putem web sučelja (http://www.broadinstitute.org/cmap) pomoću verziju, graditi 02, koji sadrži više od 7.000 izraz profili predstavljaju učinke 1.309 spojeva na nekoliko uzgojenih ljudskih stanica [15], [16]. Karta Povezivanje pokazuje funkcionalne veze između lijekova, gena i bolesti. Lijekovi koje proizvode bolest-oponašajući potpise gena može pomoći u prepoznavanju staze koje predstavljaju potencijalne terapijske ciljeve za tu bolest. S druge strane, lijekovi koji uzrokuju "reverse" potpis, tj promjena u ekspresiji gena u smjeru suprotnom onome u bolesnom stanju, može predstavljati novi terapijski agensi. Agensi kandidati protiv određene bolesti mogu se prepoznati primjenom bolesti specifične genske ekspresije profil na Povezivanje Karta analize. Odabrali smo lijekove kandidate za validaciju In vitro pregled na temelju rezultata povezivost, korelacije, a P-vrijednosti. pregled

Kemikalije i stanična kultura pregled

Vorinostat dobiven je od tvrtke Merck i pripremljeni kao otopine u dimetilsulfoksidu (DMSO). Klorokvin i bafilomycin A1 (Sigma) otopi se u vodi i odnosno DMSO. Humanog želučanog stanične linije raka AGS, NCI-N87 i KATO-III su dobiveni iz American Type Culture Collection i održavani su u skladu sa preporukama. Uzgajane su u RPMI 1640 oplemenjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U penicilina i 100 ug /ml streptomicina na 37 ° C u 5% CO _{2. Pregled}

Rast stanica, održivost i staničnog ciklusa testovi

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolijeva bromida (MTT) analizi, MTT otopljen je u PBS na 5 mg /ml. Oko 5 x 10 ^{3 stanice su posađene u pločice s 96 jamica, te ostavi da se vežu preko noći. Medij kulture je zatim zamijenjen sa svježim medijem koji sadrži navedene koncentracije vorinostat ili DMSO. Nakon 72 sata, doda se 20 ul otopine MTT te su ploče inkubirane pri 37 ° C tijekom 4 sata. Nakon inkubacije, doda se 100 ul DMSO da se otopi formazan, a apsorbancija je očitana na 570 nm pomoću spektrofotometrijskog čitača mikroploče (Vmax čitača kinetičke mikroploči Molecular Devices). Eksperimenti su izvršene u triplikatu. Pregled}

kristalno ljubičastog bojanja, stanice su tretirane 12 sata, medij je uklonjen i stanice su isprane s PBS i inkubirane 30 min s 0,5% kristalno ljubičastog (za 20% metanol i 80% dvostruko destilirane vode). Stanice su zatim isprane tri puta s PBS-om. Preostali kristal violet se ekstrahira u octenoj kiselini tijekom 5 minuta, a apsorbancija je mjerena na 595 nm pomoću spektrofotometrijskog čitača mikroploče. Pregled

Kako bi se odredilo vijabilnost stanica, stanice se inkubira s vorinostat 72 h. Prilijepljene stanice su zatim odvojene od ploče za uzgoj kulture tripsinizacijom i pomiješa s plutajućim stanice, centrifugiraju, te suspendira u 500 ul propidij jodida (PI) -exclusive otopina (ne prolaze kroz staničnu membranu) tijekom 15 min na 4 ° C. Obojene stanice su praćene pomoću protočne citometrije (Beckman Coulter Cytomics FC-500). Pregled

analizu staničnog ciklusa, stanice se inkubira s vorinostat 24 h, sakupi i suspendira u 500 ul hipotoničnoj otopini (0.1% natrij citrata, 0,1% Triton X-100, 100 ug /ml RNase i 50 ug /ml PI) tijekom 15 min na 4 ° C. PI obojane stanice su praćene protočnom citometrijom. Stanični ciklus je analiziran MultiCycle AV softvera. Pregled pokusi

Izoliranje RNA i microarray

Izolacija RNA i microarray pokusi su provedeni u skladu s protokolom opisanim ranije [17]. Ukupna RNA je ekstrahirana iz želučanog staničnim linijama raka s ili bez tretmana vorinostat pomoću mirVana RNA kompleta (Ambion, TX, USA). Integritet velikih RNA frakcije određenje Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, USA) kao zamjena za mRNA kontrolu kvalitete. Ukupna RNA je označen hibridizira sa ljudskim HT12 V.3 ekspresije BeadChips prema protokolu proizvođača (Illumina, CA, USA). Nakon što su BeadChips je skeniran sa Illumina BeadArray Reader, podaci microarray su normalizirani korištenjem kvantilnih metode normalizacije u linearnom Modeli za paket Microarray podataka u R jezika okoliš [18]. Razina ekspresije svakog gena je pretvoren u zapisnik _{2 baze prije daljnje analize. Analiza Klaster je učinjeno s Klastera i Treeview [19].}

Western blot analiza pregled

Stanice su ukradeni u srednjim i vrti se, a proteini su izolirani pomoću pufera za lizu (50 mM HEPES, 150 mm NaCl, 1 mM EGTA i 10 mM natrij-pirofosfat (pH 7.4)) koji sadrži 100 mM NaF, 10% glicerol, 1,5 mM MgCl _{2, 1% Triton X-100 i inhibitora proteaze (Roche). Ekstrakti su inkubirani na ledu tijekom 20 minuta, te centrifugira na 20800 g tijekom 20 minuta. Koncentracija proteina određena je korištenjem BCA reagensa za određivanje proteina (Pierce). Jednake količine proteina iz svakog uzorka su razdvojeni elektroforezom preko SDS-PAGE i prenesen je u Hybond-C Super membranu (Amersham Pharmacia Biotech). Membrane su blokirane tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi u Tris-puferiranoj slanoj otopini koja sadrži 0.1% Tween-20 i 5% nemasnog suhog mlijeka. Membrane su inkubirane preko noći na 4 ° C s primarnim antitijelima razrijeđenim u 5% nemasnog suhog mlijeka ili 5% BSA u 1 × Tris-puferirana slana otopina sa 0.1% Tween-20. Korištene su antitijela na LC3 (Novus Biologicals), aktivnom kaspazom-3 ​​(Epitomics) i p62 (BD Biosciences). Antitijela na a-tubulin i beclin-1 su od tvrtke Cell Signaling Technology, Antitijela na p-aktin od Sigma. Membrane su potom isprane i inkubirane kroz 1 sat na sobnoj temperaturi sa peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela (Cell Signaling Technology). Proteinske vrpce bile su vizualizirani pomoću hemiluminiscencija kao što je opisano od strane proizvođača (GE Healthcare). Pregled}

siRNA transfekcija pregled

siRNA ciljna sekvenca za beclin-1, nontargeting siRNA (RISC besplatno) i Dharmafect 1 su kupljen od Dharmacon. Stanice su zasijane u uzgojne posude od 10 cm i transfektirane s siRNA 24 sata kasnije u skladu s uputama proizvođača. Sljedećeg dana, stanice su tripsinizirane i stavljene na ploče 6 cm ili 96 jažica na istu efikasnost transfekcije. Razina ekspresije proteina određuje se pomoću Western blot analize. pregled

transmisijskim elektronskim mikroskopom pregled

Uzorci su fiksirane s otopinom koja sadržava 3% gluteraldehida plus 2% paraformaldehida u 0,1 M kakodilatu puferu, pH 7,3, 1, sat. Nakon fiksiranja, uzorci su isprani i pomiješa s 0,1% Millipore-filtriranim kakodilatu puferirane taninska kiselina, postfiksirana s 1% puferiranim osmijevog tetroksida 30 minuta i obojeni u cijelosti sa 1% Millipore-filtriran uranyl acetata. Uzorci su dehidrirana u rastućim koncentracijama etanola infiltrirani i ugrađen u LX-112 medija. Uzorci su polimerizirani u 70 ° C peći tijekom 2 dana. Veoma tanki rezovi su na Leica Ultracut mikrotomom (Leica, Deerfield, IL), obojeni uranyl acetata i vode citrat u Leica EM Stainera, a ispitana je na JEM 1010 transmisijskim elektronskim mikroskopom (JOEL, USA, Inc., Peabody, MA ) na naponom ubrzavanja od 80 kV. Digitalne slike su dobiveni korištenjem AMT Imaging System (Advanced mikroskopije Corp, Danvers, MA). Pregled

Rezultati

Ekspresija gena potpis karcinoma želuca pregled

Tablica 1 prikazuje karakteristike pacijenti iz Yonsei podataka [17]. Želučani karcinom uglavnom nalazi u distalnom želucu i faze III /IV. Korištenje Microarray podatke genske ekspresije tih pacijenata, otkrili smo 3.360 gena tumor specifične čije znači izraz intenziteti su promijenjeni najmanje dva puta u odnosu na normalnu znači ekspresiju gena tkiva ( P izvoznici < 0,001, Slika S1 ). Ovaj set 3.360 gena (tj rak želuca specifičan potpis) korišten je za dodatno u silico
screeninga za potencijalne terapijske lijekova za rak želuca. Pregled

Analiza Povezivanje Karta identificira potencijalne lijekove koji ciljaju rak želuca

kako identificirati potencijalne lijekove ciljanje rak želuca, specifičan potpis raka želuca se koriste kao ulazni upit na Povezivanje Karta kao što je opisano u odjeljku "metoda". Mi izričito tražili spojeva koji su imali potpis obrnuto koreliraju s rakom želuca specifičan potpis i identificiranih više lijekova koji su sažeti u tablici 2. Rangiranje spojeva kandidata je osnovan na temelju inverzne korelacije vrijednosti i p-vrijednost. Tablica 2 (stupci 2-4) pokazuje najviše rangirani spojeva iz Yonsei podataka. Analiza povezivanja Map pokazala da histon deacetilaze (HDAC) inhibitori, uključujući i vorinostat Trihostatin A predstavlja potencijalnih kandidata za ciljanje rak želuca. LY294002 je inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaza je fenotiazin trifluoperazin i toplinskog šoka inhibitor protein tanespimycin također su prepoznati kao ciljna sredstva za rak želuca. Dalje, ovjeren smo naše nalaze korištenjem neovisnog set podataka ekspresije gena profila iz Stanford Microarray bazom podataka (Tablica 2; Stanford podataka; stupcima 5-7). Povezivanje Karta analiza ovog skupa podataka potvrdila vorinostat kao najviše rangirani kandidat. U zaključku, Povezivost Karta analiza identificirani vorinostat kao potencijalni terapeutski agens za rak želuca. Pregled

Vorinostat pokazuje učinkovitost In vitro pregled kod raka želuca stanične linije

Kako bi se procijenilo je terapijski djelotvornost vorinostat, procjenjuje rast ustanovljenih staničnih linija raka želuca (AGS, KATO-III i NCI-N87) nakon 72 sata vorinostat tretmana primjenom MTT testa. U usporedbi s netretiranim stanicama, vorinostat inhibira značajno sposobnost stanica na način ovisan o dozi, u svim staničnih linija raka želuca (Slika 1A). Potvrdili smo smanjenje životnu sposobnost stanica analizu staničnog ciklusa AGS i KATO-III stanica raka. Pokazali smo da liječenje vorinostat (5 uM) tijekom 24 sata izazvala je značajno povećanje u sub-G1 udjelu AGS stanica u usporedbi s kontrolom (2,3 ± 0,07% u odnosu na 39,2 ± 0,99%, respektivno; P izvoznici <0,01), što ukazuje na indukciju stanične smrti (slika 1B). Suprotno tome, pod-G1 postotak vorinostat pomiješa KATO III-stanica nije utjecao (slika 1B), dok je udio G2 /M stanica značajno povećana (21,4 ± 1,91% u odnosu na 29,3 ± 0,35%; P
= 0.044), indikativno za staničnog ciklusa. Mi i dalje testira održivost stanica pomoću PI-isključenosti. pomiješa se AGS i KATO III-stanica s 5 uM vorinostat 72 sata, te ih ocjenjuje protočnom citometrijom (Slika 1C). Iznos od mrtvih stanica, koje imaju nisku naprijed raspršiti i visoku bočnu raspršiti, značajno je povećan u AGS stanica (12,4 ± 4,3% u odnosu na 79,4 ± 5,7%), te također u KATO-III stanice, u usporedbi s kontrolnim stanicama (8.7 ± 0,6% u odnosu na 46,8 ± 2,1%). Konačno smo analizirali indukciju apoptoze nakon vorinostat liječenja u AGS i KATO-III želuca staničnim linijama karcinoma pomoću imunoblot. Vorinostat povećana apoptoza, po procjeni kaspaze-3 dekolte, u AGS stanicama te u manjoj mjeri u KATO-III stanice (Slika 1D). Pregled

Ukratko, ovi podaci ukazuju na to da vorinostat ima antiproliferativno djelovanje na rak želuca stanične linije po induciranje apoptoze u stanicama AGS i G2 /M staničnog ciklusa u KATO III-stanica. pregled

ekspresija gena analiza želučanog stanične linije raka AGS i Kato-III nakon tretmana vorinostat

za analizu učinka vorinostat na globalnoj ekspresije gena, AGS i KATO-III stanice raka želuca su tretirane s 5 uM vorinostat 48 sati i microarray analiza je provedena. Bez nadzora klaster analiza microarray podatke nakon vorinostat liječenja pokazali da AGS i KATO-III stanice su grupirani s istim staničnoj liniji, bez obzira na vorinostat obrade (slika 2a). Zbog autophagy je izvijestila da imaju ulogu u vorinostat inducirani efekti u drugih vrsta raka [20], [21], proveli smo nadziranu analizu autophagy vezane set gena (80 gena i 149 probe; Tablica S2). Vorinostat tretirane rak želuca stanične linije su grupirani zajedno (Slika 2B), što ukazuje da indukcija autophagy je važno svojstvo vorinostat u želučanim linije raka. Pregled

Inhibicija autophagy pojačava vorinostat učinkovitost u želučanim stanicama raka pregled

s obzirom da autophagy može imati ulogu u oba preživljavanje stanica raka i raka stanične smrti nakon liječenja lijekovima [22], [23], što dodatno vrednovati doprinos tom procesu s učinkom vorinostat na želučane staničnim linijama karcinoma. Se funkcionalno ocjenjuje ovaj postupak imunoblot analizu markera autophagy mikrotubula protein povezan 1 lakog lanca 3 (LC3). Vorinostat liječenih KATO-III stanica, te u manjoj mjeri AGS stanica, pokazalo jasnu nakupljanje lipidirani oblika brže prelazi u LC3 (LC3-II) (slika 3A). Akumulacija LC3-II može rezultirati iz bilo ranijim koracima autophagosome nastajanje ili začepljenja autophagic degradacije LC3-II [24], [25]. Stoga smo analizirali stanice vorinostat tretirana za razgradnju p62, biljeg autophagic toka [24], a gledali smo je smanjenje razine p62 proteina u stanicama vorinostat tretirana u odnosu na vrijeme podudaraju netretirane stanice raka (slika 3A). Osim toga, u cotreatment vorinostat s bafilomycin A1 (BafA1), inhibitora autophagosome-lizosoma fuzije, dalje povećati LC3-II akumulaciju (slika 3B), u skladu s vorinostat inducirati fluks autophagic umjesto blokiranje degradacijskih kapacitet autophagolysomes. Elektronska mikroskopija (EM) je osjetljiva, kvantitativno i konačni metoda za otkrivanje autophagy [24]. U skladu s podacima Western blot, EM analiza je pokazala da vorinostat značajno povećana formacija autophagosome u AGS stanica (slika 4b i B ') u odnosu na kontrolne stanice (slika 4a i'). Pregled

Da bi istražili da li akumulacije autophagosomes štiti stanice protiv stanični stres izazvan od strane vorinostat, mi inhibira proces autophagy pomoću farmakološkog inhibitora klorokin i male ometa RNA (siRNA) protiv beclin-1. Dodavanje klorokin za vorinostat tretiranih AGS i KATO-III stanice rezultira smanjenjem ovisan o dozi kod održivosti (Slika 5A). Smanjenje održivosti potvrđena je u KATO-III stanice tretirane beclin-1 siRNA (slika 5B). Zajedno, podaci ukazuju na to da inhibicija vorinostat inducirane autophagy može poboljšati učinkovitost vorinostat liječenje želučanih stanica raka. Pregled

Vorinostat promjene gena potpis u ljudskim stanicama raka želuca pregled

Kako razumjeti učinke vorinostat na ekspresiju gena u želučanom staničnim linijama karcinoma, proveli smo microarray analiza vorinostat tretira AGS i KATO-III raka želuca stanične linije (sl. 2). Naša analiza pokazala značajne genomske razlike između netretiranih i vorinostat liječenih želučanih stanica raka (AGS i KATO-III). Nakon vorinostat tretmana, ekspresija gena 1014 povećana je i ekspresija 760 gena smanjena je u staničnoj liniji AGS. U staničnoj liniji KATO III-164 geni su i 191 geni podregulira (dva puta razlika; P pregled < 0,001). Vorinostat značajno mijenja izraz od 140 gena u oba AGS i stanične linije KATO-III (vorinostat specifični gen potpis). Geni koji su najviše mijenjati nakon vorinostat liječenja su identificirani kao SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK pregled (+ 4-fold up -Regulacija) i MUC1, IFITM1, ANKRD37 pregled (>. 4 puta-naniže) pregled

Dalje, trebalo je utvrditi biomarkera kandidate koji mogu predvidjeti vorinostat osjetljivost bolesnika ljudskih rak želuca , Stoga, u kombinaciji se skup promijenjenih gena vorinostat pomiješa želučane tumorskih staničnih linija (vorinostat specifični gen potpisa) i dvije ljudske želučane potpisa karcinoma iz podataka o Yosei i Stanford pomoću Vennov analiza dijagram. Otkrili smo da je relativna razina ekspresije 12 gena su poništena od strane vorinostat tretmana (Slika 6). Od tih 12 gena, 7 geni vrlo izražen u želučanom tkivu raka podregulirani ( ITGB5
, TYMS
, MYB
, APOC1
, CBX5 pregled, PLA2G2A pregled, KIF20A pregled) i 5 niske izrazio geni su up-regulirana nakon vorinostat liječenja ( SCGB2A1 pregled, TCN1 pregled, CFD pregled, APLP1 pregled, Nqo1 pregled (Tablica 3). pregled

Rasprava pregled

Naši rezultati pokazuju da je globalni ljudski želuca gen raka potpis može biti korisno pronaći terapijska sredstva koja već ciljaju genomske potpis od raka želuca, umjesto ciljanja jednu ili dvije određene gene. Korištenje Povezivanje Karta, otkrili smo da su inhibitori HDAC, kao što su vorinostat i Trihostatin a, imao obrnuto koreliraju gen potpis u odnosu na specifične genske potpisa raka želuca i stoga se mogu dovesti terapijske kandidati za rak želuca. In vitro pregled evaluaciju terapijske učinkovitosti vorinostat pokazala da je ovaj terapeutski lijek potisnut rast različitih karcinoma želuca staničnih linija. Pored svojih antiproliferativnih učinaka, vorinostat također regulira prema gore gene autophagy specifična. Inhibicija vorinostat izazvanog autophagy rezultiralo daljnjim smanjenjem održivosti. Osim toga, u kombinaciji Analiza želučanog staničnim linijama raka liječenih vorinostat i uzoraka pacijenata s karcinomom želuca pokazali da vorinostat promijenila razina ekspresije niza specifičnih gena dvanaest želuca. Pregled

Naši rezultati su pokazali da su inhibitori HDAC, a vorinostat trihostatin a, bili vrh terapijske kandidati za rak želuca, što se slaže s konceptom koji HDAC je izraženo u želučanom tkivu raka [26]. Inhibitori HDAC su pokazala da povećanje acetilacije histona stoga utječu na ekspresiju gena. Ovi inhibitori očigledne antikancerogene efekte izazivanjem unutarnje i izvanjske apoptozu put [27], [28], blokiranje tumorske angiogeneze [29], a koji inhibiraju unutarstanični putevi odgovor na stres [30]. Budući da inhibitori HDAC imaju globalne posljedice na ekspresiju gena, oni mogu utjecati na još skrivene stanične procese [31], [32]. U kliničkoj praksi, inhibitori HDAC su u velikoj mjeri primijeniti na hematoloških malignih bolesti, no klinička ispitivanja u solidnim tumorima su u tijeku. Nedavna studija, s podrškom za naš in vitro
Rezultati su pokazali terapeutsku učinkovitost inhibitora HDAC o ljudskim uzorcima s rakom želuca pomoću testa histoculture droga odgovora [33]. Međutim, to ostaje da se neobznanjena li specifični molekularni definiran podgrupe može predvidjeti odgovor ili otpornost na inhibitora HDAC. Osim toga, primjena potencijalno korisnih biomarkera još uvijek ima nekoliko ograničenja [34]. Pregled

Povezivost Karta dalje je teško procijeniti dok ne mogu procijeniti u kojoj mjeri genomske potpisi dobivene iz In vitro pregled eksperimenti rekapitulirati složenost ljudske bolesti. Iako Povezivanje karta sadrži više od 7000 profile ekspresije koje predstavljaju 1.309 spojeve, njezin pristup i dalje se bavi nekim ograničenjima, kao što su ograničene količine stanične linije podataka (staničnoj liniji MCF7, PC3, itd) od i neznanja microenvironmental utjecajima iz ljudskog tijela [16] , Osim toga, ekspresija gena profila izvedeni iz tretman kultiviranih ljudskih stanica ne može biti povezana s in vivo
antitumorski učinak zbog kompleksne prirode raka. Osim toga, unos samo ograničena količina gena je dopuštena, a što mogu utjecati na dobivene rezultate. Buduće studije treba riješiti jesu li naši rezultati dobiveni cmap analiza može potvrditi u in vivo
želuca modela raka. Unatoč ovim ograničenjima, Povezivanje Karta analiza je potencijalno korisna metoda za novim funkcijama za lijekove, uključujući i vorinostat, već u upotrebi u klinici za druge namjene. Pregled

In vitro pregled vrednovanje terapeutske učinkovitosti vorinostat u karcinomu želuca stanične linije pokazala da je ovaj terapeutski lijek je pokazao antiproliferativnog učinka u fiziološkim relevantnim dozama (5 uM) kompatibilan s ostalim publikacijama: IC _{50 za AGS i Kato-III je pokazano da se redom 2,9 uM i 5,9 uM [ ,,,0],35]. Analiza staničnog ciklusa (Slika 1B), preživljavanje stanica i (slika 1C) apoptične odgovori (Slika 1D) je pokazala da su učinci vorinostat pokazuju odstupanje u različitim staničnim linijama karcinoma želuca, inducira apoptozu u AGS stanice i G2 /M uhićenja u Kato -III stanica. Razlika u genetskom /mutacije pozadini staničnih linija može objasniti razliku. Pregled}

Analiza Microarray ekspresije gena uspoređujući vorinostat-tretiranim i netretiranim stanične linije raka želučani naznačeno da je ova droga izazvana autophagy, što je u skladu s prethodno izvješća u drugim staničnim linijama raka [20], [21]. Kao induktivnu i inhibicije autophagy može imati terapeutske prednosti [22], [23], što dodatno vrednovati ulogu autophagy u želučanih stanica raka nakon vorinostat liječenja. Inhibiranje autophagy koristeći poznatu antimalarijsku lijek, klorokin [21] i koristi siRNA prema beclin-1 rezultirala smanjenjem isplativosti želučanih staničnim linijama raka, u prisutnosti vorinostat, sugerirajući autophagy je aktiviran kao zaštitni odgovor za preživljavanje nakon vorinostat liječenje (Slika 5). Tako kombinirajući antitumorski agensi kao što su vorinostat i inhibitori autophagy mogao pružiti terapeutsku prednost u borbi protiv raka želuca. Pregled

Za prepoznavanje vorinostat izazvana gena potpis, ocijenili smo profila genske ekspresije AGS i KATO-III stanici linije nakon vorinostat liječenja. Izraz 1774 i 355 gena je obrnuta (> 2-struki, p < 0.001) u AGS i KATO III-staničnim linijama, respektivno. To sugerira da AGS stanična linija je ranjivije od Kato-III vorinostat tretman u odnosu na ekspresiju gena. Ova manifestacija može objasniti osjetljivost AGS stanica na vorinostat. Mi smo otkrili da vorinostat značajno promijenila izraz skupa 140 gena u oba AGS i stanične linije KATO-III.