Фон
<р> Рак желудка продолжает оставаться одним из самых смертоносных видов рака в мире и, следовательно, определение новых препаратов, ориентированных на этот тип рака, таким образом, существенное значение. Цель данного исследования состояла в том, чтобы идентифицировать и проверить терапевтический агент, который может улучшить результаты для больных раком желудка в будущем.
Введение
<р> рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной смерти от рака в [1] в мире, с общей выживаемости около 10 месяцев [2] - [4]. Лечение рака желудка может включать в себя химиотерапию, хирургическое вмешательство и лучевая терапия. К сожалению, в настоящее время химиотерапии на основе лечения поздних стадий рака желудка демонстрируют неутешительные результаты [2] - [4]. Действительно, полная ремиссия являются редкими или только последний очень скоро.
Несколько целевых агентов, которые придают преимущества для выживания в других типах рака, были под следствием рака желудка. В то время как некоторые ранние клинические исследования с использованием сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептора (VEGFR) и эпителиального фактора роста рецептора (EGFR) -1 ингибиторы, такие как цетуксимаб и бевацизумаб, показали немного активности, редко фактическое увеличение выживаемости пациентов [5] , [6]. Одной из причин может быть то, что эти исследования не выбирали пациентов в соответствии с наличием биомаркеров. В последнее время трастузумаб для рака желудка (ТОГА) суда отметил, что добавление трастузумаба к химиотерапии привело к статистически значимое улучшение выживаемости без прогрессирования (ВБП) и общей выживаемости (ОВ) от приблизительно 20% пациентов с диссеминированным желудка и гастроэзофагеальной (GE) распределительные опухоли сверхэкспрессией HER2 [7]. Это подчеркивает необходимость целенаправленной биологической терапии и поиск биомаркеров для отбора пациентов для клинических испытаний, которые могут принести пользу выживания. Несмотря на некоторые доказательства потенциальных мишеней, в том числе HER2 [8], [9], эффективность этих биологически целенаправленной терапии не известна, и есть отсутствие стандартного таргетной терапии рака желудка. Благодаря биологической гетерогенности рака желудка, то маловероятно, что есть один "волшебной пули" вылечить. Молекулярные маркеры будут, таким образом, важным в будущем для прогнозирования результатов пациентов и портняжные лечения в соответствии с индивидуальной биологии. Анализ данных микрочипов Связь Карта анализ Вестерн-блот анализ просвечивающей электронной микроскопии экспрессии генов подписи рака желудка Для того, чтобы определить потенциальные наркотики таргетинга рак желудка, рак желудка специфических подпись была использована в качестве входного запроса в Connectivity карте, как описано в разделе «метод». В частности, мы искали соединений, которые имели подпись обратно коррелирует с желудочным раком конкретной подписи и идентифицированы несколько препаратов, которые приведены в Таблице 2. Установлено ранжирование потенциальных агентов основаны на обратной величины корреляции и р-значения. Таблица 2 (столбцы 2-4) показывает самый высокий рейтинг соединений из данных Йонсей. Анализ подключения карт показал, что гистондеацетилазы (HDAC) ингибиторы, включая вориностат и трихостатин а представляют собой потенциальных кандидатов для таргетинга рака желудка. Фосфатидилинозитол-3-киназы ингибитор LY294002, фенотиазина трифтороперазин и теплового шока ингибитор белка tanespimycin также были определены в качестве кандидатов целевых агентов для рака желудка. Далее, мы подтверждены наши выводы с помощью независимого набора данных профиля экспрессии генов из Стэнфордского Microarray базы данных (таблица 2; Стэнфордского данных; столбцах 5-7). Связь анализа Карта этого набора данных подтвердил Vorinostat в качестве кандидата в топ рейтинга. В заключение, анализ подключения карт определены Vorinostat в качестве потенциального терапевтического средства для лечения рака желудка. Глобальный анализ экспрессии генов желудочных линии раковых клеток AGS и КАТО-III после лечения Vorinostat Для того, чтобы понять последствия Vorinostat на экспрессию генов в желудочном линиях раковых клеток, мы провели анализ микрочипов Vorinostat лечение AGS и КАТО-III линии рака желудка клеток (рис. 2). Наш анализ выявил существенные различия между геномных необработанных и обработанных Vorinostat клеток рака желудка (AGS и КАТО-III). После вориностат обработки, экспрессию генов 1014 была увеличена и экспрессия 760 генов была снижена в клеточной линии AGS. В клеточной линии КАТО-III, 164 генов были и 191 гены были вниз регулируется (два раза разница; P Далее, мы намеревались определить кандидатов биомаркеров, которые могут предсказывать чувствительность Vorinostat пациентов рака желудка человека , Таким образом, мы объединили множество измененных генов в вориностат лечение желудочных линий раковых клеток (Vorinostat специфический ген сигнатура) и двух человеческих желудочных сигнатур рака, генерируемых из данных Yosei и Стэнфордского с использованием анализа диаграммы Венна. Мы обнаружили, что относительные уровни экспрессии генов 12 были отменены обработкой Vorinostat (рисунок 6). Из этих 12 генов, 7 генов, высокий уровень экспрессии в раковых тканях желудка были понижающей регуляции ( ITGB5 Обсуждение В пробирке
<Р> В поисках биомаркеров, анализ экспрессии генов подписи был использован в различных приложениях, например, для выяснении механизмы биологических путей [10], классифицируя подтипов заболевания [11], предсказывающих прогноз рака [12] и профилирование экспрессии генов в ответ на определенные лекарственные препараты [13], [14]. Генная анализ экспрессии подпись может быть сделано с помощью широких Института Connectivity Карта (http://www.broadinstitute.org/cmap). Связь Карта стремится создать карту, которая связывает паттерны экспрессии генов, связанных с болезнью в соответствующих моделей производства лекарств-кандидатов и генетических манипуляций [15], [16]. Этот системный подход позволяет соединения быть экранирован от геномных подписей болезни, а не предварительно выбранным набором генов-мишеней. Лекарства в сочетании с заболеваний с использованием сложных методов сопоставления с образцом с высоким уровнем разрешения и специфичности. Несмотря на то, что оставляет много открытых вопросов, подключение карт показал, что анализ геномной подписи могут быть использованы для распознавания наркотиков с общими механизмами действия, открывать неизвестные механизмы действия и выявить потенциальные новые терапевтические средства [15], [16].
<р> цель данного исследования состояла в том, чтобы выявить потенциальные новые терапевтические средства для лечения рака желудка. Для этого мы сначала проанализировали геномную подпись рака желудка человека. Результирующая желудка ген рака подпись затем использовали в силикомарганца
с использованием анализа подключения карт для идентификации терапевтических агентов, которые потенциально могут быть эффективными против этого вида рака. Мы дополнительно подтверждена верхней таргетирования препарата для его эффективности в желудочном линиях раковых клеток. Мы обнаружили, что Vorinostat, в качестве потенциального нового лекарственного средства, индуцированного апоптоза как и аутофагии в раковых клетках желудка. В совокупности это исследование показывает, что анализ подключения Карта может быть использована для идентификации терапевтических агентов, которые могут быть успешными в лечении подгруппе рака желудка.
Методы
<р> Для анализа подключения карт мы использовали микрочипов данные 65 больных раком желудка, в том числе 65 видов рака и 19 нормальных тканей желудка, которые были получены из нашей предыдущей работы, данные Йонсей [17]. Образцы опухоли были собраны у больных раком желудка, подвергающихся гастрэктомию в качестве первичного лечения. Образцы ткани были исследованы патологи в момент сбора и хранили в -80 ° С в банке ткани до начала эксперимента. Суммарную РНК экстрагировали из свежезамороженной ткани с помощью Mirvana РНК маркировки изоляции комплект (Амбион, Inc.). Первичные данные микрочипов доступен в экспрессии генов NCBI в Omnibus публичной базе данных (микрочипов платформы, GPL6884; микрочипов данных, GSE 13861). Другой профиль экспрессии гена получали из 69 образцов тканей желудка, в том числе 38 рака и 31, не стромы рака, из базы данных Стэнфордского Microarray (http://smd.stanford.edu, GSE13911), данные Стэнфорда. Желудочный раковые гены специфичные были выбраны BRB-ArrayTools версии 3.6.1 (биометрической научно-исследовательский отдел, Национальный институт рака, Bethesda, MD). Сравнение класса с использованием двух образцов Т-тест (значение &лт; 0,001, 10000 случайных перестановок) определили рак желудка специфических генов и генов, означают выражения интенсивности были изменены, по крайней мере в два раза по сравнению означает выражение нормального гена ткани были выбраны
.
<р> Для того, чтобы определить потенциальные наркотики с таргетингом рак желудка, списки генные топ-500 до регулируемого и верхний 500 вниз регулируемых генов от желудочных генов рака специфические были использованы (таблица S1). Анализ подключения карт проводилось с помощью веб-интерфейса (http://www.broadinstitute.org/cmap), используя версию, построить 02, который содержит более 7000 профили экспрессии представляющих эффекты 1,309 соединений на нескольких культурах клеток человека [15], [16]. Карта подключения показывает функциональные связи между наркотиками, гены и болезни. Препараты, которые производят болезни имитирующие подписи гена может помочь определить пути, которые представляют собой потенциальные терапевтические мишени для этого заболевания. И наоборот, препараты, которые индуцируют "обратный" подписи, то есть изменения в экспрессии генов в направлении, противоположном тому, что наблюдалось в болезненном состоянии, может представлять новые терапевтические агенты. Кандидаты агенты против конкретного заболевания могут быть признаны путем применения заболевания определенного профиля экспрессии генов для анализа подключения карт. Мы выбрали кандидатов препараты для проверки в пробирке
на основе бальной связи, корреляции и P-значение.
Химия и культура клеток
<р> Vorinostat был получен от Merck и подготовлен в качестве исходного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО). Хлорохин и bafilomycin А1 (Sigma), растворяли в воде и соответственно ДМСО. Желудка человека линии раковых клеток АГС, NCI-N87, и КАТО-III были получены из Американской коллекции типовых культур, и были сохранены в соответствии с их рекомендациями. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37 ° С в атмосфере 5% СО <суб> 2.
Рост клеток, жизнеспособность и клеточного цикла анализы
<р> Для 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил тетразолия бромид (МТТ), МТТ растворяли в PBS при 5 мг /мл. Около 5 × 10 3 клетки высевали в 96-луночные планшеты и позволяли закрепляться в течение ночи. Питательную среду затем заменяли свежей средой, содержащей указанные концентрации вориностат или ДМСО. Через 72 часа добавляли по 20 мкл раствора МТТ, и планшеты инкубировали при 37 ° С в течение 4 ч. После инкубации 100 мкл ДМСО дл растворени формазана, и оптическую плотность считывали при 570 нм с использованием спектрофотометрического микропланшет-ридера (Vmax кинетический микропланшет-ридера, Molecular Devices). Эксперименты проводились в трех экземплярах.
<Р> Для окрашивания кристаллическим фиолетовым, клетки обрабатывали в течение 12 ч, среду удаляли и клетки промывали PBS и затем инкубировали в течение 30 мин с 0,5% кристаллическим фиолетовым (в 20% метанола и 80% дважды дистиллированной воды). Затем клетки промывали три раза PBS. Оставшийся кристаллический фиолетовый экстрагировали в уксусной кислоте в течение 5 мин, и измеряли оптическую плотность при 595 нм с использованием спектрофотометрического микропланшет-ридера.
<Р> Для определения жизнеспособности клеток, клетки инкубировали с вориностат в течение 72 ч. Прилипшие клетки затем отделяют от культуральных планшетов путем обработки трипсином и в сочетании с плавающими клетками, центрифугировали и суспендировали в 500 мкл пропидийиодидом (PI) -Эксклюзивные раствор (не проникая через клеточную мембрану) в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Окрашенные клетки контролировали с помощью проточной цитометрии (Beckman Coulter Cytomics FC 500).
<Р> Для анализа клеточного цикла клетки инкубировали с вориностат в течение 24 ч, собирали и суспендировали в 500 мкл гипотонический раствор (0,1% цитрата натрия, 0,1% Тритон Х-100, 100 мкг /мл РНКазы и 50 мкг /мл PI), в течение 15 мин при температуре 4 ° С. PI-окрашенных клеток контролировали с помощью проточной цитометрии. Клеточного цикла анализировали с помощью многотактной AV программного обеспечения.
Выделение РНК и микрочипов эксперименты
<р> Выделение РНК и эксперименты микрочипов были проведены в соответствии с протоколом, как описано ранее [17]. Суммарную РНК экстрагировали из клеток желудка линий с лечением или без него вориностат с использованием набора для изоляции Mirvana РНК (Амбион, штат Техас, США). Целостность РНК большой фракции определяли с Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, Калифорния, США) в качестве суррогата для контроля качества мРНК. Общую РНК метили и гибридизовали с человеком HT12 экспрессии v.3 BeadChips в соответствии с протоколами производителя (Illumina, Калифорния, США). После того, как BeadChips были отсканированы с Illumina BeadArray Reader, данные микрочипов были нормализованы с использованием квантиль метод нормализации в линейной модели для пакета микрочипов данных в R языковой среде [18]. Уровень экспрессии каждого гена был преобразован в журнал <югу> 2 базы до дальнейшего анализа. Кластерный анализ был осуществлен с кассетными и Treeview [19].
<р> Клетки Царапины в среде и откручивали, и белки были выделены с использованием буфера для лизиса (50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA и 10 мМ пирофосфата натрия (рН 7,4)), содержащим 100 мМ NaF, 10% глицерина, 1,5 мМ MgCl <суб> 2, 1% Тритон Х-100 и ингибитора протеазы (Roche). Экстракты инкубировали на льду в течение 20 мин и центрифугировали при 20800 г в течение 20 мин. Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка ВСА реагента (Pierce). Равные количества белка из каждого образца разделяли с помощью электрофореза через SDS-PAGE и переносили на Hybond-C Супер мембраны (Amersham Pharmacia Biotech). Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в Трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,1% Tween-20 и 5% обезжиренного сухого молока. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичным антителом, разведенным в 5% обезжиренного сухого молока или 5% BSA в 1X Трис-солевом буфере плюс 0,1% твина-20. были использованы антитела к LC3 (Novus биологических препаратов), активный каспазы-3 (Epitomics) и p62 (BD Biosciences). Антитела к альфа-тубулина и Beclin-1 были из Signaling Technology Cell; антитела к бета-актина от Sigma. Мембраны затем промывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами (Cell Signaling Technology). Белковые полосы были визуализированы с помощью усиленной хемилюминесценции, как описано производителем (GE Healthcare).
миРНК трансфекция
<р> миРНК последовательность-мишень для Beclin-1, nontargeting миРНК (Risc Free) и Dharmafect 1 были приобрести у Dharmacon. Клетки высевали в 10-см чашки и трансфицировали siРНК, через 24 ч в соответствии с протоколом производителя. На следующий день клетки обрабатывали трипсином и засевали в 6-см или 96-луночные планшеты для получения прежней эффективности трансфекции. Уровни экспрессии белка определяли с помощью Вестерн-блот-анализа.
<р> Образцы фиксировали раствором, содержащим 3% gluteraldehyde плюс 2% параформальдегида в 0,1 М какодилатный буфер, рН 7,3, в течение 1 час. После фиксации образцы промывали и обрабатывали 0,1% Millipore-отфильтрованной какодилате буферном дубильной кислоты, постфиксами с 1% забуференном осмия в течение 30 мин, и окрашивают гуртом с 1% Millipore-отфильтрованной ацетата уранила. Образцы дегидратируют в возрастающих концентрациях этанола, инфильтрации и заливали в LX-112 среде. Образцы полимеризуют в C духовке 70 ° в течение 2-х дней. Ультратонкие срезы были вырезаны в Leica Ultracut микротома (Leica, Deerfield, IL), окрашивали уранилацетате и цитратом свинца в ситечко Leica EM, и исследовали в JEM 1010 просвечивающего электронного микроскопа (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Цифровые изображения были получены с использованием AMT Imaging System (Advanced Techniques микроскопией Corp, Danvers, MA).
Результаты
<р> В таблице 1 представлены характеристики пациенты из данных Йонсей [17]. Рака желудка были в основном расположены в дистальной желудка и стадии III /IV. Используя данные микрочипов экспрессии генов этих пациентов, мы обнаружили 3,360 опухолевые специфические гены которых означают выражения интенсивности были изменены, по крайней мере в два раза по сравнению означает выражение нормального гена ткани ( P
< 0,001, рис S1 ). Этот набор 3360 генов (т.е. рак желудка конкретной подписи) был использован для дальнейшего в силикомарганца
скрининга потенциальных лекарственных препаратов для лечения рака желудка.
Анализ подключения Карта выявляет потенциальные наркотики таргетингом рак желудка
Vorinostat показывает терапевтическую эффективность в пробирке
при раке желудка клеточные линии
<р> Для оценки терапевтического эффективность вориностат, мы оценивали рост установленных желудочных линий раковых клеток (AGS, КАТО-III, и NCI-N87) после 72 ч лечения Vorinostat с использованием МТТ. По сравнению с необработанными клетками, Vorinostat значительно ингибирует жизнеспособность клеток в зависимости от дозы во всех желудочных линий раковых клеток (Фигура 1А). Мы подтвердили снижение жизнеспособности клеток путем анализа клеточного цикла раковых клеток AGS и КАТО-III. Мы показали, что лечение с помощью вориностат (5 мкМ) в течение 24 ч вызывало заметное увеличение суб-G1 доли клеток AGS по сравнению с контролем (2,3 ± 0,07% против 39,2 ± 0,99%, соответственно; <ЕМ> P
≪ 0,01), что указывает на индукцию клеточной смерти (Фиг.1В). В отличие от этого, суб-G1 доля вориностат обработанных клетках КАТО-III не была затронута (фиг.1В), в то время как доля G2 /M-клетки значительно увеличилось (21,4 ± 1,91% против 29,3 ± 0,35%; <ЕМ> P
= 0,044), что указывает на арест клеточного цикла. Мы далее тестируют жизнеспособность клеток с помощью PI-исключения. Мы лечили AGS и клеток КАТО-III с 5 мкМ вориностат в течение 72 ч и оценивали их с помощью проточной цитометрии (рис 1C). Количество мертвых клеток, которые имеют низкий рассеяния вперед и высокую боковое рассеивание, была значительно увеличена в AGS клетках (12,4 ± 4,3% против 79,4 ± 5,7%), а также в клетках КАТО-III, по сравнению с контрольными клетками (8,7 ± 0,6% в сравнении с 46,8 ± 2,1%). Мы, наконец, анализировали индукцию апоптоза после обработки вориностат в линиях клеток желудка AGS и КАТО-III с использованием иммуноблот. Vorinostat повышенным апоптозом, по оценке каспазы-3 расщеплением, в AGS клетках и в меньшей степени в клетках КАТО-III (рис 1D).
<Р> Таким образом, эти данные указывают на то, что Vorinostat имеет антипролиферативное действие на рак желудка клеточные линии путем индукции апоптоза в клетках AGS и G2 /M клеточного цикла в клетках КАТО-III.
<р> для анализа влияния вориностат на глобальную экспрессию генов, раковые клетки желудка AGS и КАТО-III обрабатывали 5 мкМ вориностат в течение 48 часов и микрочипов анализа проводили. Неконтролируемое кластерного анализа данных микрочипов после обработки Vorinostat показали, что AGS и КАТО-III клетки группируются с той же клеточной линии, независимо от лечения Vorinostat (Рисунок 2А). Поскольку аутофагия сообщалось, играют определенную роль в Vorinostat-индуцированных эффектов в других видов рака [20], [21], мы провели контролируемый анализ аутофагии, связанных с набором генов (80 генов и 149 зондов; Таблица S2). Vorinostat обработанные линии рака желудка клеток были сгруппированы вместе (рис 2B), указывая, что индукция аутофагии является важным свойством вориностат в желудочном линий рака.
Ингибирование аутофагии повышает эффективность Vorinostat в раковых клетках желудка
<р> Учитывая, что аутофагии может иметь роль как для выживания раковых клеток и рака смерти клеток после лечения препаратом [22], [23], мы также оценили вклад этого процесса к эффекту вориностат на желудочную линиях раковых клеток. Мы функционально оценивали этот процесс путем иммуноблот анализа аутофагии маркера микротрубочки белок, ассоциированный с 1 легкой цепи 3 (LC3). Vorinostat-обработанных клеток КАТО-III, и в меньшей степени AGS клеток, показали четкое накопление быстрее мигрирующей липоилироваться форме LC3 (LC3-II) (рис 3, а). может привести к Накопление LC3-II либо из повышающей регуляции аутофагосом пласта или закупорки аутофагической деградации LC3-II [24], [25]. Поэтому мы проанализировали вориностат обработанных клеток для деградации p62, маркера аутофагической потока [24], и мы наблюдали снижение уровней p62 белка в клетках, обработанных вориностат по сравнению с временем совпадающая неочищенных раковые клетки (фиг.3А). Кроме того, cotreatment из вориностат с bafilomycin A1 (BafA1), ингибитор аутофагосом-лизосом слияния, дополнительно увеличена LC3-II накопления (рис 3B), совместимый с Vorinostat вызывая поток аутофагической, а не блокируя разрушающих способность autophagolysomes. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) является чувствительным, количественный и окончательным методом для обнаружения аутофагией [24]. В соответствии с данным западных блот-анализ показал, что EM Vorinostat заметно повышенное образование аутофагосома в клетках AGS (рис 4В и B ') по сравнению с контрольными клетками (рис 4А и А').
<Р> Для того, чтобы исследовать вопрос о том накопления автофагосомы защищает клетки от клеточного стресса, вызываемого вориностат, мы тормозится процесс аутофагии с помощью фармакологической хлорохин ингибитора и малых интерферирующих РНК (миРНК) против Beclin-1. Добавление хлорохин к вориностат обработанных AGS и клеток КАТО-III приводит к дозозависимое снижение жизнеспособности (фиг.5А). Снижение жизнеспособности было подтверждено в клетках КАТО-III, обработанных Beclin-1 миРНК (Фиг.5В). Вместе данные свидетельствуют о том, что ингибирование Vorinostat-индуцированной аутофагии может повысить эффективность лечения Vorinostat клеток рака желудка.
Vorinostat изменения генов подписи в раковых клетках желудка человека
&л; 0,001). Vorinostat значительно изменили экспрессию 140 генов в обоих AGS и клеточных линий КАТО-III (Vorinostat конкретный ген подписи). Гены, которые были наиболее измененные после обработки Vorinostat были идентифицированы как SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, ССК
(> 4 раза вверх -regulation) и MUC1, IFITM1, ANKRD37
(>. 4-кратно понижающую регуляцию)
, TYMS
, MYB
, APOC1
, CBX5
, PLA2G2A
, KIF20A
) и 5 низко выражены гены были повышающей регуляции после лечения Vorinostat ( SCGB2A1
, TCN1
, CFD
, APLP1
, NQO1
(таблица 3).
<р> Наши результаты указывают на то, что глобальной человеческой подписи желудка гена рака может быть полезным, чтобы найти терапевтические средства, которые скорее нацелены на геномную подпись рака желудка вместо ориентации один или два конкретных генов. Использование Connectivity Map, мы обнаружили, что ингибиторы HDAC, такие как Vorinostat и трихостатин а, имел обладать обратно коррелируют ген подписи по сравнению с раком желудка специфического гена подписи и, следовательно, могут быть свинцовые терапевтические кандидаты для рака желудка. <ЕМ> в пробирке
оценка терапевтической эффективности вориностат показало, что этот препарат терапевтический подавлено рост различных рака желудка Сотовые линии. Рядом с его антипролиферативным эффектами, Vorinostat также повышалась аутофагии-специфических генов. Подавление Vorinostat-индуцированной аутофагии привело к дальнейшему снижению жизнеспособности. Кроме того, комбинированный анализ желудочного линий раковых клеток, обработанных вориностат и образцах больных раком желудка показало, что Vorinostat изменили уровни экспрессии набора двенадцати рака желудка специфических генов.
<Р> Наши результаты показали, что ингибиторы HDAC, Vorinostat и трихостатин А, были главными кандидатами на терапевтические рака желудка, что согласуется с концепцией, что HDAC сверхэкспрессируется в желудочном раковых тканей [26]. ингибиторы HDAC было показано увеличение ацетилирование гистонов, поэтому влияет на экспрессию генов. Эти ингибиторы манифеста противоопухолевые эффекты путем индукции внутренней и внешней пути апоптоза [27], [28], блокирование ангиогенеза опухоли [29], и ингибирующие внутриклеточных путей реагирования на стресс [30]. Поскольку ингибиторы HDAC имеют глобальные эффекты на экспрессию генов, они могут повлиять на еще нераскрытые клеточные процессы [31], [32]. В клинических условиях, ингибиторы HDAC были в основном применяется для гематологических злокачественных новообразований, но клинические испытания в солидных опухолях продолжаются. Недавнее исследование, поддерживая наших в пробирке
результаты показали терапевтическую эффективность ингибиторов HDAC на образцах рака желудка человека с помощью анализа histoculture реакции лекарственного средства [33]. Тем не менее, она остается нераскрытым, могут ли конкретные молекулярные определенные подгруппы предсказать ответ или сопротивление ингибиторов HDAC. Кроме того, применение потенциально полезных биомаркеров все еще имеет ряд ограничений [34].
<Р> Связь Карта по-прежнему трудно оценить, пока мы не можем оценить, в какой степени геномные сигнатуры, полученные из в пробирке
эксперименты перепросматривать сложности заболевания человека. Несмотря на то, Связь Карта содержит более 7000 профилей экспрессии представляющих 1,309 соединений, его подход все еще имеет дело с некоторыми ограничениями, такими как ограниченное количество данных клеточных линий (MCF7, PC3 и т.д.) и незнании микроокружения влияний от человеческого тела [16] , Кроме того, профили экспрессии генов, полученные из обработки культивируемых клетках человека не могут быть соотнесены с виво
противоопухолевого эффекта в, из-за сложной природы рака. Кроме того, вход только ограниченное количество генов, допускается, что могут исказить полученные результаты. Будущие исследования должны быть решены ли наши результаты, полученные с помощью CMAP анализа могут быть подтверждены в
естественных условиях желудка модели рака в. Несмотря на эти ограничения, анализ подключения Карта является потенциально полезный метод для новых функций для лекарственных средств, в том числе вориностат, уже используемых в клинике для других целей.
оценки терапевтической эффективности вориностат на раке желудка клеточные линии показали, что этот терапевтический препарат показал антипролиферативное действие при физиологических соответствующих дозах (5 мкМ), которые совместимы с другими публикациями: IC <суб> 50 для AGS и КАТО-III было показано, что, соответственно, 2,9 мкМ и 5,9 мкМ [ ,,,0],35]. Анализ клеточного цикла (рисунок 1б), жизнеспособность клеток и (фиг.1С) апоптотических ответов (Рисунок 1D) показали, что эффекты вориностат показывают расхождение в различных желудочных линиях раковых клеток, индукции апоптоза в клетках AGS и G2 /M ареста в КАТО -III клетки, соответственно. Различие в генетической /мутационный фоне клеточных линий может объяснить расхождение.
<Р> анализ микрочипов экспрессии генов сравнения Vorinostat-обработанных и необработанных желудка линии клеток рака показали, что этот препарат индуцированные аутофагии, что согласуется с предыдущим отчеты в других линиях раковых клеток [20], [21]. Поскольку оба индукции и ингибирование аутофагии может иметь терапевтический эффект [22], [23], мы также оценили роль аутофагии в раковых клетках желудка после лечения Vorinostat. Ингибирование автофагию с использованием хорошо известного антималярийную препарат, хлорохин [21] и с помощью миРНК против Beclin-1 приводило к снижению жизнеспособности клеток желудка линий в присутствии вориностат, предполагая автофагию активируется в качестве защитной реакции, выживших после обработки вориностат (Рисунок 5). Таким образом, комбинируя противораковые агенты, такие как вориностат и ингибиторов аутофагии может обеспечить терапевтическое преимущество в борьбе с раком желудка.
<Р> Для идентификации Vorinostat индуцированных генов подписи, мы оценивали профили экспрессии генов AGS и КАТО-III клетки линии после лечения Vorinostat. Выражение 1774 и 355 генов была обратной (&циклопентилпурин 2-кратный, р &л; 0,001) в клеточных линиях AGS и КАТО-III, соответственно. Это говорит о том, что АГС клеточная линия была более уязвимой, чем КАТО-III для лечения вориностат в отношении экспрессии генов. Это проявление может объяснить чувствительность клеток к AGS вориностат. Мы обнаружили, что Vorinostat существенно изменили экспрессию набора 140 генов в обоих AGS и линий КАТО-III клеток.
Верхняя эндоскопия
Недавно обнаруженные крупные фаги стирают границу между жизнью и неживой
Исследователи идентифицируют бактерии с активностью против SARS-CoV-2 in vitro:Dolosigranulum pigrum.
COVID-19:как выглядит болезнь
Потеря микробиома в результате использования антибиотиков влияет на реакцию на вакцину против гриппа
Мужчины, которые едят йогурт два раза в неделю, реже заболевают раком кишечника.
Всегда ли гипертония приводит к тяжелой форме COVID-19?
Вызвано инфекционным агентом, тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), коронавирусное заболевание 2019 года (COVID-19) часто бывает более тяжелым у людей с сопутствующими забол
Устойчивость к антибиотикам удвоится всего за два десятилетия
Устойчивость к антибиотикам представляет собой серьезную проблему для многих ранее излечимых инфекционных заболеваний. В настоящий момент, Доказано, что устойчивость к антибиотикам растет гораздо быст
Заболевания десен и риск рака пищевода и желудка
Американские исследователи опубликовали свои новые данные о заболеваниях десен в исследовательском письме в последнем выпуске журнала. Кишечник названный, Парадантоз, потеря зуба, и риск аденокарцин