PLoS ONE: genų ekspresijos Parašas analizė nustato vorinostatas kaip terapija kandidatinį skrandžio vėžio

Anotacija

Fonas

Skrandžio vėžys tebėra vienas iš kruvinų vėžio pasaulyje ir Todėl taip labai svarbus identifikavimas naujų vaistų, skirtų šios vėžio rūšies yra. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti ir patvirtinti terapinio agento, kuris gali pagerinti skrandžio vėžiu sergančių pacientų rezultatų ateityje.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Naudojant mikrogardeliq technologiją, mes sukurtas geną išraiška aprašymą žmogaus skrandžio vėžio konkrečių genų iš žmogaus skrandžio vėžio audinių pavyzdžius. Mes naudojome šį profilį plačiąja instituto Ryšiai Žemėlapis analizę, siekdama nustatyti kandidates gydomųjų junginių skrandžio vėžio. Mes nustatėme, histono deacetilazės inhibitorius, vorinostato kaip švino junginys ir todėl galimą terapinį narkotiką skrandžio vėžio. Vorinostatas sukeltas tiek apoptozę ir autofagija skrandžio vėžio ląstelių linijas. Farmakologinių ir genetinis slopinimas autofagija tačiau padidėjo gydomąjį veiksmingumą vorinostatas, nurodant, kad iš vorinostatas kartu su autofagija inhibitoriais gali terapiškai būti labiau naudingas. Be to, genų ekspresijos analizė skrandžio vėžio nustatė genų ( ITGB5, TYMS, myb, APOC1, CBX5, PLA2G2A, parsisiųsti ir KIF20A
), kurių raiška buvo padidėjusi skrandžio naviko audinyje ir kolekcijos downregulated daugiau nei 2 kartus pagal vorinostato gydymui skrandžio vėžio ląstelių linijų. Priešingai, SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1, parsisiųsti ir NQO1
pasireiškia atvirkštinis modelis.

Išvados /Reikšmė

Mes parodėme, kad analizė genų ekspresijos parašas gali atstovauti besiformuojančią požiūrį atrasti terapinių agentų skrandžio vėžys, pavyzdžiui, vorinostatas. Pakitusi genų ekspresijos po vorinostatas gydymo stebėjimas gali pateikti clue identifikuoti molekulinį mechanizmą vorinostatas ir tuos pacientus, tikėtina, kad naudos iš vorinostatas gydymo

Citation:. CLAERHOUT S Lim JY, Choi W Park YY, kim K, kim SB, ir kt. (2011) Genų ekspresija Parašas analizė nustato Vorinostat kaip terapija kandidatinį skrandžio vėžio. PLoS ONE 6 (9): e24662. Doi: 10,1371 /journal.pone.0024662

redaktorius David L. McCormick, IIT tyrimų institutas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Kovo 29, 2011 m Priimtas rugpjūčio 16, 2011 m Paskelbta: Spalis 9, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 CLAERHOUT et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Finansavimu AB kaip Odyssey bendradarbis parėmė Odyssey programa ir Teodoras N. įstatymo Endowment for Mokslo pasiekimas Texas MD Anderson Cancer Center universitete. Šis darbas taip pat parėmė lėšomis 2009 Internal Medicine Akademinių tyrimų fondo ir pagrindinio mokslo tyrimų programa, per Nacionalinės mokslinių tyrimų fondo Korėjos finansuojamų švietimo, mokslo ir technologijų (Nr 2.010-0.024.248) ministerijos. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties pasaulyje [1], su bendro išgyvenamumo maždaug 10 mėnesių [2] - [4]. Gydymas skrandžio vėžiu gali būti chemoterapija, chirurgija ir radioterapija. Deja, dabartiniai chemoterapijos pagrindu gydymo išplitusiu skrandžio vėžiu įrodyti nuviliantys rezultatai [2] - [4]. Iš tiesų, visiškai remisijos yra reti arba tik trukti labai trumpai.

Keletas tiksliniai agentai, suteikia išgyvenimo pranašumų kitų rūšių vėžio buvo tiriama skrandžio vėžio. O kai kurie pirmieji klinikinių tyrimų naudojant kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptoriaus (VEGFR) ir epitelio augimo faktoriaus receptorių (EGFR) -1 inhibitoriai, pavyzdžiui, cetuksimabo ir bevacizumabo, parodė, šiek tiek veiklą, yra retai faktinė išlikimo nauda pacientų [5] , [6]. Viena iš priežasčių, gali būti, kad šie tyrimai nebuvo atrinkti pacientus pagal biožymeklių buvimą. Pastaruoju metu skrandžio vėžys (Toga) teismo Trastuzumabas pažymėjo, kad trastuzumabo į chemoterapiją buvo statistiškai reikšmingai pagerino išgyvenimo iki ligos progresavimo (IBP) ir bendrojo išgyvenamumo (OS) su maždaug 20% ​​pacientų su skleidžiama skrandžio ir gastroezofaginio (GE) jungiamosios navikai ekspresija HER2 [7]. Tai pabrėžia būtinybę tikslingai biologinės terapijos poreikį ir už biologinių žymenų paiešką atrinkti pacientus klinikinių tyrimų, kurie gali gauti naudos išlikimą. Nepaisant tam tikros potencialių taikinių, įskaitant HER2 [8], [9], šių biologiškai tikslinių gydymo veiksmingumas nėra žinoma ir yra standartinio tikslinės terapijos skrandžio vėžio trūksta įrodymų. Dėl biologinio heterogeniškumo skrandžio vėžio, tai tikėtina, kad ten yra vienas "stebuklinga" išgydyti. Molekuliniai žymenys bus taip svarbu, kad ateityje prognozuoti pacientų rezultatus ir siuvimo gydymo pagal individualius biologija.

ieškant biologinių žymenų, genų ekspresijos parašas analizė buvo naudojama įvairiose srityse, pavyzdžiui, už nušviečiantis mechanizmai biologinių takais [10], klasifikavimas potipių ligos [11], prognozavo vėžio prognozę [12] ir profiliavimo genų ekspresiją, reaguojant į konkrečius vaistus [13], [14]. Genų ekspresiją parašas analizė gali būti atliekama naudojant plačiąja Instituto Ryšiai Žemėlapis (http://www.broadinstitute.org/cmap). Sujungimas Žemėlapis siekiama sukurti žemėlapį, kuris jungia genų ekspresijos modelius, susijusius su liga, kad pagamintų narkotikų kandidatų ir genetinių manipuliacijų [15], [16] atitinkamomis modelius. Tai sistemos požiūris leidžia junginiai turi būti tikrinami prieš genomo ligų parašų, o ne iš anksto nustatytą rinkinį tikslinių genų. Narkotikai yra suporuotas su ligomis, naudojant sudėtingus modelio atitikimo metodus aukšto lygio skiriamosios gebos ir specifiškumo. Nors jis palieka daug neatsakytų klausimų, Sujungimas Žemėlapis parodė, kad genomo parašas analizė gali būti naudojama atpažinti narkotikus su bendromis priemonėmis veiksmų, atrasti nežinomų mechanizmų veikimo ir nustatyti galimus naujus terapija [15], [16].

šio tyrimo tikslas buvo nustatyti potencialius naujus terapijoje skrandžio vėžio gydymui. Norėdami tai padaryti, mes pirmą kartą analizavo genomo parašas žmogaus skrandžio vėžio. Gautas skrandžio vėžio genas parašas buvo naudojamas silikochromatas
įdarbinant Ryšiai Medis analizę, siekdama nustatyti terapinius agentus, kurie potencialiai gali būti veiksmingas prieš šios vėžio rūšies. Mes taip pat patvirtintas viršų Narkotikus savo veiksmingumo skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes nustatėme, kad vorinostato, kaip potencialus naujas vaistas, sukeltas tiek apoptozės ir autofagija skrandžio vėžio ląsteles. Kartu, šis tyrimas rodo, kad Sujungimas žemėlapis analizė gali būti naudojama terapinių agentų, identifikavimo, kuris gali būti sėkmingai esant skrandžio vėžio pogrupyje gydymui.

METODAI

analizė mikrogardelių duomenų

Sujungimas Žemėlapis analizės, mes panaudojome mikrogardeliq duomenis 65 skrandžio vėžiu sergančių pacientų, įskaitant 65 vėžio ir 19 normalių skrandžio audinių, kurie buvo gauti iš mūsų ankstesnių darbų, Yonsei duomenis [17]. Naviko egzemplioriai buvo renkami iš skrandžio vėžiu pacientams, kuriems atliekama pašalintas skrandis kaip pirminio valymo. Audinio mėginiai buvo ištirti patologams tuo surinkimo metu ir saugomi -80 ° C į audinių banko iki eksperimento pradžios. Iš viso RNR buvo išskirta iš šaldytos audinių naudojant mirVana RNR išskyrimas ženklinimo komplektas (Ambion, Inc). Pirminis Mikrogardelė duomenys yra prieinami ncbi anketa genų ekspresijos Omnibus viešoje duomenų bazėje (mikrogardeliq platforma, GPL6884; Mikrogardelė duomenų, GSE 13.861). Kitas genų ekspresijos profilis buvo gauti iš 69 skrandžio audinių pavyzdžių, taip pat 38 vėžio ir 31 ne vėžio stromos, iš Stanfordo mikrogardeliq duomenų bazę (http://smd.stanford.edu, GSE13911), Stanfordo duomenis. Skrandžio vėžio konkrečiai genai atrinko BRB-ArrayTools versija 3.6.1 (biometrinių tyrimų padalinio, Nacionalinio vėžio instituto, Bethesda, MD). Klasė palyginimas naudojant du imties t-testą (reikšmę < 0,001 10,000 atsitiktinai permutation) nustatė skrandžio vėžys konkrečius genus ir genų, kurių galvoje išraiška intensyvumas buvo pakeistas bent du kartus, palyginti su vidutinis normalaus audinio genų ekspresiją buvo atrinkti
.

Ryšiai Žemėlapis analizė

Jei nustatyti galimus vaistus orientacijos skrandžio vėžio, genų sąrašus viršų 500 iki reguliuojama ir top 500 žemyn reguliuojamų genų nuo skrandžio vėžio konkrečių genų buvo naudojami (lentelė S1). Sujungimas Žemėlapis analizė buvo atlikta per Web sąsają (http://www.broadinstitute.org/cmap), naudojant variantą, kurti 02, kuriame yra daugiau nei 7000 ekspresijos profilius atstovaujantys poveikį 1,309 junginius kelių išauginti žmogaus ląstelių [15], [16]. Sujungimas žemėlapis rodo funkcinius ryšius tarp narkotikų, genų ir ligos. Vaistai, kurie gamina ligas mėgdžiodami genų parašus gali padėti nustatyti kelius, kurie atspindi galimą terapinį tikslus šios ligos. Priešingai, narkotikai, kurie sužadina "Reverse" parašas, t.y. pokyčius genų ekspresijos priešinga kryptimi, kad stebimas ligos būklę, gali atstovauti naujų terapinių agentų. agentai kandidatės prieš konkrečią ligą, gali būti pripažįstamas taikant specifinių ligos genų ekspresijos profilio su Ryšiai Žemėlapis analizė. Mes pasirinkome kandidates narkotikų įteisinimo in vitro
apie ryšį rezultatą, koreliacija, ir P-verte.

Chemija ir ląstelių kultūros

Vorinostat buvo gauta iš Merck ir parengta kaip pradinio tirpalo dlmetilsulfokside (DMSO). Chlorokvino ir bafilomycin A1 (Sigma) buvo ištirpinta atitinkamai vandens ir DMSO. Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos "AGS, NVI-N87 ir KATO III buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūrų banką, jam buvo išlaikytas atsižvelgiant į jų rekomendacijas. Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo, 100 U penicilino, ir 100 mikrogramų /ml streptomicino 37 ° C temperatūroje 5% CO _2.

Ląstelių augimas, gyvybingumas ir ląstelės ciklo tyrimai

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromidas (MTT) Analizės, MTT buvo ištirpinta PBS esant 5 mg /ml. Apie 5 × 10 ^{3 ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių plokšteles ir leidžiama pridėti naktį. tada kultūrinė terpė buvo pakeistas su šviežių terpėje, turinčioje nurodytus koncentracija vorinostato arba DMSO. Po to, kai 72 h, buvo įtraukta 20 pL MTT tirpalą, o plokštelės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje iki 4 h. Po inkubacijos 100 įxL DMSO buvo įtraukta į ištirptų formazano ir absorbcija buvo skaityti 570 nm, naudojant spektrofotometru microplate skaitytuvas (Vmax kinetinę microplate skaitytoją, molekulinė įrenginiais). Eksperimentai buvo atliekamas tris kartus.}

metilvioletinio dažymo, ląstelės buvo gydomi 12 h, vidutinės buvo pašalintas, ir ląstelės buvo išplauti su PBS, ir inkubuojami 30 min su 0,5% violetinei (į 20% metanolio ir 80% du kartus distiliuotas vanduo). Po to ląstelės buvo tris kartus plaunamos PBS. Likusi metilvioletinio buvo ekstrahuojamas acto rūgšties 5 min, ir optinis tankis buvo matuojamas 595 nm, naudojant Spektrofotometriškai mikroplokštelės skaitytuvą.

Norint nustatyti ląstelių gyvybingumo, ląstelės buvo inkubuojamos su vorinostato 72 h. tada prisitvirtinę ląstelės buvo atskirtas nuo kultūros plokščių pagal trypsinization ir kartu su kintama ląstelių, centrifuguoti ir suspenduotos 500 pL propidiumo jodido (PI) -exclusive tirpalo (ne ląstelių membranos Penetrating) 15 min, esant 4 ° C temperatūroje. Dėmėti ląstelės buvo stebimas tėkmės citometrijos (Beckman Coulter "Cytomics FC 500).

ląstelės ciklo analizės, ląstelės buvo inkubuojami su vorinostatas 24 h, surinkti ir sustabdė 500 įxL hipotoninį tirpalo (0,1% natrio citrato, 0,1% Triton X-100, 100 mikrogramų /ml RNazės ir 50 mikrogramai /ml PI) 15 min, esant 4 ° C temperatūroje. PI-tamsintas ląstelės buvo stebimas tėkmės citometrijos. Mobilusis ciklas buvo analizuojami MultiCycle AV programinės įrangos.

RNR išskyrimas ir mikrogardeliq eksperimentai

RNR išskyrimas ir mikrogardeliq eksperimentai buvo atliekami pagal protokolą kaip anksčiau aprašyta [17]. Iš viso RNR buvo išskirta iš skrandžio vėžio ląstelių linijų su arba be vorinostatas gydymo naudojant mirVana RNR išskyrimo rinkinys (Ambion, TX, Jungtinės Amerikos Valstijos). Iš didelio RNR frakcija vientisumas buvo nustatyta su Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, JAV), kaip iRNR kokybės kontrolės pakaitalas. Iš viso RNR buvo paženklintas ir hibridizuoj žmogaus HT12 V.3 raiškos BeadChips pagal gamintojo protokolai (ILLUMINA, CA, JAV). Po BeadChips nuskaityta su ILLUMINA BeadArray Reader mikrogardeliq duomenys buvo normalizuotas naudojant Kvantas normalizavimo metodą linijinės modelių mikrogardeliq duomenų paketą R kalbinę aplinką [18]. Sąvoka lygis kiekvieno geno buvo pertvarkyta į žurnalą _{2 baze prieš tolesnei analizei. Klasterinė analizė buvo atlikta su klasterio ir TREEVIEW [19].}

Vakarų dėmė analizė

Ląstelės buvo pavogta vidutinio ir susuktų žemyn, ir baltymai buvo izoliuotas naudojant lizės buferiniame tirpale (50 mm pločio HEPES, 150 mm NaCl, 1 mM EGTA ir 10 mM natrio pirofosfatas (pH 7,4)), kuriame yra 100 mM Naf "," 10% glicerolio, 1,5 mM MgCl _{2, 1% Triton X-100 ir proteazės inhibitorius (Roche). Ekstraktai buvo inkubuojami ant ledo 20 min ir susuktų žemyn 20800 g 20 min. Baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant BCA baltymų Bandymo reagento (Pierce). Lygios sumos baltymų iš kiekvieno mėginio buvo atskirtos elektroforezės būdu per SDS-PAGE ir perkelti į Hybond-C Super membranos (Amersham Pharmacia Biotech). Membranos buvo užblokuotas 1 valandą, o esant kambario temperatūrai Tris-buferio druskų tirpalu, kurių sudėtyje yra 0,1% Tween-20 ir 5% Nonfat sauso pieno. Membranos buvo inkubuojami per naktį 4 ° C su pirminiais antikūnais, praskiesto 5% Nonfat sauso pieno arba 5% BSA 1 × Tris-buferinis tirpalas plius 0,1% Tween-20. buvo naudojamas antikūnų LC3 (Novus Biologicals), aktyvaus kaspazės-3 (Epitomics) ir 62 psl (BD Biosciences). Antikūnų prieš alfa-tubulino ir beclin-1 buvo iš ląstelių signalizacijos technologijos; antikūnas prieš beta-aktino buvo iš Sigma. tada Membranos buvo plaunamos ir inkubuojami 1 h kambario temperatūroje su peroksidaze konjuguotų antrinio antikūno (Cell signalines technologijos). Baltymų juostos buvo ryškinamos naudojant sustiprintą chemiliuminescenci kaip aprašyta gamintojo (GE Healthcare ").}

siRNR transfekcija

siRNR taikinys seka beclin-1, nontargeting siRNR (Risc Laisvas) ir Dharmafect 1 buvo perkamos iš Dharmacon. Ląstelės buvo pasėjamos 10 cm patiekalų ir perkeltų su siRNA 24 val vėliau pagal gamintojo protokolą. Kitą dieną, ląstelės buvo tripsinizuojamos ir pasėjamos į 6-cm arba 96-duobučių lėkštelėse gautų tą patį transfekciją efektyvumą. Baltymo ekspresija koncentracija buvo nustatoma pagal Vakarų dėmė analizė.

Transmisijos elektronų mikroskopija

Mėginiai buvo nustatyta su tirpalu, kurio sudėtyje 3% gluteraldehyde plius 2% paraformaldehidus 0,1 M kakodilato buferiu, kurio pH 7.3, už 1 valandą. Po to, kai fiksavimo, mėginiai buvo išplauta ir apdorota su 0,1% "Millipore-filtruoto kakodilato buferinis tanino rūgšties, pinigų skaičiaus su 1% buferiniame osmio tetrokside 30 min, ir nudažomi en bloc su 1%" Millipore-filtruoto uranilo acetato. Mėginiai buvo dehidratuotas Didinamos koncentracijos etanolio, infiltravo, ir įdėta į LX-112 terpėje. Mėginiai buvo polimerintas į 70 ° C orkaitėje 2 dienas. Plono skyriai buvo supjaustyti Leica "Ultracut Mikrotoms (Leica, Deerfield, IL), tamsintas su uranilo acetato ir sukelti citrato Leica EM STAINER, ir tiriami JEM 1010 perdavimo elektronų mikroskopu (JEOL, USA, Inc Peabody, MA ) vis didesniu kaip 80 kV įtampos. Skaitmeniniai vaizdai buvo gauti naudojant AMT vizualizavimo sistema (Advanced mikroskopijos metodai Corp ", Danvers, MA).

Rezultatai

Genų ekspresiją parašas skrandžio vėžio

1 lentelė atstovauja savybes kad iš Yonsei duomenų pacientams [17]. Skrandžio vėžio daugiausia buvo įsikūręs distalinės skrandžio ir III etapas /IV. Naudojant genų ekspresijos microarray duomenis tiems pacientams, mes nustatėme 3,360 naviko konkrečiai genai, kurių galvoje išraiška intensyvumas buvo pakeistas bent du kartus, palyginti su vidutinis normalaus audinio genų ekspresiją ( P pervežimas < 0,001, S1 paveiksle ). Ši 3,360 genų (ty skrandžio vėžys konkrečių parašas) rinkinys buvo naudojamas dar silikochromatas pervežimas tikrinant galimas terapinių vaistų nuo skrandžio vėžio.

Ryšiai Žemėlapis analizė identifikuoja potencialius narkotikų orientacijos skrandžio vėžiu

Jei nustatyti galimus vaistus orientacija skrandžio vėžys, skrandžio vėžys specifinis parašas buvo naudojamas kaip įvesties užklausą į Sujungimai žemėlapis, kaip aprašyta skiltyje "metodas". Mes specialiai ieškojome junginių, kurie turėjo parašą atvirkščiai susijęs su bendru skrandžio vėžio konkrečių pasirašymo ir nustatė kelis vaistus, kurie yra apibendrinti 2 lentelėje buvo įkurta šalių kandidačių agentų reitingas remiasi atvirkštinės koreliacijos vertę ir p-reikšmė. 2 lentelė (2-4 stulpeliai) rodo aukščiausią reitingą junginiai iš Yonsei duomenis. Ryšiai Žemėlapis analizė parodė, kad histono deacetilazės (HDAC) inhibitoriais, įskaitant vorinostatas ir trichostatin A atstovauti potencialius kandidatus nukreipti skrandžio vėžiu. Fosfatidil-3-kinazės inhibitorius LY294002, The fenotiazinas trifluoperazino ir šilumos šoko baltymas inhibitorius tanespimycin taip pat buvo nustatyta, kad kandidatas tikslinių agentai skrandžio vėžio. Be to, mes patvirtinti mūsų išvadas naudojant nepriklausomą rinkinį genų ekspresijos profilio duomenis iš Stanfordo mikrogardeliq duomenų bazę (2 lentelė; Stanfordo duomenis; 5-7 stulpelius). Ryšiai Žemėlapis analizė šio duomenų rinkinio patvirtino vorinostato kaip aukščiausią reitingą kandidato. Taigi, Ryšiai Žemėlapis analizė nustatė vorinostato kaip potencialus terapinio agento skrandžio vėžio.

Vorinostat rodo terapinis veiksmingumas in vitro
skrandžio vėžio ląstelių linijas

Jei įvertinti terapinį veiksmingumas vorinostatas, mes įvertino nustatytų skrandžio vėžio ląstelių linijų (AGS, Kato-III, NVI-N87) po 72 h vorinostatas gydymas, naudojant MTT augimą. Palyginti su neapdorotų ląstelių, vorinostatas žymiai slopinamas ląstelių gyvybingumo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu visose skrandžio vėžio ląstelių linijų (1A pav). Mes patvirtino ląstelių gyvybingumo sumažėjimas ląstelių ciklo analizės AGS ir KATO-III vėžio ląsteles. Mes parodėme, kad gydymas vorinostatas (5 mkm) 24 val sukeltas labai padidėjo sub-G1 dalis AGS ląstelių, lyginant su kontrole (2.3 ± 0,07%, palyginti su 39,2 ± 0,99%, atitinkamai P
< 0,01), nurodant ląstelių mirtis (1b paveikslėlis) indukcijos. Priešingai, sub-G1 "dalis vorinostatas elgiamasi KATO-III ląstelės nebuvo paveiktas (1B pav), kadangi G2 proporcingai /M ląstelės žymiai išaugo (21,4 ± 1,91% vs 29,3 ± 0,35% p
= 0,044), indikaciniai ląstelių ciklo arešto. Mes taip pat išbandyti ląstelių gyvybingumas, naudojant PI-atskirtį. Mes elgiamasi AGS ir KATO-III ląsteles 5 mkm vorinostatas 72 h ir juos įvertino tėkmės citometrijos (1c pav). Negyvų ląstelių, kurios turi mažą priekį išsklaidyti ir aukštą pusėje sklaidą suma buvo gerokai padidėjo AGS ląstelių (12,4 ± 4,3% ir 79,4 ± 5,7%), o taip pat Kato-III ląstelių, palyginti su kontroline ląsteles (8,7 ± 0,6% vs 46,8 ± 2,1%). Mes pagaliau išnagrinėjo apoptozės indukcija po vorinostatas gydymo AGS ir KATO-III skrandžio vėžio ląstelių linijas, naudodamos immunoblot. Vorinostatas padidėjo apoptozę, kaip vertinama kaspaze 3 skaldymu, kad AGS ląstelių ir kiek mažesniu mastu Kato-III ląstelių (1d pav.)

Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad vorinostatas turi proliferaciją poveikį skrandžio vėžio ląstelių linijų, sukeldami apoptozę AGS ląstelių ir G2 /M ląstelės ciklo arešto Kato-III ląsteles.

Pasaulinė genų ekspresijos analizė skrandžio vėžio ląstelių linijų AGS ir KATO-III po vorinostatas gydymo

analizuoti vorinostatas poveikį pasaulio genų ekspresiją, AGS ir KATO-III skrandžio vėžio ląstelės buvo gydomi 5 pm vorinostatas 48 valandas ir Mikrogardelė analizė buvo atlikta. Neprižiūrimų klasteris analizė microarray duomenų po vorinostatas gydymo parodė, kad AGS ir KATO-III ląstelės susitelkę su tuo pačiu ląstelių linijos, neatsižvelgiant į vorinostatas gydymo (2a pav.) Kadangi autofagija buvo pranešta, kad tam tikrą vaidmenį vorinostatas sukeltas poveikis kitų vėžio [20], [21], mes atlikome prižiūrimą analizę autofagija susijusių genų rinkinį (80 genų ir 149 imtimis; Stalo s2). Vorinostatas gydytų skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo sugrupuotos (2B pav), nurodant, kad autofagija indukcija yra svarbi savybė vorinostatas skrandžio vėžio linijas.

slopinimas autofagija pagerina vorinostatas veiksmingumą skrandžio vėžio ląstelių

Kadangi autofagija gali turėti vaidmenį tiek vėžio ląstelių išgyvenimo ir vėžio ląstelių mirtis po gydymo nuo narkomanijos [22], [23], mes toliau vertinti šio proceso prisideda prie vorinostatas poveikį skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes funkciškai įvertinti šį procesą Imunoblotingas į autofagija žymeklio mikrovamzdelių-susijęs baltymas 1 lengvosios grandinės 3 (LC3). Vorinostatas gydytų KATO-III ląsteles ir, kiek mažesniu mastu AGS ląsteles, parodė aiškų kaupimosi ir greičiau migravimas lipidated forma LC3 (LC3-II) (3a pav.) Kaupimo LC3-II, gali būti iš abiejų ląstelę autophagosome formavimo ar užsikimšimas autophagic degradacijos LC3-II [24], [25]. Todėl analizuojami vorinostatas gydytų ląsteles 62 psl degradacija, kaip autophagic srauto [24] persekiotoją, ir mes nustatėme į 62 psl baltymų kiekiai vorinostatas paveiktų ląstelių sumažėjimas, palyginti su laiku suderintos neapdorotas vėžinės ląstelės (3a pav.) Be to, cotreatment Vorinostat su bafilomycin A1 (BafA1), kurio autophagosome-Lizosomos sintezės inhibitorius, dar labiau padidėjo LC3-II kaupimosi (3b pav), suderinama su vorinostatas skatinančius autophagic srautą, o ne blokuoja skilimo pajėgumą autophagolysomes. Elektronų mikroskopija (EM) yra jautri, kiekybinė ir galutinis metodas aptikti autofagija [24]. Suderinamas su Vakarų dėmė duomenimis, EM analizė parodė, kad vorinostatas ženkliai išaugo autophagosome formavimas AGS ląstelių (4B ir B pav '), palyginti su nekontroliuojamos ląstelių (4a ir skaičius ").

Jei ištirti, ar kaupimo autophagosomes apsaugo ląsteles nuo ląstelių streso sukeltu vorinostatas, mes slopino autofagija procesą naudojant farmakologinį inhibitoriais chlorochinu sirnr (siRNA) prieš beclin-1. Papildymas chlorochinu į vorinostatas gydytų AGS ir KATO-III ląstelių lėmė dozės priklausoma sumažėjęs gyvybingumas (5a pav.) Gyvybingumo sumažėjimas buvo patvirtinta Kato-III ląstelių gydomiems beclin-1 siRNA (5b pav.) Kartu duomenys rodo, kad slopinimas vorinostatas sukeltos autofagija gali pagerinti vorinostatas gydymo skrandžio vėžio ląstelių efektyvumą.

Vorinostat keičia genų parašas žmogaus skrandžio vėžio ląstelių

suprasti poveikį vorinostatas nuo genų ekspresiją skrandžio vėžio ląstelių linijų, mes atlikome mikrogardeliq analizę vorinostatas elgiamasi AGS ir KATO-III skrandžio vėžio ląstelių linijas (2 pav.). Mūsų analizė parodė reikšmingą genomo skirtumus tarp negydytų ir vorinostatas gydytų skrandžio vėžio ląstelių (AGS ir KATO-III). Po vorinostatas gydymo, kad 1014 genų ekspresija buvo padidintas, o 760 genų ekspresija buvo sumažėjo AGS ląstelių linija. Kato-III ląstelių linijos, 164 genai buvo iki ir 191 genai buvo žemyn reguliuojama (du kartus skirtumą P
< 0,001). Vorinostatas gerokai pakeitė 140 genų abiejų AGS ir KATO-III ląstelių linijas (vorinostatas specifinis genas parašas) išraiška. Genai, kurios buvo dauguma pasikeitęs po vorinostatas gydymo buvo nustatyta, kad SPANXA1, SPANXA2, vgf, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK
(> 4 kartus iki -regulation) ir MUC1, IFITM1, ANKRD37
(>. 4 kartus žemyn reguliavimą)

Be to, mes skirta nustatyti žymenų kandidatus, kurie negali prognozuoti vorinostatas jautrumą žmogaus skrandžio vėžiu sergančių pacientų , Todėl mes kartu su pakeista genų vorinostatas gydomi skrandžio vėžio ląstelių linijų (vorinostatas specifinis genas parašas) ir dviejų žmogaus skrandžio vėžio parašų, gautų iš Yosei ir Stanfordo duomenų naudojant Veno diagrama analizė rinkinį. Mes nustatėme, kad santykiniai ekspresijos lygis 12 genų buvo atstatomi vorinostatas gydymo (6 paveikslas). Iš šių 12 genų, 7 genai labai išreikštas skrandžio vėžio audiniuose buvo žemyn reguliuojama ( ITGB5
TYMS
myb
, APOC1
, CBX5
PLA2G2A
KIF20A
) ir 5 žemos išreiškė genai buvo iki reguliuojama po vorinostatas gydymo ( SCGB2A1
TCN1
CFD
APLP1
NQO1
(3 lentelė).

Diskusijos

Mūsų rezultatai rodo, kad pasaulinė žmogaus skrandžio vėžio genas parašas gali būti naudinga surasti gydomąsias medžiagas, kad verčiau genomo parašas skrandžio vėžio, o ne orientacija vieną ar du konkrečius genus. Naudojant Sujungimas Žemėlapis, mes nustatėme, kad HDAC inhibitorių, tokių kaip vorinostatas ir trichostatin A, turėjo atvirkščiai koreliuoja genas parašas palyginti su skrandžio vėžio genų parašu, todėl gali būti švino terapiniai kandidatai skrandžio vėžio. in vitro
vertinimas gydomajam poveikiui vorinostatas atskleidė, kad šis gydymo narkotikų slopinamas augimas skirtingose ​​skrandžio vėžio Mobilaus ryšio linijos. Šalia jos slopina proliferaciją poveikį, vorinostatas pat aktyvinama autofagija konkrečių genų. Slopinimas vorinostatas sukeltos autofagija lėmė dar labiau sumažinti gyvybingumą. Be to, kartu analizė skrandžio vėžio ląstelių linijų gydomiems vorinostatas ir pavyzdžių skrandžio vėžiu sergančių pacientų parodė, kad vorinostatas pakeitė raiškos lygius dvylikos skrandžio vėžio konkrečių genų rinkinys.

Mūsų rezultatai parodė, kad HDAC inhibitorių, vorinostatas ir trichostatin A buvo geriausi terapiniai kandidatai skrandžio vėžiu, kuris sutinka su idėja, kad HDAC ekspresija skrandžio vėžio audiniuose [26]. Įrodyta HDAC inhibitoriai padidinti acetilinimui iš Histonas, todėl įtakos genų ekspresiją. Šie inhibitoriai akivaizdžių antinavikiniai poveikis stimuliuoja vidinę ir išorinė apoptozę kelią [27], [28], blokavimo naviko angiogenezę [29], ir slopina ląstelėse stresas reagavimo būdai [30]. Kadangi HDAC inhibitoriai turi bendrą poveikį genų ekspresiją, jie gali turėti įtakos dar neatskleistus ląstelių procesus [31], [32]. Klinikinių nustatymų, HDAC inhibitoriai buvo daugiausia taikoma hematologinių piktybinių navikų, tačiau klinikiniai tyrimai solidinių navikų tebevyksta. Neseniai atliktas tyrimas, paremti mūsų in vitro
rezultatai parodė, gydomąjį veiksmingumą HDAC inhibitorių žmogaus skrandžio vėžio mėginių, naudojant histoculture narkotikų reagavimo tyrimą [33]. Tačiau ji dar turi būti neatskleistas, ar specifinių molekulių apibrėžtos pogrupiai gali nuspėti atsakymą arba atsparumą HDAC inhibitoriais. Be to, potencialiai naudingų biologinių žymenų taikymas vis dar turi keletą trūkumų [34].

Ryšiai Žemėlapis išlieka sudėtinga įvertinti, kol mes galime įvertinti, kokiu mastu genomikos parašai gauti iš in vitro
eksperimentai reziumuoti, kad žmogaus ligos sudėtingumo. Nors Ryšiai Žemėlapis yra daugiau nei 7000 raiškos profilius atstovaujančių 1,309 junginius, jo požiūris vis dar susijęs su tam tikrais apribojimais, kaip antai riboto kiekio ląstelių linija duomenimis (MCF7, PC3 ir tt) ir mikroklimato įtaka nežinojimo iš žmogaus kūno [16] , Be to, genų ekspresijos, profiliai, gautos iš išaugintų žmogaus ląstelių gydymas gali būti susijęs su in vivo
priešvėžinio poveikio, dėl to, kad sudėtingos vėžio. Be to, tik ribotą genų įvesties leidžiama, kuris gali pastumti gautus rezultatus. Ateities studijos reikia spręsti, ar mūsų rezultatai, gauti per cmap analizė gali būti patvirtinti, atlikus vivo pervežimas skrandžio vėžio modelį. Nepaisant šių trūkumų, Ryšiai Žemėlapis analizė yra potencialiai naudingas metodas naujų funkcijų narkotikų, įskaitant vorinostatas jau naudojamais klinikoje kitiems tikslams.

In vitro
vertinimo terapinio veiksmingumo vorinostatas skrandžio vėžio ląstelių linijas parodė, kad šis gydymo narkotikų parodė proliferaciją efektą fiziologinėms atitinkamų dozių (5 mkm), suderinama su kitais leidiniais: IC _{50 už AGS ir KATO-III buvo įrodyta, kad būti atitinkamai 2,9 m ir 5,9 mkm [ ,,,0],35]. Analizė ląstelės ciklo (1b pav), ląstelių gyvybingumui ir (1c pav) Apoptozinės atsakymai (1D pav) nurodė, kad vorinostatas poveikis rodo neatitikimą įvairių skrandžio vėžio ląstelių linijas, skatinančius apoptozę AGS ląstelių ir G2 /M arešto Kato -iii ląstelės, atitinkamai. Į genetinės /mutacijos fone ląstelių linijų skirtumas gali sudaryti neatitikimo.}

mikrogardeliq genų ekspresijos analizė lyginant vorinostatas-apdoroto ir neapdoroto skrandžio vėžio ląstelių linijas parodė, kad šis vaistas sukeltų autofagija, kuris yra susitarusi su ankstesnio ataskaitos kitų vėžio ląstelių linijų [20], [21]. Kadangi abi indukcijos ir slopinimo autofagija gali turėti terapinę naudą [22], [23], mes toliau įvertino autofagija vaidmenį skrandžio vėžio ląstelių po vorinostatas gydymą. Slopina autofagija naudojant gerai žinomas maliarijos narkotikų, chlorochinas [21] ir naudojant siRNA prieš beclin-1 surengė gyvybingumas skrandžio vėžio ląstelių linijose vorinostatas akivaizdoje mažinti, rodo autofagija aktyvuojamas kaip apsauginis išgyvenimo atsakymo po vorinostatas gydymo (5 paveikslas). Taigi derinant priešvėžinių agentų, tokių kaip vorinostatas ir inhibitoriais autofagija galėtų suteikti terapinį pranašumą kovojant su skrandžio vėžiu.

Jei nustatyti vorinostatas sukeltas genų parašą, mes įvertino genų ekspresijos profilius AGS ir KATO-III ląstelių linijos po vorinostatas gydymui. Iš 1774 ir 355 genų išraiška buvo panaikintas (> 2-kartus, p < 0,001) AGS ir KATO-III ląstelių linijų, atitinkamai. Tai rodo, kad AGS ląstelių linija buvo labiau pažeidžiami nei KATO-III-vorinostatas gydymo atžvilgiu genų ekspresiją. Ši išraiška gali paaiškinti AGS ląstelių jautrumą vorinostatas. Mes nustatėme, kad vorinostatas žymiai pasikeitė 140 genų abiejų AGS ir KATO-III ląstelių linijų rinkinio išraišką.

• PLoS ONE: prognostinę reikšmė apoptozę susijusių biologiniams žymenims Kinijos skrandžio vėžys Patients
• PLoS ONE: Genų ekspresijos Parašai galima išskirti skrandžio vėžio rūšių ir Stages