PLoS ONE: Tiltaget Core-fucosylering Bidrager til Malignitet i Gastric Cancer

Abstrakt

Formålet med undersøgelsen er at identificere N-glycan profilering ændringer i forbindelse med mavekræft og undersøge virkningen af ​​kernen-fucosylering på biologiske adfærd af humane gastriske kræftceller. I alt 244 emner, herunder gastrisk kræft, mavesår og sund kontrol blev rekrutteret. N-glycan profilering fra serum og totale proteiner i gastrisk væv blev analyseret ved DNA sequencer-assisteret fluorophor-assisteret kapillarelektroforese. Den overflod af total core-fucosylerede rester og ekspressionen af ​​enzymer involveret i kerne-fucosylering blev analyseret med lectin-blot, kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion, western blot, Immunohistokemisk farvning og lectin-histokemisk farvning. De rekombinante plasmider af BNP-fucose transporter og α-1,6-fucosyltransferase (Fut8) blev konstrueret og transficeret ind gastrisk cancer cellelinjer BGC-823 og SGC-7901. CCK-8 og sårheling assay blev anvendt til at vurdere den funktionelle virkning af kerne-fucosylering modulation på celleproliferation og migration. Karakteristisk serum N-glycan profiler blev fundet i gastrisk cancer. Sammenlignet med den raske kontrol, en trianntenary struktur overflod, peak 9 (NA3Fb), blev øget betydeligt i mavekræft, mens den samlede overflod af kerne-fucosylerede rester (sumfuc) blev reduceret. Core-fucosylerede strukturer, peak6 (NA2F) og peak7 (NA2FB) blev afdøde i gastrisk tumorvæv sammenlignet med den i tilstødende ikke-tumorvæv. Konsekvent, Lens culinaris agglutinin (LCA) -bindende proteiner blev reduceret signifikant i sera fra gastrisk cancer og proteinniveau af Fut8 faldt betydeligt i gastriske tumorvæv sammenlignet med i tilstødende ikke-tumorvæv. Opregulering af BNP-Tr og Fut8 kunne hæmme proliferation, men havde ingen signifikant indflydelse på migration af BGC-823 og SGC-7901 celler. Core-fucosylering er nedreguleret i mavekræft. Opregulering af kerne-fucosylering kunne inhibere proliferation af de humane gastriske cancerceller

Henvisning:. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Du Q, Yi C-H, et al. (2014) Nedsat Core-fucosylering Bidrager til Malignitet i Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10,1371 /journal.pone.0094536

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: August 19, 2013; Accepteret: 17 marts 2014; Udgivet: 14 April, 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.201.697, 81.101.639 og nr 81.271.925); Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (nr 10ZR1439100 og nr 11JC1416400) .De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden mest almindelige årsag til kræft dødsfald på verdensplan [1]. - [3], særlig udbredt i mange asiatiske lande, især Kina [4]. Proteinglycosylering er en af ​​de mest almindelige posttranslationelle modifikationer af proteiner [5]. Glycaner kan bindes til proteiner enten via en amidgruppe (N-bundet glycosylering) eller en hydroxylgruppe (O-bundet glycosylering), som forekommer gennem forskellige biosyntetiske veje og potentielt har uafhængige funktioner [6]. N-bundet glycosylering spiller grundlæggende roller i mange biologiske processer, såsom celleadhæsion, cellemigrering, og signaltransduktion [7]. Unormal ekspression af N-bundne glycoproteiner er blevet observeret i forskellige sygdomme [8] - [10]. Ved grundig karakterisering af N-bundne glycoproteiner og sygdomsassocierede glycosylation ændringer har flere metoder blevet udviklet. I vores tidligere undersøgelse har vi identificeret nogle N-glycan markører i heptatocellular carcinom (HCC) og tyktarmskræft ved hjælp af en kapillær baseret elektroforese kaldet DNA sequencer-assisteret fluorophor-assisteret kapillarelektroforese (DSA-FACE) [11]. Desuden er det blevet rapporteret, at α-1, 6-fucosyltransferase (Fut8) aktivitet og ekspression er forøget i flere humane cancere, hvilket antyder en rolle for dette enzym i tumorudvikling og progression, såsom HCC [12], colorectal cancer [ ,,,0],13], ikke-småcellet lungecancer [14] og i æggestokkene serøs adenocarcinom [15]. Ændret kerne-fucosylering er en af ​​de vigtigste unormal glycosyleret modifikation identificeret i maligniteter. Fut8 katalyserer overførslen af ​​fucose fra Guanosindifosfat (BNP) -fucose til den inderste GlcNAc hybrid og komplekse N-bundne oligosaccharider via en α-1,6-binding, hvilket resulterer i kerne-fucosylerede glycoproteiner [16] - [17] og ændring biologiske funktion deraf glycoproteiner [18]. Selv om mange undersøgelser har rapporteret sammenhængen mellem ændret kerne-fucosylering og andre aggressive tumorer, til vores viden, indflydelse kerne-fucosylering på mavekræft fortsat ukendt. I denne undersøgelse, analyserede vi N-glycan profilering med DSA-FACE i begge serumprøver fra mavekræft, mavesår, raske kontrolpersoner og væv proteiner fra tumorer og tilstødende ikke-tumorer. Så udvide den funktionelle forskning på de identificerede specifikke glycosyleringer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen protokollen blev godkendt af den kinesiske etiske komité for Human Resources på det andet Military Medical University. Alle undersøgelsens deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke.

studiepopulation

I alt 105 patienter med mavekræft (n = 80) og mavesår (n = 25) blev inkluderet fra december 2007 til og oktober 2010 på Changzheng Hospital af Anden Military Medical University (Shanghai, Kina). Alle tilfælde med mavekræft indskrevet blev histopatologisk bekræftet af 2 patologer og sager med mavesår rekrutteret blev bekræftet af gastroscope. Patienter med mavekræft, der fik præoperativ kemoterapi, og som havde andre sygdomme, herunder infektioner blev udelukket fra undersøgelsen. Serumprøver blev opnået før kirurgiske resektioner. For en kontrolgruppe, blev 139 alder matchede, raske frivillige indskrevet fra en pulje af kræft-fri individer, som besøgte det samme hospital for en regelmæssig fysisk behandling, og som meldte sig frivilligt til at deltage i forskning i samme periode. Vi definerede en sund person som en, der blev anset for fri for sygdomme (herunder ingen historie kræft) ved sundhed check-up. Følgende kliniske karakteristika af motiver blev opnået på tidspunktet for fuldblod kollektion. Et resumé af dataene fra disse emner findes i tabel 1. progression af alle patienter med mavekræft blev klassificeret i henhold til Union for International Cancer Control (UICC) TNM mellemstationer kriterier for mavekræft, 13 patienter (16,25%) havde stadie I, 24 patienter (30,00%) havde stadie II, 30 patienter (37,5%) havde stadie III, og 13 patienter (16,25%) havde stadie IV. Den gennemsnitlige alder for alle patienter var 54,35 ± 6,69 herunder 60 mænd og 20 kvinder. Serum blev opsamlet ved anvendelse af en standardprotokol fra fuldblod, behandlet ved centrifugering ved 10.000 g i 20 minutter og opbevaret ved -80 ° C.

N-Glycan profilering fra serumproteiner

serum protein N-glycan analyser blev udført som tidligere [11] beskrevne. Kort fortalt blev N-glycaner stede på proteinerne i 2 pi serum frigivet med peptid N-glycosidase-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, Mass) og derefter mærket med 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulfonsyre (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, Calif) .Sialic syre blev fjernet med Arthrobacter bacter ureafaciens sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, Calif), og de behandlede prøver blev analyseret med DSA-flade teknologi under anvendelse af en kapillær elektroforese-baserede ABI3500 Genetik analysator (Applied Biosystems, Foster City, Calif). De 9 mest intense toppe der blev detekteret i alle prøver (tilsammen, disse toppe tegnede sig for > 90% af de samlede serum N-glycaner) blev analyseret ved hjælp GeneMapper software (Applied Biosystems). Hver struktur af N-glycan blev beskrevet numerisk ved at normalisere sin højde til summen af ​​højderne af alle toppe.

Vævsprøver

Alle væv blev anvendt i overensstemmelse med de institutionelle Review Board regulativer Anden Military Medical University. Vævsprøver blev opnået heraf10 af 80 patienter med gastrisk cancer. Vævsprøver inkluderet 2 skiver, en tumor væv og en tilstødende ikke-tumorvæv. Parrede vævsprøver (ca. 0,5 × 0,5 × 0,5 cm ^{3, duplikeres for hver prøve) udvalgt blev enten straks frosset ved -80 ° C for RNA og protein-ekstraktion eller fikseret i 10% pufret formalin i op til 24 timer og derefter forarbejdet til en paraffinindlejret blok og opbevaret ved stuetemperatur i histokemisk farvning.}

N-Glycan profilering fra væv proteiner og strukturel analyse ved anvendelse exoglycosidase fordøjelse

proteiner blev ekstraheret fra ca. 25 mg frosne vævsprøver . Vævsprøverne blev suspenderet og pestled i lysepuffer indeholdende protease inhibitorer cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Frankrig). Lyserede dele blev fjernet ved centrifugering (12000 g i 10 minutter ved 4 ° C) to gange. Koncentrationen af ​​solubiliserede proteiner blev bestemt under anvendelse af BCA-kit (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), og proteinet prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. I alt 40 ug væv proteiner blev anvendt til at etablere N-glycan profiler med regelmæssig N-Glycan profilering metoden den samme som den udføres i serum er beskrevet ovenfor. For at identificere kerne-α-1, 6-fucosylerede N-glycanstrukturer, et passende antal APTS-mærket N-glycaner blev fordøjet med både Arthrobacter bacter ureafaciens sialidase og bovin nyre α-1, 6-fucosidase (Prozyme, San Leandro, CA , USA). DSA-FACE teknologi blev anvendt til at analysere fordøjelsesprodukter og GeneMapper software blev anvendt til at analysere højden af ​​toppene.

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR Salg

Totale RNA'er blev ekstraheret fra frosne væv og celler, der anvender total RNA-ekstraktion kit ifølge producentens instruktioner (Axygen Biosciences, Hangzhou, Kina). Renheden og koncentrationen af ​​RNA blev bestemt ved spektrofotometer (Eppendorf, Hamburg, Tyskland), og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. CDNA'et blev syntetiseret under anvendelse ReverTra Ace-α-RT-PCR-kittet (Toyobo Co., Osaka, Japan) ifølge producentens instruktioner. Primere blev konstrueret under anvendelse af primeren Express program (Applied Biosystems; sekvenserne er vist i tabel S1). Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved anvendelse af SYBR® Green Real-time PCR Master Mix kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) og blev analyseret på Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR-system (ABI, Foster City, CA, USA) . Alle assays blev gennemført uafhængigt tredobbelt. PCR cycling bestod af denaturering ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 sekunder og ved 59 ° C eller 55 ° C i 15 sekunder, og påvisning i 45 sekunder ved 72 ° C. Den relative mængde af Fut8 eller Guanosindifosfat (BNP) -fucose transporter (BNP-TR) transkripter i hver prøve blev normaliseret til husholdning gen β-actin og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) ved at subtrahere cyklussen. Niveauerne af genekspression blev bestemt ved anvendelse af Delta-Delta Ct-metoden. Absolutte udskrift udtryk værdier uden 40 cykler blev betragtet under påviselige niveauer. Smelte kurver blev kontrolleret for hver reaktion til at garantere, at et enkelt produkt blev amplificeret.

Western blot og lectin-blot

Proteiner blev ekstraheret fra frosne væv med den ovenfor beskrevne procedure, og i alt 50 ug proteiner blev separeret ved elektroforese i 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel (SDS-PAGE). Geler blev farvet med coomassie blå G250 eller proteinerne i gelen blev overført til en nitrocellulosemembran () til påvisning af Fut8 eller procentdelen af ​​kerne-fucosylerede proteiner. For serumprøver blev i alt 85 tilfælde fra gastrisk cancer (n = 80), mavesår (n = 25) og sund kontrol (n = 30), som anvendes til SDS-PAGE og lectin-blot. Membranerne blev blokeret natten over ved 4 ° C med 5% fedtfri mælk protein eller 5% bovint serumalbumin i Tris-bufret saltvand [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI (TBS)] og derefter inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med 1:100 fortyndet anti-humant Fut8 antistof (15C6, anti-humant Fut8, Fujirebio Corp., Japan) eller 5 pg /ml biotinyleret lens culinaris agglutinin A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Calif) i TBS indeholdende 0,05% Tween-20 (TBST-buffer), og derefter inkuberet med en 1:10,000 fortynding af fluorescens-mærkede sekundære antistoffer (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) eller IRDye 800CW-streptavidin (LI-COR Biosciences) i 1 time ved stuetemperatur . Membranerne blev udviklet med Odyssey IR Imaging System. Anti-beta actin (1:2000) blev anvendt til intern reference antistof til western-blot. Oprenset albumin blev anvendt som negativ kontrol for lectin-blot og totalt protein farvet med coomassie blå blev anvendt til at beregne procentdelen af ​​kerne-fucosylerede protein.

immunhistokemisk (IHC) farvning og lectin-histokemisk farvning

De faste vævsprøver indlejret i paraffin blev skåret i 4 mm-syge udsnit til immunhistokemisk farvning for Fut8 og lectin-histokemisk farvning for LCA. Efter at være udsat afparaffinering, rehydrering, endogen peroxidase blokering, og antigen-genvinding (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, autoklav behandlet), blev prøver inkuberet med et monoklonalt muse-antistof mod humant Fut8 (1:100) eller biotinyleret LCA (1 :500) natten over ved 4 ° C og derefter med peberrod peroxidase-konjugeret sekundært antistof eller fluorescein mærket streptavidin ved 37 ° C i 30 minutter. Kerner blev modfarvet med hematoxylin eller DRAQ5. Negativ kontrol bestod af identisk behandlede histologiske snit med muse-IgG til at erstatte musen Fut8.

cellelinjer og kultur

menneskelige gastrisk cancer cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901, blev købt fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences og dyrket ved 37 ° C under 5% CO _{2 i RPMI 1640-medium og DMEM-medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), henholdsvis med 10% FBS, 1% glutamin og 1% antibiotisk løsning.}

Konstruktion af BNP-Tr og Fut8 rekombinante plasmider og transfektion af gastriske kræftceller

pEGFP-N1-BNP-Tr og pEGFP-N1 -Fut8, plasmidvektoren der koder for human BNP-Tr eller Fut8, blev genereret ved at indsætte BNP-Tr eller Fut8 cDNA i en pEGFP-N1 vektor (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), der indeholder en CMV-promotor og SV40 tidlig promotor, samt neomycin /kanamycin resistens genet fra Tn5. Vektoren rygrad indeholder også et SV40 replikationsstartområde i pattedyrceller. Det multiple kloningssted (MCS) er ud for den umiddelbare tidlige promotor af CMV. Det humane BNP-Tr eller Fut8 genet blev klonet fra mRNA ekstraheret med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) fra humant levervæv ved at udføre RT-PCR under anvendelse af primere (Tabel S2) i hvilken Xho I eller Kpn I restriktionssites blev inkluderet, fordøjelse med Xhol eller Kpnl og ligering ind i pEGFP-N1. PEGFP-N1-BNP-Tr eller pEGFP-N1-Fut8 blev transficeret i Escherichia coli DH5a til amplifikation og DNA-sekventering blev anvendt til at sikre nøjagtigheden. Plasmid-DNA blev fremstillet ved anvendelse af Qiagen DNA mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Plasmider blev transficeret ind i de humane gastriske cancercellelinjer, BGC-823 og SGC-7901 ved 80% konfluens og 5 × 10 ^{5 celler per brønd i en seks-brønds plade under anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) ifølge producentens instruktioner. De transficerede celler, som udtrykte målgen blev bekræftet ved kvantitativ RT-PCR.}

Celleproliferationsassay

celleproliferation assays blev udført med Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojin, Japan) ifølge producentens instruktioner. Cellevækst blev overvåget hver 24. timer over 5 dage, og for hvert tidspunkt blev gennemført in duplo. Absorbansen blev målt for hver brønd ved en bølgelængde på 450 nm.

sårheling assay

Til sårheling analysen, de menneskelige gastrisk cancer cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901 ( 1 × 10 ^{5 celler /35 × 11 mm skåle) blev podet og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C og derefter transficeret med rekombinante plasmider. Efter at have opnået sammenflydning, blev det cellulære lag i hver plade ridset under anvendelse af en plast pipettespids. Migreringen af ​​cellerne ved kanten af ​​bunden blev analyseret ved 0, 24 og 48 timer, blev billederne opfanges og analyseres ved Leica fluorescensmikroskop og matches billedanalysesoftware (Comet assay IV billedanalysesystem, PI, UK).}

Rutinemæssig Tumor Maker Detection

Kliniske og biokemiske data fra patienter er opsummeret i tabel 1. Rutinemæssige biokemiske tests blev målt ved anvendelse af standardmetoder og matches reagenser (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan) . tumormarkør niveauer, herunder kulhydrat antigen 19-9 (CA19-9), Karcinogenicitet-embryonale antigen (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 og CA724, blev bestemt på et Roche E170 modulopbygget med matchede reagenser.

Statistisk analyse

Alle kvantitative variabler blev udtrykt som middel ± standardafvigelser medmindre andet er angivet. kvantitative variable blev sammenlignet med Student t test, analyser af variansanalyse (ANOVA), eller parametriske tests Pearson korrelationskoefficienter. (Spearman korrelationskoefficienter blev beregnet for ordenstal kategoriske variabler) og disses sandsynlighed ( s
) blev anvendt til at evaluere korrelationer mellem parametre. Alle indberettede p
værdier var 2-tailed, og s
værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistiske analyser blev udført med SPSS 16,0 til Windows statistisk software (SPSS Inc.).

Resultater

Forskellige serum N-Glycan profilering mønstre i mavekræft, mavesår og raske kontroller

Brug DSA-FACE, vi undersøgte N-glycan profiler i desialyleret sera fra patienter med mavekræft (n = 80), mavesår (n = 25), og alder matchede raske individer (n = 139). Vi kvantificeres og statistisk sammenligning disse toppe blandt 3 forskellige grupper. Mindst 9 N-glycanstrukturer (toppe) blev identificeret i alle prøver (figur 1A). Den strukturelle analyse af disse N-glycaner er tidligere publiceret af Callewaert [11]. Den gennemsnitlige relative forekomst af disse N-glycanstrukturer blev beskrevet i tabel 2. Den overflod af strukturer i toppene 2, 3, 5, 6, 7, 8 og 9 afslørede statistisk signifikante forskelle mellem gastrisk cancer, mavesår og sund kontrol grupper, hvilket indikerer, at forskellige N-glycan mønstre dukkede op i forskellige patofysiologiske tilstande. Sammenlignet med den raske kontrolgruppe, peak5 (bigalacto biantennær glycan, NA2) og peak9 (forgrening α-1,3-fucosylerede triantennære glycan, NA3Fb) var forhøjet (P < 0,001) (figur 1B); hvorimod kerne- fucosylerede toppe, såsom peak2 (agalacto kerne-α-1,6-fucosylerede halverer biantennær glycan, NGA2FB), peak3 (single agalacto core-α-1,6-fucosylerede biantennær glycan, NG1A2F), peak6 (bigalacto kerne -α-1,6-fucosylerede biantennær glycan, NA2F) og peak7 (bigalacto core-α-1,6-fucosylerede halverer biantennær glycan blev NA2FB) faldt i gastrisk cancer (P < 0,001). Tilsvarende overflod af kerne-fucosylerede struktur glycaner navngivne sumfuc (angiver total core-fucosylerede strukturer, herunder top 1, 2, 3, 4, 6, og 7) blev reduceret betydeligt i gastrisk cancer (P < 0,001) (figur 1C ). Den mavekræft gruppen blev yderligere inddeles i 4 undergrupper efter TNM Iscenesættelse af UICC for mavekræft. Strukturen overflod og sumfuc ikke ændre betydeligt blandt de 4 forskellige undergrupper; dog sumfuc blev gradvist reduceret med progression stadier af mavekræft (tabel 3).

Sammenhæng mellem N-glycaner og rutinemæssige tumormarkører

Til dato CEA bruges stadig i vid udstrækning til screeningen og overvågning af gastrisk cancer. Vi analyserede sammenhænge mellem de enkelte N-glycan markør med CA19-9, CEA, CK19, CA125 og CA724. Den Pearson korrelation analyse viste, at CEA var forbundet positivt med peak1 (r = 0,19; P < 0,01), og peak9 (r = 0,28; P < 0,01), hvorimod negativt med peak6 (r = -0,18; P < 0,01) og peak8 (r = -0,23; P < 0,01). (tabel 4)

Sammenligning af sumfuc mellem gastrisk kræft og andre fordøjelsessystemet kræftformer

Tidligere har vi studeret N-Glycan profilering af hepatocellulært carcinom (HCC) [19] og kolorektal cancer (CRC) [20]. Den overflod af sumfuc afslørede statistisk signifikante forskelle mellem mavekræft (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) og sund kontrol (47,67 ± 5,08) grupper (P < 0.001, tabel 5), hvilket indikerer at forskellige niveauer af kerne-fucosylering dukkede op i kræft med forskellige væv oprindelse. Blandt de 4 grupper, niveauet af kerne-fucosylering i HCC var det højeste, mens fucosylering niveau mavekræft var det laveste, og var endnu lavere end i raske kontrol.

N-glycan profilering mønstre i gastrisk tumor og ikke-tumorvæv

N-glycan profiler blev undersøgt i desialyleret protein fra gastrisk tumor og ikke-tumorvæv. De tre mest forekommende bigalacto biantennær glycaner viste i serum, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) og preak7 (NA2FB) blev også identificeret i væv proteiner (figur 2A). Peak6 og Peak7 blev bekræftet at være kerne-fucosylerede strukturer dervied fra peak5 efter behandlet med kerne-α-1, 6-fucosidase fordøjelse (figur 2A). Højderne af disse tre toppe blev analyseret ved anvendelse GeneMapper software. Forholdet mellem peak6 til peak5 var lavere i tumorvæv end i tilstødende ikke-tumorvæv (0,83 ± 0,18 vs. 1,05 ± 0,42, figur 2B), såvel som forholdet mellem peak7 til peak5 (0,13 ± 0,06 vs. 0,16 ± 0,04, figur 2C). Men der var ingen statistisk signifikante forskelle (P > 0,05). Mellem tumor og ikke-tumorvæv

Nedsat niveauer af total kerne fucosylering identificeret i både sera og væv fra mavekræft

Siden LCA specifikt kan genkende glycoproteiner med α-1,6-fucosylerede-bundet N-acetyl-D-glucosamin-asparagin (GlcNAc-Asp) i trimannosyl- kerne, undersøgte vi den samlede kerne fucosylerede proteiner fra sera og væv i gastrisk cancer under anvendelse LCA at validere konstateringen i DSA-FACE. I serum, niveauet af LCA-bindende kerne fucoserester var lavere i gastrisk cancer end i mavesår og raske kontroller (figur 3A). Total kernefucose overflod også trended at være lavere i gastriske tumorer sammenlignet med den i parrede tilstødende væv (figur 3B). For at bestemme om ændringen af ​​den samlede kerne fucosylering i gastrisk tumor væv er relevant for ændring af glycosylering biosyntesevejen, blev kvantitativ RT-PCR anvendes til at analysere den overflod af pattedyr Fut8 og BNP-Tr i gastriske tumorer og tilstødende væv. Resultaterne viste, at ingen signifikant forskel på Fut8 og BNP-Tr-mRNA-ekspression blev observeret mellem tumorer og tilstødende væv (figur 3C og 3D). Den relative forekomst af Fut8 protein blev illustreret ved anvendelse af western blot (rå data blev vist i fig S1). Den Fut8 i tilstødende væv var signifikant højere end i tumorvæv (P < 0,05) (figur 3E). Immunhistokemi viste, at Fut8 stærkt positivt blev udtrykt ved de luminale grænser ikke-tumor gastriske celler (figur 4B), men det svagt positivt udtrykt i tumorceller (figur 4A). Ekspressionen af ​​LCA-bindende kerne-fucosylerede glycoproteiner var højere hos ikke-tumor gastriske celler end i tumorceller (figur 4C, 4D). Så blev identificeret, niveauet for den samlede kerne fucosylering faldt i både sera og væv fra mavekræft.

Effekt af Fut8 og BNP-Tr på proliferation og migration i humane gastrisk cancer cellelinjer

humane gastrisk cancer cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901 blev anvendt in vitro-undersøgelse. Siden BGC-823 udtrykte lavere BNP-Tr mens SGC-7901 udtrykte lavere Fut8 i vores pilot forskning, blev pEGFP-N1-BNP-Tr transficeret i BGC-823 til overekspression BNP-Tr og pEGFP-N1- Fut8 var transficeret ind SGC-7901 til overekspression Fut8. Rekombinante udtryk lykkedes opnået vist ved reportergen GFP-ekspression (figur S2). For at undersøge mulig inddragelse af BNP-Tr og Fut8 i tumor spredning og migration, blev BGC-823 og SGC-7901 celler undersøgt efter transfektion hjælp CCK-8 og sårheling migration assay hhv. Resultaterne viste, at opregulering af BNP-Tr faldt BGC-823 proliferation på 2-5 dage efter transfektion og opregulering af Fut8 faldt SGC-7901 proliferation efter 2 dage efter transfektion (figur 5A og 5B). Disse resultater viste, at høj ekspression af BNP-Tr og Fut8 kunne undertrykke proliferation af humane gastriske cancerceller. Sårheling assay viste, at BNP-Tr og Fut8 har ingen væsentlig indflydelse på migration i BGC-823 og SGC-7901 ved 48 timer efter behandling (figur 5C og 5D).

Diskussion

Glykosylering er en af ​​de mest almindelige post-translationelle modifikationer dukkede op i ca. 70% af alle kendte proteiner. Ændringer i glycosylering spiller en rolle i en forskelligartet sæt af biologiske fænomener som tumorcellemetastase, intracellulær kommunikation og inflammation [21] - [23]. Flere og flere undersøgelser viser, at ændringer i glycosylering og niveauet for glycosyltransferaser aktiviteter afledt af malign transformation er relevante for humane maligniteter [24] - [25]. DSA-FACE er en enkel og effektiv teknologi til måling af N-glycan ændringer i serum. Vi har tidligere anvendt denne teknologi til at bistå ved diagnosticeringen af ​​HCC og CRC [19] - [20]. I den aktuelle undersøgelse, vi har brugt det til at analysere karakteristisk N-bundet profilering mønster i gastrisk cancer. Resultaterne viste, at der var signifikant forskellige N-Glycan profilering mønstre blandt mavekræft, mavesår og raske kontrolpersoner. Blandt disse forskellige profilering mønstre blev fundet peak9 og sumfuc skal ændres i en modsat mønster i gastrisk cancer sammenlignet med dem i kontrol. Som det fremgår af tidligere forskning, blev peak9 forbundet med udviklingen af ​​sorter af maligne lidelser, vi bekræftede igen, at triantennær N-glycan struktur overflod steget betydeligt i gastrisk kræft og denne ændring var blevet afsløret at være korreleret med CEA, som er en mest almindeligt brugte CRC markør og er en stærkt heterogen glycoprotein, der indeholder 60% kulhydrat [26]. I enkelte N-glycan struktur overflod analyse, vi observeret, at sumfuc faldt betydeligt i mavekræft sammenlignet med kontroller. For yderligere at validere dette fund, vi udførte lektin skamplet i både sera og væv. Ved at bruge HCC serum som en positiv kontrol, observerede vi faldt fucosylering af N-glycaner på totale proteiner i sera fra gastrisk cancer. En lignende tendens blev afsløret i gastrisk tumorvæv. Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere rapporter om CRC [20]. Men resultaterne er i modsætning til tidligere rapporter om kræft med andre væv oprindelse. Stigningerne i fucosylerede oligosaccharider under patologiske betingelser er blevet rapporteret af andre og vores gruppe [19]. Det fucosylerede AFP (AFP-L3) er blevet anvendt som HCC markør i klinisk praksis [25]. De contradictories af kerne-fucosylering niveauer dukkede op i forskellige kræftformer kan skyldes de forskellige roller af forskellige væv spilles, f.eks Leveren er det hovedorgan ansvarlig for at producere glycoproteiner udover immunoglobulin-producerende B-lymfocytter [27] - [28].

fucosylering katalyseres af fucosyltransferaser, guanosin-5'-diphosphat (GDP) -fucose syntetiske enzymer, og BNP-fucose transporter (s). BNP-fucose er en fælles donor substrat til alle fucosyltransferaser. Efter BNP-fucose er blevet syntetiseret i cytosolen, transporteres det til Golgi-apparatet gennem BNP-Tr til at tjene som substrat for fucosyltransferaser [17], [29]. Derfor BNP-Tr er en vigtig faktor for BNP-fucose syntetiseret vej. Fut8 er den eneste fucosyltransferase involveret i kerne-fucosylering [29]. Vi har detekteret faldt Fut8 proteinekspression i tumorvæv, som støttede vores resultater i sera. Imidlertid Fut8 mRNA-ekspression var ingen signifikant forskel i gastriske tumorer og tilstødende væv. Glycosylering er meget reflekterende af ændringer i miljøet af en celle. Epigenetiske ændringer af genomet er stabilt overføres til datterceller uden kravet om genetiske sekvensændringer. [30] For at klarlægge, om den nedsatte kerne fucosylering spiller en vigtig rolle i carcinogenese af gastrisk cancer, udvidede vi undersøgelsen i gastriske cellelinier in vitro. Vi fandt, at opreguleret BNP-Tr og Fut8 ekspression i humane gastriske cancerceller kan føre til lav proliferation. Men vi kunne ikke finde nogen effekt af kerne-fucosylering på celle migration. Disse resultater bidrage til at forklare den potentielle mekanisme hvorfor faldt kerne-fucosylering dukkede op i gastrisk kræft og denne nedreguleret kerne-fucosylering korreleret med nogle ondartede biologisk opførsel af gastriske kræftceller.

I de seneste år, er der flere resultaterne afslører, at ændringer i glycosylering spiller vigtige roller i udviklingen af ​​sygdomme udover leverkræft og autoimmune sygdomme. De betydelige ændringer i glycosyleringen af ​​udskilte glycoproteiner indeholdt en reduktion i kerne fucosylering, øget forgrening og øget sialylering, og ændringer af epigenetiske maskineri har en dybtgående indvirkning på glykanstrukturer genereret af celler under ovariecancer progression [30]. Niveauerne af kerne-fucosylerede biantennær glycaner og α-2,3-forbundne sialinsyrer blev forøget betydeligt i prostatakræft. [31] Der var en stigning på 40% i core fucosylering i de vigtigste sialylerede biantennær glycaner i bugspytkirtelkræft serum, hvilket ville være tegn på en delmængde af tumorassocierede glycoformer [32].

for nylig funktionen af ​​kerne-fucosylering blev rapporteret at være associeret med funktionen af ​​EGFR [33]. Bindingen af ​​EGF til dens receptor kræver kerne fucosylering af N-glycaner af EGFR.

• PLoS Genetics: kønscellelinie Mutationer i MAP3K6 er forbundet med Familiær Gastrisk Cancer
• PLoS ONE: Opdagelsen af ​​tumormarkører for mavekræft ved Proteomics