Финансирование:. Изучение была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81201697, 81101639 и № 81271925); Наука и технологии комиссии муниципалитета Шанхая (№ 10ZR1439100 и № 11JC1416400) .The спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы.: авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй наиболее распространенной причиной рака, связанных смерти во всем мире [1]. - [3], в частности, широко распространены во многих странах Азии, особенно в Китае [4]. Гликозилирование белков является одним из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций, сделанных в белках [5]. Гликаны могут быть присоединены к белкам либо через амидную группу (N-связанное гликозилирование) или гидроксильную группу (O-связанное гликозилирование), которые происходят с помощью различных биосинтетических путей и потенциально имеют независимые функции [6]. N-связанное гликозилирование играет фундаментальную роль во многих биологических процессах, таких как клеточной адгезии, миграции клеток и сигнальной трансдукции [7]. Аномальные экспрессия N-связанных гликопротеидов наблюдается при различных заболеваниях [8] - [10]. При углубленном характеристике N-связанных гликопротеинов и изменений гликозилирования связанных с заболеванием, несколько методик были разработаны. В нашем предыдущем исследовании мы определили некоторые N-гликанов маркеры в heptatocellular карциномы (ГЦК) и рака толстой кишки с помощью электрофореза на основе капиллярного называемой ДНК секвенсор-помощь флуорофором помощь капиллярный электрофорез (АДС-ЛИЦО) [11]. Кроме того, сообщалось, что α-1, 6-фукозилтрансферазной (FUT8) активность и экспрессия увеличивается в некоторых раковых заболеваний человека, что указывает на роль этого фермента в развитии и прогрессии опухоли, такие как ГЦК [12], колоректального рака [ ,,,0],13], немелкоклеточный рак легкого [14] и серозные аденокарциномы яичников [15]. Измененное ядро-фукозилирования является одним из наиболее важных ненормальной гликозилированного модификации, идентифицированного в злокачественных опухолях. FUT8 катализирует перенос фукозы из гуанозиндифосфат (ВВП) -fucose к сокровенной GlcNAc гибридных и сложных N-связанных олигосахаридов с помощью альфа-1,6-связи, в результате чего ядро-фукозилированные гликопротеинов [16] - [17] и изменение биологической функции в результате гликопротеинов [18]. Хотя многие исследования сообщили о связи между измененное ядро-фукозилирования и других агрессивных опухолей, по нашим данным, влияние ядра-фукозилирования на рак желудка остается неизвестным. В данном исследовании мы проанализировали N-гликана профилирование с АДС-слойного в обоих образцах сыворотки от рака желудка, язвенной болезни желудка, здоровых и тканевых белков из опухолей и прилегающих к нему, не являющимися опухолей. Затем расширить функциональные исследования на выявленных конкретных гликозилирование.
Этика Заявление
<р> Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике китайского людских ресурсов на второе Военно-медицинский университет. Все участники исследования дали письменное информированное согласие.
N-Glycan профилирование из тканевых белков и структурного анализа с использованием exoglycosidase переваривание
<р> белки экстрагировали из примерно 25 мг экз замороженной ткани , Образцы ткани были приостановлены и pestled в буфере для лизиса, содержащего ингибиторы протеазы коктейль (Roche Diagnostics, Meylan, Франция). Unlysed части удаляли центрифугированием (12000 г в течение 10 мин при 4 ° С) дважды. Концентрация солюбилизированных белков определяли с помощью набора ВСА (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), и образцы белка хранили при -80 ° С до использования. В общей сложности 40 мкг белков ткани были использованы для создания N-гликанов профилей с использованием регулярных N-Glycan метод профилирования такой же, как, выполняемой в сыворотке, описанной выше. Для того, чтобы идентифицировать ядро-a-1, 6-фукозилированные N-гликанов структуры, соответствующее количество APTS-меченные N-гликанов переваривали как Arthrobacter ureafaciens сиалидазой и коровьих почек α-1, 6-фукозидазой (Prozyme, San Leandro, CA , США). Технология DSA-слойного была использована для анализа продуктов расщепления и программного обеспечения GeneMapper была использована для анализа высоты пиков.
Выделение РНК и количественный ПЦР в реальном времени
Всего РНК экстрагировали из замороженного тканей и клеток, с использованием общего набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя (Axygen Biosciences, Ханчжоу, Китай). Чистоту и концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра (Эппендорф, Hamburg, Germany), а затем хранили при -80 ° С до использования. КДНК синтезировали с использованием ReverTra Ace-α-RT-PCR набора (Toyobo Co., Осака, Япония) в соответствии с инструкциями изготовителя. Праймеры конструировали с использованием программы Primer Express (Applied Biosystems, а последовательности показаны в таблице S1). Количественная ПЦР в реальном времени проводили с использованием SYBR® Green ПЦР в реальном времени Master Mix Kit (Toyobo Co., Осака, Япония) и анализировали на Applied Biosystems 7300 система реального времени ПЦР (ABI, Foster City, CA, USA) , Все анализы проводились независимо друг от друга в трех экземплярах. ПЦР велосипедного состоял из денатурации при 95 ° С в течение 5 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 секунд и при 59 ° C или 55 ° C в течение 15 секунд, и обнаружение в течение 45 секунд при 72 ° C. Относительное количество FUT8 или гуанозиндифосфат (ВВП) -fucose Транспортер (ВВП-Тр) транскриптов в каждом образце нормализовали к гену домоводство -актина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) путем вычитания цикла. Уровни экспрессии генов определяли с использованием метода дельта-дельта Ct. Абсолютные значения экспрессии транскриптов за пределами 40 циклов были рассмотрены ниже детектируемых уровней. Расплав кривые были проверены на каждой реакции, чтобы гарантировать, что один продукт амплифицировали.
Желудочные линии раковых клеток человека, КУП-823 и SGC-7901, были приобретены из Шанхайского института клеточной биологии китайской академии наук и культивировали при 37 ° с в атмосфере 5% сО в RPMI 1640 и DMEM среде <югу> 2 (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), соответственно, с 10% FBS, 1% глутамина и 1% раствор антибиотика.
Строительство ВВП-Тр и FUT8 рекомбинантных плазмид и трансфекции клеток рака желудка Рутинное Опухоль чайник Обнаружение Статистический анализ Различные сыворотки N-Glycan модели профилирование в рак желудка, язвенной болезни желудка и здоровых Соотношение между N-гликанов и рутинных опухолевых маркеров Сравнение sumfuc между раком желудка и других видов рака пищеварительной системы убывала уровни общего ядра фукозилирования, выявленных как в сыворотке крови и ткани от рака желудка
<р> pEGFP-N1-ВВП-Tr и pEGFP-N1 -Fut8, плазмидный вектор, кодирующий человеческий ВВП-Tr или FUT8, был создан путем введения GDP-Tr или FUT8 кДНК в вектор pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), содержащий промотор CMV и ранний промотор SV40, а также ген устойчивости к неомицину /канамицину из Tn5. Вектор магистральная также содержит ориджин репликации SV40 в клетках млекопитающих. Сайт множественного клонирования (MCS), находится рядом с непосредственно раннего промотора ЦМВ. Человеческий ген ВВП-Тг или FUT8 клонировали из мРНК экстрагировали реагентом TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, США) из ткани печени человека путем проведения ОТ-ПЦР с использованием праймеров (Таблица S2), в которых сайты рестрикции в Xho I или KPN I были включены, расщеплением Xho I или Kpn I и лигированием в pEGFP-N1. PEGFP-N1-ВВП-Tr или pEGFP-N1-FUT8 трансфицировали в кишечной палочки для амплификации DH5 &alpha и секвенирования ДНК была использована для обеспечения верности. Плазмидную ДНК получали с использованием Qiagen ДНК Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. Плазмиды трансфицировали в желудочном линий раковых клеток человека, BGC-823 и СГК-7901 на 80% слияния и 5 × 10 5 клеток на лунку в шести-луночного планшета с использованием Липофектамина ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, США ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Трансфектированные клетки, которые экспрессируют ген-мишень, были подтверждены с помощью количественной ОТ-ПЦР.
Пролиферация клеток анализ
<р> анализ на пролиферацию клеток проводили с Cell Counting Kit-8 (ССК-8, Dojin, Япония) в соответствии с инструкциями изготовителя. Рост клеток контролировали каждые 24 часа в течение 5 дней, и за каждый период времени проводили в дубликатах. Измеряли оптическую плотность для каждой лунки при длине волны 450 нм.
заживлении ран анализ
<р> Для заживления ран анализа, человеческие желудка линий раковых клеток, КУП-823 и SGC-7901 ( 1 × 10 5 клеток /35 × 11 мм чашках) высевали и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37 ° с и затем трансфицированы рекомбинантных плазмид. После достижения слияния, клеточный слой в каждой пластине был поцарапан с помощью пластикового наконечника пипетки. Миграция клеток на краю нуля анализировалась на 0, 24 и 48 часов, изображения были захвачены и проанализированы с помощью Leica флуоресцентного микроскопа и подобранное программное обеспечение для анализа изображений (Comet анализа IV изображение системы анализа, ПИ, Великобритания).
<р> Клинические и биохимические данные пациентов приведены в таблице 1. Плановые биохимические тесты были измерены с использованием стандартных методов и совпадающим реагентов (Hitachi 7600 Анализатор (Хитачи, Токио, Япония) . уровни опухолевого маркера, в том числе углеводный антиген 19-9 (CA19-9), carcino-эмбриональный антиген (CEA), Цитокератин 19 (CK19), CA125 и CA724, были определены на модульной Roche E170 с согласованными реагентами.
<р> были выражены Все количественные переменные, как средние значения ± стандартные отклонения, если не указано иное. количественные переменные сравнивались с Стьюдента испытаний, анализ дисперсии (ANOVA), или непараметрических тестов. коэффициенты корреляции Пирсона (Спирмен были рассчитаны коэффициенты корреляции для порядковых категориальные переменные) и связанных с ними вероятностей ( р
) были использованы для оценки корреляции между параметрами. Все приведенные значения р
были 2 хвостами, и значения р
&л; 0,05 считались статистически значимыми. Статистический анализ проводили с SPSS 16.0 для Windows, статистического программного обеспечения (SPSS Inc.).
Результаты
<р> Использование DSA-FACE, мы рассмотрели N-гликанов профили в десиалилированных сывороток от больных раком желудка (n = 80), язвенной болезни желудка (n = 25), и возраст соответствует здоровых лиц (n = 139). Мы количественно и статистически сравнили эти пики среди 3-х различных групп. По крайней мере, 9 N-гликанов структуры (пики) были выявлены во всех образцах (рис 1А). Структурный анализ этих N-гликанов была опубликована ранее Callewaert [11]. Среднее относительное обилие этих N-гликанов структур описана в таблице 2. обилие структур в пиках 2, 3, 5, 6, 7, 8 и 9, показало статистически значимых различий среди рака желудка, язва желудка, и контрольная группа здоровых людей группы, указывая, что различные N-гликанов модели появились в различных патофизиологических условиях. По сравнению с контрольной группой здоровых, peak5 (bigalacto biantennary гликана, Na2) и peak9 (ветвление альфа-1,3-фукозилированные triantennary гликановой, NA3Fb) были повышены (Р &л; 0,001) (Фигура 1В); в то время как пики фукозилированные core-, таких как peak2 (agalacto ядро-альфа-1,6-фукозилированные рассекает biantennary Glycan, NGA2FB), peak3 (единая agalacto ядро-α-1,6-фукозилированные biantennary Glycan, NG1A2F), peak6 (bigalacto ядра -α-1,6-фукозилированные biantennary гликан, NA2F) и peak7 (bigalacto ядро-альфа-1,6-фукозилированные рассекает biantennary Glycan, NA2FB) в желудочном группе рака снизились (Р &л; 0,001). Точно так же, обилие ядро-фукозилированные структуры гликанов названных sumfuc (указывает на общее ядро-фукозилированные структур, в том числе пик 1, 2, 3, 4, 6, и 7) было значительно снижено в раке желудка (Р &л; 0,001) (рис 1C ). Желудочный группа рака была разделены на 4 подгруппы в соответствии с TNM постановкой UICC для рака желудка. Структура и численность sumfuc существенно не изменилась среди 4-х различных подгрупп; Тем не менее, sumfuc была постепенно уменьшалось с прогрессированием стадий рака желудка (таблица 3).
<р> На сегодняшний день СЕА до сих пор широко используется для скрининга и мониторинг рака желудка. Мы проанализировали корреляции между отдельными N-гликанов маркер с CA19-9, CEA, CK19, CA125 и CA724. Анализ корреляции Пирсона показал, что СЕА была связана положительно с peak1 (г = 0,19; P &ЛТ; 0,01), и peak9 (г = 0,28; P &ЛТ; 0,01), в то время как отрицательно с peak6 (г = -0,18; Р &л; 0,01) и peak8 (г = -0,23; р &л; 0,01). (таблица 4)
<р> Ранее мы изучали N-Glycan профилирование гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) [19] и колоректальный рак (CRC) [20]. Обилие sumfuc выявлено статистически значимых различий среди рака желудка (41,32 ± 6,39), НСС (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) и здорового контроля (47,67 ± 5,08) групп (Р &л; 0,001, Таблица 5), что указывает на что разный уровень ядра-фукозилирования появились в раковых заболеваний различного происхождения тканей. Среди 4-х групп, уровень основного-фукозилирования в ГЦК был самым высоким, в то время как уровень фукозилирования при раке желудка был самым низким, и даже ниже, чем у здоровых контроля.
N-Glycan профилирование модели в желудка опухоли и неопухолевой ткани
<р> N-гликанов профили были рассмотрены в десиалилированных белка из желудка опухолевых и неопухолевых тканей. Три наиболее распространенных bigalacto biantennary гликанов показал в сыворотке, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) и preak7 (NA2FB) были выявлены также в тканевых белков (рис 2А). Peak6 и Peak7 были подтверждены как ядро-фукозилированные структуры dervied из peak5 после того, как обработанные колонкового альфа-1, 6-фукозидазой пищеварения (рис 2А). Высоты этих трех пиков были проанализированы с помощью программного обеспечения GeneMapper. Отношение peak6 к peak5 была ниже в опухолевых тканях, чем в соседних тканях неопухолевых (0,83 ± 0,18 против 1,05 ± 0,42, рис 2В), а также отношение к peak7 peak5 (0,13 ± 0,06 против 0,16 ± 0.04, рис 2С). Тем не менее, не было никаких статистически значимых различий (P > 0,05). Между опухолевыми и неопухолевых тканей
<р> Так как LCA могут специфически распознавать гликопротеины с α-1,6-фукозилированные-сшитый N-ацетил-D-глюкозамина-аспарагин (GlcNAc-Asp) в ядре trimannosyl, мы исследовали общее ядро фукозилированные белки из сывороток и тканей при раке желудка с помощью LCA чтобы подтвердить нахождение в DSA-слойного. В сыворотке, уровень LCA-связывающих основных остатков фукозы был ниже при раке желудка, чем в язвенной болезни желудка и здоровой контрольной группы (рис 3, а). Общая численность ядра фукозы также отклонялись быть ниже в опухолях желудка по сравнению с парными в прилегающих тканях (рис 3б). Для того, чтобы определить, имеет ли отношение к изменению гликозилирования пути биосинтеза переделка общего ядра фукозилирования в опухолевой ткани желудка, количественный RT-PCR использовали для анализа численности FUT8 млекопитающих и ВВП-Tr в опухоли желудка и прилегающих тканей. Результаты показали, что не было обнаружено значимой разницы в FUT8 и экспрессии ВВП-Тг мРНК между опухолями и прилегающих тканей (фиг.3С и 3D). Относительное содержание белка FUT8 было показано с помощью вестерн-блот (необработанных данных показано на рисунке S1). FUT8 в окружающих тканях была значительно выше, чем в опухолевых тканях (P &ЛТ; 0,05) (рис 3Е). Иммуногистохимия показала, что FUT8 сильно положительно выражено в полостную границах неопухолевых клетках желудка (рис 4б), однако она слабо положительно выраженное в опухолевых клетках (фиг.4А). Выражение LCA-связывающих ядро-фукозилированные гликопротеинов была выше в неопухолевых клетках желудка, чем в опухолевых клетках (рис 4C, 4D). Таким образом, был определен уровень общего ядра фукозилирования снизился в обоих сывороток и тканей от рака желудка.
Влияние FUT8 и ВВП-Tr на пролиферацию и миграцию в желудочном линиях раковых клеток человека
<р> желудочные линии раковых клеток человека, КУП-823 и SGC-7901 были использованы в пробирке исследования. Так как BGC-823 выразили более низкий уровень ВВП-Tr в то время как SGC-7901 выразил низкий уровень FUT8 в нашем экспериментальном исследовании, pEGFP-N1-ВВП-Tr трансфицировали в BGC-823 для гиперэкспрессией ВВП-TR и pEGFP-N1- FUT8 был трансфицировали в SGC-7901 для гиперэкспрессией FUT8. Рекомбинантные выражения были успешно достигнуты показали репортер ген GFP выражения (рис S2). Для того, чтобы изучить возможную причастность ВВП-Tr и FUT8 пролиферации опухоли и миграции, КУП-823 и SGC-7901 клетки были исследованы после трансфекции с использованием CCK-8 и ранозаживляющие анализа миграции соответственно. Результаты показали, что повышающая регуляция ВВП-Tr снизился КУП-823 пролиферацию через 2-5 дней после трансфекции и повышающей регуляции FUT8 снизилась СГК-7901 пролиферации в 2-х дней после трансфекции (фиг 5А и 5В). Эти результаты показали, что высокая экспрессия ВВП-Tr и FUT8 может подавлять пролиферацию клеток рака желудка человека. Заживление ран анализ показал, что ВВП-Tr и FUT8 не оказывают существенного влияния на миграцию в BGC-823 и SGC-7901 в 48 ч после обработки (рис 5C и 5D). гликозилирование
Обсуждение
<р> является одним из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций появились примерно 70% всех известных белков. Изменения в гликозилирования играют определенную роль в разнообразный набор биологических явлений, таких как клетки метастаза опухоли, внутриклеточной связи и воспаления [21] - [23]. Все больше и больше исследований показывают, что изменения гликозилирования и уровни гликозилтрансферазами деятельности, полученных в результате злокачественной трансформации имеют отношение к злокачественных опухолей человека [24] - [25]. АДС-ЛИЦО является простой и эффективной технологией для измерения N-гликанов изменений в сыворотке крови. Ранее мы использовали эту технологию, чтобы помочь в диагностике ГЦК и КПР [19] - [20]. В настоящем исследовании мы использовали его для анализа характерную N-связанный шаблон профилирующей при раке желудка. Результаты показали, что значительно отличались N-Glycan модели профилирование среди рака желудка, язвенной болезни желудка и здоровых людей. Среди этих различных моделей профилирующих, были найдены peak9 и sumfuc быть изменен в противоположном шаблоне при раке желудка по сравнению с теми, в контрольной группе. Как показали предыдущие исследования, peak9 был связан с развитием разновидностей злокачественных новообразований, мы еще раз подтвердили, что triantennary N-гликанов структура обилие значительно увеличилась при раке желудка, и это изменение было выявлено, что коррелирует с СЕА, который является наиболее часто б CRC маркер и является весьма неоднородны гликопротеин, который содержит 60% углеводов [26]. В индивидуальном N-гликанов анализа структуры численности, мы наблюдали, что sumfuc было значительно снижено при раке желудка по сравнению с контрольной группой. Для дальнейшей проверки этот вывод, мы выполнили лектин-блоттинга как в сыворотке крови и тканях. Используя HCC сыворотку в качестве положительного контроля, мы наблюдали уменьшилось фукозилирование N-гликанов от общего содержания белков в сыворотке крови от рака желудка. Аналогичная тенденция была выявлена в опухолевых тканях желудка. Эти данные согласуются с результатами наших предыдущих докладов о правах ребенка [20]. Однако результаты противоречат предыдущим сообщениям о раковых заболеваний с другими тканевого происхождения. Увеличивается в фукозилированные олигосахаридов при патологических состояниях были сообщены другим людям и нашей группы [19]. Фукозилированные AFP (АФП-L3), был использован в качестве маркера HCC в клинической практике [25]. В contradictories уровней ядра-фукозилирования появились в различных раковых заболеваний может быть связано с различными ролями, которые играют различные ткани, например, Печень является основным органом, ответственным за производство гликопротеинов к тому же иммуноглобулин-продуцирующих В-лимфоцитов [27] - [28].
<р> фукозилирования катализируется фукозилтрансфераз, гуанозин-5'-дифосфат (ВВП) -fucose синтетические ферменты, и ВВП-транспортер фукозы (ов). ВВП-фукозы является общим субстратом донором всех фукозилтрансфераз. После того, как ВВП-фукозы был синтезирован в цитозоле, он транспортируется в аппарат Гольджи через GDP-Tr, чтобы служить в качестве подложки для фукозилтрансфераз [17], [29]. Таким образом, ВВП-Tr является ключевым фактором для ВВП-фукозы синтезировали пути. FUT8 является единственным фукозилтрансферазной вовлечен в ядро-фукозилирования [29]. Мы обнаружили, снижение экспрессии белка FUT8 в опухолевой ткани, которые поддерживали наши выводы в сыворотке крови. Однако экспрессия мРНК FUT8 не было никаких существенных различий в опухоли желудка и прилегающих тканей. Гликозилирование сильно отражает изменения в окружающей среде клетки. Эпигенетические модификации генома стабильно передается дочерним клеткам без необходимости генетических изменений последовательности. [30] Для того, чтобы уточнить, играет ли уменьшенное ядро фукозилирования важную роль в канцерогенезе рака желудка, мы расширили исследование в желудочном клеточных линий в пробирке. Мы обнаружили, что до регулируемого выражение ВВП-Tr и FUT8 в клеток рака желудка человека может привести к низкой пролиферации. Но нам не удалось найти какого-либо влияния ядра-фукозилирования на клеточной миграции. Эти результаты помогают объяснить, почему потенциальный механизм пониженную ядро-фукозилирование появились при раке желудка и это вниз Регулируют ядро-фукозилирования коррелировала с некоторым злокачественным биологическим поведением клеток рака желудка.
<Р> В последние годы, есть несколько результаты выявления, что изменения гликозилирования, играют важную роль в прогрессировании заболеваний, кроме как рак печени и аутоиммунных заболеваний. Существенные изменения в гликозилирования секретируемых гликопротеинов включали сокращение основной фукозилирования, увеличение ветвления и увеличение сиалилирования, а также изменения в эпигенетических механизмов оказывают глубокое воздействие на Гликан структур, генерируемых клетками во время прогрессии рака яичников [30]. Уровни ядро-фукозилированные biantennary гликанах и α-2,3-связанных сиаловых кислот были значительно увеличены при раке простаты. [31] Был рост на 40% в основной фукозилирования в основных сиалилированных biantennary гликанах в поджелудочной сыворотке рака, которая будет свидетельствовать о подмножестве ассоциированных с опухолью гликоформ [32].
<р> в последнее время, было сообщено функция колонкового фукозилирования ассоциироваться с функцией EGFR [33]. Связывание EGF с его рецептором требует ядра фукозилирование N-гликанов из EGFR.